Name: 非放射性 L azidohomoalanine ラベル法による新生タンパク質合成解析用プライマリ マウス肝細胞の分離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-23T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: 学ぶ非放射性L-アジドホモアラニンラベル法を用いたマウス原代肝細胞の分離と新生タンパク質合成解析。肝エネルギー代謝と代謝性疾患の分子メカニズム研究に応用できます。

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科学的な議論には、夫妻 Joonbae Seo とビビアン華をありがとうございます。この作品は、国立衛生研究所 (NIH) (R01DK107530) によって支えられました。濃度は, は、日本科学技術振興機構のさきがけによって支えられました。本研究の一部は、シンシナティの消化器病研究コアセンターの NIH (P30DK078392) からの助成金によって支えられました。

このプロトコルには、実験用マウスの使用が含まれています。動物のケアと実験手順は、シンシナティ子供病院医療センター動物の世話委員会によって承認された手続きに従って行われました。
1. プライマリ マウス肝細胞の分離
<ol><li>前の分離準備<ol>
<li>表 1と 4 ° C (15 mL/マウス) での説明に従って 450 mL の 40% 密度勾配バッファーを準備します。</li>
		<li>表 1に示すようにウィリアムズの媒体の 500 mL を準備し、4 ° C で維持</li>
		<li>表 1に示すように DMEM の 500 mL を準備し、氷 (30 mL/マウス) をします。</li>
		<li>前述の表 1と水浴 (40 mL/マウス) の 42 ° C で維持に HBSS (-) バッファーの 500 mL を準備します。</li>
		<li>風呂の水で 42 ° C で 30 分インキュベーションと表 1に示すようコラゲナーゼ型 X HBSS (+) バッファー 0.3 mg/mL と 500 mL を準備 (40 mL/マウス)。</li>
		<li>気泡なしのソリューションをフラッシュの流れを確認することで、ラッチのフットペダルにわたって静脈内 (ふるさと) 管理チューブを配置することによって灌流ポンプを設定します。</li>
		<li>ウォーム アップ 42 管ヒーター° C</li>
		<li>4 ° C に遠心機を冷却します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>麻酔と血流<ol>
<li>作業領域とポンプをきれい。</li>
		<li>10 分間徹底的に 70% エタノールを実行して、点滴のポンプに接続された管を洗います。</li>
		<li>10 分間完全 DDW と洗浄によって点滴のポンプに接続された管から残留エタノールを削除します。</li>
		<li>はさみと 70% のエタノールで鉗子をふき取ります。</li>
		<li>プラスチック コンテナー メッシュ底と直接の接触を避けるためにメッシュの下に 2 mL イソフルランに浸したガーゼにマウスを配置します。</li>
		<li>ロバ ペダル反射 (しっかりつま先ピンチ) によって麻酔の深さ。</li>
		<li>麻酔の目的の深さに達したときに、マウスを削除します。 注: の麻酔導入時間は 1 分以上をしないでください。</li>
		<li>15 mL コニカル チューブを用いたチューブの端にプッシュ 1 mL イソフルラン浸したパッド鼻の円錐形を作成します。</li>
		<li>近づいたり、マウスの鼻の穴から鼻の円錐形を移動することによって麻酔の深さをコントロールします。</li>
		<li>作業台に腹側を上にマウスを配置します。</li>
		<li>マウスの腹部領域の上の 70% のエタノールをスプレーし、鋭いハサミと歯の鉗子を用いた真皮と腹膜の大きな横切開することによって腹腔内を開きます。</li>
		<li>すべての腹部器官が完全に鋭いハサミと歯の鉗子を使用して露出までは、腹部のレイヤーの垂直方向のカットを行います。</li>
		<li>小さな移動および大腸肝臓、門脈、下大静脈 (IVC) までオートクレーブ綿棒とマウスの左側に向かって明確に公開されます。</li>
		<li>24 G カテーテルに挿入下大静脈右腎静脈の分岐だけで慎重に出血や下大静脈の損傷を避けるために手を振ることがなく。 注: 出血は、下大静脈にカテーテルを挿入している間に発生した場合、門脈内に新しいカテーテルを挿入しようとする必要があります。</li>
		<li>カテーテルの針を削除し、IVC から抜け出すことを避けるためにカニューレの位置を制御、24 G カニューレを灌流チューブ コネクタを使用して接続します。 注: は、空気泡の存在を避けるため、灌流を開始する前に。</li>
		<li>4 mL/min の流速で暖かい HBSS (-) と肝灌流を開始し、すぐにはさみを使って内部の血の流出する脾静脈切断します。 注: 穿刺に成功した場合、肝臓は肝静脈、下大静脈からバッファーの逆流分布により白くため開始されます。門脈、脾臓および腸間膜静脈; の共用体によって形成されます。そのため、以来、それは大きいと肝臓から遠位脾静脈をカットに非常に安全です。</li>
		<li>暖かい HBSS (-) の 35 mL による血液灌流を続けます。 注: 肝臓この段階で淡い色の灌流が不十分な場合、麻酔下でまだ生きているマウスになります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>分解と抽出<ol>
<li>4 mL/min の流速で X 型コラゲナーゼを含む暖かい 35 ml HBSS (+) のマウス肝灌流します。</li>
		<li>数分おきには ~ 10 の鉗子を使用して、脾静脈をクランプ s HBSS (+) 肝臓の解剖学的部分のすべてに拡散して全体のボリュームをできるようにします。 注: 肝臓はバッファーの混雑により脾静脈をクランプ後うねりを開始します。</li>
		<li>X 型コラゲナーゼと 100 mm ペトリ皿灌流プロセスの終わりに準備暖かい HBSS (+) 5 mL を注ぐ。</li>
		<li>肝臓への血液の逆流を防ぐ、鉗子で胆嚢を削除および、血液を取り出すための紙タオルで軽く肝臓を拭いてくださいするポンプを停止する前に体の残りの部分から灌流肝を切った。</li>
		<li>5 mL 準備暖かい HBSS (+) が含まれているペトリ皿に肝臓を転送し、優しくストレート先端の鉗子を用いた肝カプセルを削除します。 注: 肝カプセル肝臓周囲結合組織の薄い層であります。</li>
		<li>実質組織を鉗子を使用して慎重に分散します。15 mL を追加し、シャーレに冷たい DMEM。 注: 媒体が曇り実質細胞による場合に肝臓がよく消化します。</li>
		<li>媒体に残留の実質細胞を解放し、別の 15 mL を加えて軽く引き裂かれた肝臓を振るセルの残りの部分を取得する、ペトリ皿に冷たい DMEM。</li>
		<li>50 mL の円錐管に 100 μ m セル ストレーナーを介して溶存肝 DMEM を転送、氷で保ちます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>浄化<ol>
<li>4 ° C で 2 分間 60 x g で細胞懸濁液を遠心分離機、慎重に真空吸引により上澄みを除去し、10 mL の DMEM にペレットを再懸濁します。</li>
		<li>40% の密度勾配のバッファーの上に薄い層としてペレットの再懸濁を追加し、4 で 800 g xブレーキなし 10 分間遠心° C</li>
		<li>下層ではないが、上層 (DMEM) と中間層 (デッド ・ オア ・非実質細胞) を含む上清を慎重に取り外します (ペレット: 肝実質細胞)。</li>
		<li>2-3 mL ウィリアム中 E の一次電池を再懸濁します、チューブの壁に死んだ細胞の汚染を避けるために新しい 50 mL のチューブに転送。</li>
		<li>7-8 mL ウィリアム媒体 E を追加、優しく、ミックス、4 ° C で 1 分 800 × g で遠心分離</li>
		<li>真空吸引により上清を慎重に取り外し、ウィリアムの媒体 E (ペレットの大きさ) の 10、20、30 mL で再びペレットを再懸濁します。</li>
		<li>自動化された細胞カウンターを使用して、セルをカウントします。</li>
		<li>ウィリアムの媒体 E 種子、インキュベーターで 37 にプレートを保持° C 2-3 h の死んでいるか接続されていないセルを削除する対策と 37 ° C で一晩インキュベート中 with10% FBS DMEM 培地を交換し、</li>
		<li>次の日、プライマリ マウス肝細胞は実験用のため準備ができています。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 化学療法選択的結紮反応アッセイ新生タンパク質合成の検出のため
<ol><li>代謝ラベリング<ol>
<li>(前処理)37 ° C の暖かい PBS で初代肝細胞を 2 回洗浄し、細胞内のメチオニンを破壊する 30 分間メチオニン無料 DMEM 培地を留保を追加します。 注: L-Azidohomoalanine、アミノ酸、メチオニンにアナログ、アジドフェニル部位、細胞内のメチオニンの枯渇、給餌を強化、細胞蛋白質の生合成中に蛋白質に組み込むことが、定款が含まれています培養肝細胞の新生タンパク質に L Azidohomoalanine。</li>
		<li>(治療)37 ° C と洗浄初代肝細胞は PBS を 2 倍暖かいし、25 μ M AHA (L Azidohomoalanine) 4-6 時間とメチオニン無料 DMEM 培地を追加します。</li>
		<li>新生バイオマーカ発現量に及ぼす影響を調査するために 4-6 時間のための媒体の AHA の存在下での任意の特定化学物質 (すなわち10 μ M ロテノン) を追加します。</li>
		<li>インキュベーション後、真空吸引によりメディアを取り出して、3 回コールド PBS で初代肝細胞を洗浄します。</li>
		<li>プレートに 200 μ L 換散バッファーを追加し氷の上の 15-30 分間インキュベートし、プレートを傾けるし、1.7 mL チューブにライセート セル全体を取る。 注: セルの収穫時にその細胞ライセートは非常に粘着性を守らなければなりません。</li>
		<li>5 氷の上細胞ライセートを超音波照射 3 回タンパク質を可溶化し、DNA を分散するプローブの超音波発生装置を使用して s います。</li>
		<li>渦セル 5 分ライセート 21,130 x g 4 oC で 10 分間にて、細胞を遠心し、新しい管に明確な上澄みを転送します。2 回タンパク質濃度を測定します。 注: この段階では、蛋白質のサンプル格納できます-20 ° C で 2 週間のすぐに使用しない場合。</li>
	</ol>
</li>
	<li>アジ化変更新生タンパク質をラベル付け<ol>
<li>コンポーネント (A) を (B) 60 μ L の追加によってコンポーネント (A + B) を準備します。 注: ソリューションは、(A) を (B) コンポーネントを追加した後の色で鮮やかなピンク色になります。</li>
		<li>バッファー (D) および (E) によると準備するプロトコル。</li>
		<li>20-40 μ g 細胞ライセートを取るし、50 μ L 2 x 反応バッファーを追加 (コンポーネント A + B)、DDW と 5 の渦を追加して 80 μ L にボリュームを調整する s。</li>
		<li>5 μ L を追加 CuSO4 (コンポーネント C)、および 5 の渦 s。</li>
		<li>追加は 5 μ L 反応バッファー添加剤 1 (作りたてコンポーネント D)、5 s の渦、3 分待ちます。</li>
		<li>10 μ L の再構成反応バッファー添加物 2 (コンポーネント E) 5 s、渦と多回転機を使用しての 4 ° C で 20 分の回転のサンプルを追加します。 注: ソリューション コンポーネント (E) を追加した後に明るいオレンジ色になります。サンプルは、回転中に光から保護する必要があります。</li>
		<li>300 μ L メタノールと 5 の渦を追加 s、75 μ L のクロロホルムと 5 の渦を追加 s、200 μ L DDW および 5 の渦を追加 s。</li>
		<li>遠心分離機の g x 21,130 と 4 でサンプル° C、5 分間は、水溶液上澄みを廃棄し、ペレットを維持します。</li>
		<li>チューブ、渦、21,130 x g.で 5 分間のために再度スピン 250 μ L メタノールを追加します。
</li>
		<li>室温で 15 分間空気乾燥ペレットの上澄みを廃棄し、糸くずの組織サンプルをカバーでき</li>
	</ol>
</li>
	<li>ページの解析および西部にしみが付くこと<ol>
<li>20 μ L の 10 分のヒート ブロックを使用して、バッファーなしβ-メルカプトエタノール、10 分の渦、70 ° C で熱を読み込みでペレットを可溶化します。10 %sds ゲル (1.5 mm) Tetramethylrhodamine (耽羅) 検出のためにサンプルをロードします。</li>
		<li>可変モード レーザー スキャナーを用いた新生タンパク質の精密定量 AHA 信号を検出します。</li>
		<li>DDW でゲルを 15 分間洗ってください。</li>
		<li>次に、コントロールとして総蛋白を検出する 15-60 分間高速で機密性の高い coomassie 色素試薬と 10 %sds ゲルを染色します。</li>
		<li>デ 1-2 h の DDW でゲルを染色し、UV 蛍光イメージャを使用してイメージを取得します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

作者を示す彼らは利害の対立があります。

これらの細胞が一般に重要かつ基本的な不足がいくつか不死化肝細胞を提案し、肝機能49,50,51,52を調査するために使用すると、アルブミン (図 3) の式など、通常の肝細胞の機能。広く認識されて、したがって、初代肝細胞を利用したが肝臓の生理学および培養とこれらの細胞の維持の課題にもかかわらず、文化における代謝を調べるための貴重なオプションであります。ここで、我々 の研究は比較的便利で効率的な方法で二段階コラゲナーゼ法を行うことによりプライマリ マウス肝細胞の分離を成功させるを詳しく説明します。この手順を文化の中で分離肝細胞の大半は代謝機能と形態安定性を保持し、タンパク質を含む肝機能を調査するため使用することができます代謝、糖新生、・ ミトコンドリアの呼吸。
分離肝細胞...

タンパク質は重要な栄養素と人体の乾燥重量の約 50% はいくつかの生物学的特性と機能1のあるタンパク質から成る。したがって、タンパク質合成はほとんどエネルギーがかかるイベントの一つ、タンパク質の代謝変化は高代謝性疾患2,3、4を含む病気の開発に関連付けられています。肝臓で蛋白質の生合成は、総エネルギー消費量5,6の約 20-30% を占めています。また、タンパク質の機能としてだけでなく、パッシブまたは建物のブロックもアクティブな信号を仲介する因子は、肝臓の細胞内や細胞外7全身の代謝を調節します。合成され、肝臓とプラズマ8の最も豊富な蛋白質によって分泌される血清アルブミンの減らされたレベルが 2 型糖尿病の開発9,10,のリスクを増加させる例えば、11、血清アルブミンの濃度が高く、メタボリック シンドローム12を開発することに対して保護一方。邪魔やリポタンパク質を来すと LRP1 を含む、コレステロール恒常性を調節する、分泌または膜区切のラット肝タンパク質の混乱がさらに、インスリン抵抗性、高脂血症、動脈硬化症の発展につながることができます。13したがって、蛋白質代謝障害肝臓とその関連付けられた代謝性合併症に関与している分子病態生理学的メカニズムの同定は、薬理学的小説を発見するため役に立つかもしれない。発症を遅らせるか、またはインスリン抵抗性、糖尿病、非アルコール性脂肪肝など代謝性疾患の治療へのアプローチします。
タンパク質の合成は、細胞のエネルギー状態に密接に結びついた (例えば、蛋白質合成の伸長段階 1 つのペプチド結合の形成が必要 4 リン酸ジエステル結合14) 感知の分子経路によって調節されていると間や細胞内栄養アベイラビリティ15,16。AMP 活性化プロテインキナーゼ (AMPK) は、17エネルギー恒常性を維持する細胞内のエネルギー センサーの 1 つです。AMPK がアクティブになったときに細胞のエネルギー レベルが低下 AMPK やその対象となる基板に異化経路を刺激し、タンパク質合成18,19を含む同化の過程を阻害する機能します。タンパク質合成の調節は、複数の翻訳因子とリボソームタンパク質20のリン酸化によって媒介されます。ノートの哺乳類ラパマイシン標的複雑な 1 (mTORC1)、タンパク質合成の主要なドライバーは、AMPK の21の主要なターゲットの 1 つです。MTORC1 経路の活性化は、刺激的なタンパク質翻訳とオートファジー20,21により細胞の成長と増殖を強化します。したがって、AMPK の活性化が22mTORC1 を介したタンパク質合成を抑制することが論理です。確かに、AMPK の活性化を打ち消すし、直接その不活性化23と24タンパク質生合成の抑制につながるスレオニン残基 2446 (Thr2446) で mTORC1 を廃止します。また、AMPK 直接抑制することがないリン酸化と結節性硬化症複合 2 (TSC2)25 mTORC1 シグナル伝達カスケードの上流の調節因子である活性化による mTORC1 機能。要するに、肝臓でこれらの経路の制御不全は、しばしば代謝性疾患の開発にリンクされて、従ってエネルギーの制御にこれらの細道の役割を調査するため効果的な実験ツールを確立する重要な必要性があると肝細胞の蛋白質新陳代謝。
分離肝細胞の機能特性と体内肝細胞より体外肝由来細胞ライン26,27,28との強い類似性があります。それが示されているプライマリひと肝細胞が肝生検の 77% の類似を共有する HepG2 細胞を分化肝がん細胞と肝機能を調べるための広くのコンテキストで 48% 未満を表示するのに対し遺伝子発現プロファイル、29をです。したがって、肝機能と生理学の調査に重要です不死化細胞ではなく、初代肝細胞の利用、分離肝細胞の培養に使用可能ないくつかのプロトコル30,31をラットから特に。ラット肝細胞は細胞の比較的高い収率で役に立つ、マウス肝細胞は遺伝的変調マウスで広く利用できるため多くの科学的な面で大きな可能性を持ってください。ただし、健康と豊富な肝細胞および分子に基づく評価のマウスからの分離にはいくつかの技術的な課題があります: まず、バッファー試薬と肝臓を灌流してカニューレ挿入は非常に扱いにくい小さくて細いマウス門脈または下大静脈; のため第二に、分離の過程で細胞の長い操作時間を引き起こす可能性が減少細胞の量と質。第三に、非酵素的機械的分離法は、厳しい損傷で起因し、実行可能な分離肝細胞32,33の低収量を生成できます。1980 年代、コラゲナーゼ灌流法は動物の34の肝臓から肝細胞を分離するため導入されました。この手法はコラゲナーゼ灌流肝35,36,の37、カルシウム キレート剤ソリューション38,39, 酵素消化肝臓の注入と肝実質35の機械的解離。最初のステップで [Ca2 +] キレート (エチレンジアミン四酢酸、EDTA) を含むカルシウム [Ca2 +] 空きバッファーをマウス肝臓は灌流します。2 番目の手順では、マウスの肝臓は細胞-細胞外マトリックスの相互作用を分解するコラゲナーゼを含むバッファーと灌流します。ステップ 1 で使用するバッファーとは異なり [Ca2 +] 2 番目のステップのバッファーでイオンの存在はその後消化肝臓はさらにゆっくりと機械的に分離する間鉗子を使用して、効果的なコラゲナーゼに必要な肝カプセルと柔組織。最後に、結合組織はフィルタ リングによって削除され、その後遠心分離両方非実質細胞から実行可能な肝細胞と肝細胞以外の生物密度勾配バッファー40,41 を使って、42。本研究ではタンパク質合成の分析のためのマウスの肝臓から肝細胞を分離する変更された 2 段階コラゲナーゼ灌流法を紹介します。
蛋白質のカイネティックス、広く発現レベル、離職率を定量化し、蛋白質43高感度放射能44の検出のための生物の分布を決定する使用されます。ただし、放射性同位元素の使用には、高精度制御研究の状況と手順45が必要です。非放射性方法は開発されているし、ますます人気を集めています。Tetramethylrhodamine (耽羅) タンパク質検出法と化学療法選択の ligation の反作用はそれらの 1 つ、アジドとアルキン グループ46、よう携帯電話のイベントを分析する利用できる間化学療法選択的反応に基づいています新生タンパク質の合成とサブクラス、アジド基で修飾糖タンパク質の検出します。新生タンパク質合成の L Azidohomoalanine (L AHA、アジ化修飾アミノ酸) 代謝蛋白質に組み込まれて、耽羅タンパク質検出法47を使用して検出します。プライマリ マウス肝細胞のこの試金を使用して、我々 はミトコンドリアから ATP の可用性に新生タンパク質合成速度がしっかりとリンクされている表示と AMPK 活性化 (図 1)。
要約すると、プライマリ マウス肝細胞の使用率はタンパク質とエネルギー代謝を調査することが重要と新生タンパク質合成の定量化は開発に関連する経路の生理学的役割についての洞察を得るため貴重であると肝疾患の治療。

<table><tbody><tr><td>HEPESバッファー</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>D-グルコース</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>D16-500</td><td></td></tr><tr><td>エチレングリコール-ビス(&β;-アミノエチルエーテル)-四酢酸</td><td>AmericanBio</td><td>AB00505-00025</td><td></td></tr><tr><td>抗生物質-抗真菌剤 (100x)</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (10x) カルシウム、マグネシウム、フェノールレッドなし</td><td>Gibco</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム二水和物 (CaCl2.2H2O)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>密度勾配緩衝液</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-02</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) 低グルコース、ピルビン酸</td><td>Gibco</td><td>11885-084</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Hyclone</td><td>SH30910.03</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) (1x)</td><td>Gibco</td><td>1897141</td><td></td></tr><tr><td>Williams medium E, no glutamine</td><td>Gibco</td><td>12551-032</td><td></td></tr><tr><td>L-alanyl-L-glutamine dipeptide supplement</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼX型</td><td>和光純薬工業</td><td>039-17864</td><td></td></tr><tr><td>灌流ポンプ</td><td>Cole-Parmer</td><td>Masterflex L/S</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>IV Administration Set</td><td>EXELINT</td><td>29081</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>A ウォーターバス</td><td>REVSCI</td><td>RS-PB-200</td><td>機器</td></tr><tr><td>チューブヒーター</td><td>Fisher Scientific</td><td>Isotemp</td><td>機器</td></tr><tr><td>エタノール</td><td>Decon Lab, Inc</td><td>0-39613</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>PHOENIX</td><td>10250</td><td></td></tr><tr><td>オートクレーブコットンチップ</td><td>フィッシャーブランド</td><td>23-400-124</td><td></td></tr><tr><td>100 mmペトリ皿</td><td>TPP</td><td>93100</td><td></td></tr><tr><td>コネクタ(オスルアーロックリング)</td><td>コールパーマー機器</td><td>EW-4551807</td><td></td></tr><tr><td>24 Gカテーテルテル</td><td>モ</td><td>サーフロー24Gx3 / 4'100</td><td></td></tr> <tr><td>&mu;m フィルター (セルストレーナー)</td> <td>VWR</td><td>10199-658</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 円錐底遠心分離管</td><td>VWR</td><td>89039-666</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 円錐底遠心分離管</td><td>VWR</td><td>89039-658</td><td></td></tr><tr><td>化学選択的ライゲーション反応 タンパク質分析検出キット、タムラ アルキン</td><td>Invitrogen</td><td>C33370</td><td></td></tr><tr><td>AHA (L-アジドホモアラニン)</td><td>Invitrogen</td><td>C10102</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (メチオニンフリー)</td><td>Gibco</td><td>21013024</td><td></td></tr><tr><td>L-シスチン二塩酸塩</td><td>SIGMA</td><td>C2526</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli サンプルバッファー</td><td>BioRad</td><td>161-0737</td><td></td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤カクテル</td><td>SIGMA</td><td>P9599</td><td></td></tr><tr><td>SDS solution (20%)</td><td>BioRad</td><td>161-0418</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCL (1M)</td><td>米国バイオアナリシス</td><td>AB14044-01000</td><td></td></tr><tr><td>ホスファターゼ阻害剤カクテル</td><td>SIGMA</td><td>P5726</td><td></td></tr><tr><td>タンパク質濃度測定キット (Bovin Serum Albumin-BSA)</td><td>BioRad</td><td>500-0207</td><td></td></tr><tr><td>6ウェル組織培養プレート</td><td>TPP</td><td>92006</td><td></td></tr><tr><td>デジタルヒートブロック</td><td>VWR</td><td>12621-092</td><td>機器</td></tr><tr><td>マルチローテーター</td><td>グラントバイオ</td><td>PTR-60</td><td>機器</td></tr><tr><td>超音波処理装置</td><td>コール・パーマー</td><td>GE130PB</td><td>機器</td></tr><tr><td>標準 ヘビーデューティ ボルテックスミキサー</td><td>VWR</td><td>97043-566</td><td>機器</td></tr><tr><td>可変モードレーザースキャナー</td><td>GE ヘルスケア ライフサイエンス</td><td>FLA 9500</td><td>機器</td></tr><tr><td>クーマシー染料試薬</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>24594</td><td></td></tr><tr><td>倒立顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>CKX53</td><td></td></tr><tr><td>装置 ウェスタンブロッティング装置</td><td>BioRad</td><td>1658004</td><td>装置</td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td>装置</td></tr><tr><td>自動セルカウンター</td><td>BioRad</td><td>TC20</td><td>装置</td></tr><tr><td>FluorChem R system</td><td>proteinsimple-Equipment</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>p-Ampka (T172) 抗体</td><td>細胞シグナル</td><td>2535</td><td></td></tr><tr><td>Total-AMPK抗体</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>5832</td><td></td></tr><tr><td>アルブミン抗体</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>4929</td><td></td></tr><tr><td>ベータアクチン抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-130656</td><td></td></tr><tr><td>細かいはさみと鉗子</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

非放射性 l azidohomoalanine ラベル法による新生タンパク質合成解析用プライマリ マウス肝細胞の分離

Isolation of Primary Mouse Hepatocytes for Nascent Protein Synthesis Analysis by Non-radioactive L-azidohomoalanine Labeling Method

肝細胞は肝実質細胞で、全身のエネルギー代謝に不可欠なタンパク質の合成・分泌を含む複数の代謝機能に従事します。マウスの肝臓から分離した初代肝細胞は、機能性や肝臓で発生する変更を理解する貴重な生物学的ツールを構成します。ここ我々 二段コラゲナーゼ灌流法を実行することによって分離およびプライマリ マウス肝細胞の培養方法を説明し、蛋白代謝を調査するために利用します。成体マウスの肝臓は順番にエチレング リコール ビス四酢酸 (グリコールエーテルジアミン四酢酸)、コラゲナーゼ、密度勾配バッファーと肝細胞の分離に続いてにおいて灌流します。これらの分離肝細胞は培養皿で実行可能な肝細胞の寄附の特性の大半を維持します。これらの肝細胞は、非放射性試薬の新生タンパク質合成を含むタンパク質代謝の評価に使用できます。示す分離肝細胞が容易に制御 Tetramethylrhodamine (耽羅) 蛋白質と化学療法選択の ligation の反作用を利用してエネルギー代謝に関与する蛋白合成の高い質と量の安定性を構成します。検出法および西部のしみが付く分析。したがって、この方法はエネルギー恒常性に関与する肝初期蛋白合成を調査するためです。次のプロトコルは、材料と質の高いプライマリ マウス肝細胞の分離と新生タンパク質合成の検出方法について説明します。

プライマリ マウス肝細胞の分離の結果約 20 x 106合計セル/マウスの収率で。組織学的に、ライブと接続された初代肝細胞多角形または典型的な六角形で明確に説明膜境界後 24 時間培養 (図 2)。
単離細胞が肝細胞であるかどうかを確認、プライマリ マウス単離肝細胞 (PMHs)、マウス萌芽期の繊維芽細胞 (MEFs)、マウス肝腫瘍細胞株 (Hepa 1-6)、およびマウス肝臓におけるアルブミン蛋白質の表現のレベルを比較しました。アルブミン蛋白質の表現はプライマリ マウス肝細胞およびマウス肝臓で検出されましたが、MEFs または hepa フィルターで検出不可能であった 1 6 細胞 (図 3)。
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="...

ここでは、健康で機能的なプライマリ マウス肝細胞の隔離のためのプロトコルを提案する.非放射性標識基板による肝新生タンパク質合成の検出については、肝臓でのエネルギー代謝の恒常性のコンテキストでのタンパク質合成の基になるメカニズムを理解するために提供されました。

非放射性 L azidohomoalanine ラベル法による新生タンパク質合成解析用プライマリ マウス肝細胞の分離

Hepatocytes are parenchymal cells of the liver and engage multiple metabolic functions, including synthesis and secretion of proteins essential for ...

この方法は、肥満、非アルコール性脂肪肝、および2型糖尿病における肝エネルギーおよびタンパク質生合成の分子変化に関する様々な代謝疾患研究分野における重要な質問に答える助けとなる。この技術の主な利点は、非放射性標識基質を介して機能的な一次マウス肝細胞および検出肝新生タンパク質の単離を容易にすることである。この方法の視覚的なデモンストレーションは、灌流ステップが小さく、細いマウス血管のために学ぶのが難しいので重要です。肝臓灌流の場合は、右腎静脈との分岐で、24ゲージカテーテルを下の静脈カバまたはIVCに慎重に挿入します。カテーテル針を取り外し、IVC内でカニューレの位置を維持し、コネクタを使用して24ゲージカニューレを灌流管に接続します。4ミリリットルの永久流量で肝臓を温かいHBSSマイナスで穿ファジングし始めると、脾臓静脈を切断して内部血液を排出します。10分後、マウス肝臓に35ミリリットルのHBSSとコラゲラーゼタイプXを1分間に4ミリリットルの流量で補い、脾静脈を数分ごとに約10秒間クランプして肝臓全体の浸透液の分布を促進する。すべてのコラゲラーゼが浸透したら、肝臓に血液の逆流を避けるためにポンプを停止する前に、ラボ組織に肝臓を移します。鉗子を使用して胆嚢を取り除き、新鮮なラボ組織で肝臓を静かに拭いて血液を取り除きます。5ミリリットルの新鮮な暖かいHBSSとコラゲターゼを補充した100ミリメートルのペトリ皿に肝臓を入れ、迷子の鉗子を使って肝臓カプセルを穏やかに取り除きます。鉗子を使用して慎重にパレンキマル組織を分散させ、ペトリ皿に15ミリリットルの冷たいDMEMを加えます。引き裂かれた肝臓を穏やかに振って残留の小形細胞を培地に放出し、さらに15ミリリットルの冷たいDMEMを皿に加えて残りの細胞を獲得する。その後、100ミクロンの細胞ストレーナーを通して、氷の上の50ミリリットルの円錐管に組織スラリーをろ過します。一次マウス肝細胞を単離するには、遠心分離によって細胞を収集し、新鮮なDMEMの10ミリリットルでペレットを再懸濁します。密度勾配分離のために40%密度の勾配バッファーに細胞を慎重に重ね、遠心分離後に上層と中央層から細胞を廃棄します。一次層状肝細胞ペレットをウィリアムのミディアムEの2~3ミリリットルで再懸濁して、チューブの壁から死んだ細胞を採取することを避け、細胞を新しい50ミリリットルチューブに移します。遠心分離前にウィリアムのE培地の追加7〜8ミリリットルと細胞を混合し、ペレットの大きさに応じて新鮮なウィリアムのミディアムEの10、20、または30ミリリットルでペレットを再中断します。カウント後、摂氏37度で2〜3時間のインキュベーションのために6ウェルプレートの各ウェルに60〜5番目の細胞にシード。インキュベーションの終了時に、10%の胎児の牛血清を添加したDMEMと抗抗抗薬を培地に交換して、死んだ細胞と未結合の細胞を除去し、細胞を一晩インキュベーターに戻します。アジド修飾新規タンパク質標識の場合、2X反応バッファーの50マイクロリットルに20〜40マイクログラムの細胞ライセートを加えます。蒸留脱イオン水で80マイクロリットルの体積を持ち、タンパク質溶液を5秒間ボルテックスします。別の5秒渦のために細胞に硫酸銅の5マイクロリットルを追加し、次に5秒の渦を持つ反応緩衝剤1の5マイクロリットルが続きます。3分間のインキュベーションの後、再構成された反応バッファー添加剤10マイクロリットルを細胞に2つ加えて別の5秒渦を加え、光から保護されたマルチ回転機で4°Cでサンプルを20分間回転させます。回転の終わりに、300マイクロリットルのメタノールをリセートに加え、続いて75マイクロリットルのクロロホルム、200マイクロリットルの二重蒸留水を加える。遠心分離によって標識されたタンパク質を収集し、ペレットに新鮮なメタノールの250マイクロリットルを追加します。ボルテックス後、再びリセートを遠心分離し、室温で15分間、糸くずのない組織で裸ペレットを覆います。PAGE分析のために、乾燥したペレットをβ-メルカプトエタノールおよび渦液なしで20マイクロリットルの負荷バッファーで10分間可溶化する。次に、タンパク質を摂氏70度のヒートブロックで10分間加熱し、テトラメチルロダミン検出用の10%ドデシル硫酸ナトリウムゲルにサンプルをロードします。次に、可変モードのレーザースキャナーを使用して、AHA標識された新生タンパク質を正確に定量します。組織学的には、生きて、そして付着した原発肝細胞は、典型的には、培養の24時間後に明確に輪郭を描いた膜境界を有する形状の多角形または六角形に現れる。単離された細胞が原発性肝細胞であるかどうかを確認するために、本実験では、アルブミンタンパク質発現レベルをマウス胚性線維芽細胞、マウス肝腫細胞株、単離された一次マウス肝細胞、およびマウス肝で比較した。アルブミンタンパク質発現は、マウス肝細胞およびマウス肝の一次マウスで検出されたが、マウス胚性線維芽細胞または肝細胞株細胞のいずれにも検出できなかった。10ミクロモルロテノンを4〜6時間用いた一次肝細胞治療は、生体内で観察されたものと同様の肝AMP活性化プロテインキナーゼT172のリン酸化レベルの増加によって検出された肝AMP活性化プロテインキナーゼの堅牢な誘導を明らかにした。実際、5時間の10マイクロモルロテノン治療は、化学選択的ライゲーション反応アッセイによって示されるように、未処理の肝細胞と比較して、処理された原発肝細胞における新生タンパク質合成に対して深い阻害効果を有した。この手順を試みる間、すべての必要な試薬および媒体を事前に準備することを忘れないでください。この技術は、肝代謝病態生理学の分野の研究者が、単離された原発マウス肝細胞における肥満および2型糖尿病におけるエネルギータンパク質調節の分子メカニズムを探求する道を開いた。

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デノボ脂質生成およびβ脂肪酸酸化は、肝細胞に脂肪肝疾患を含むいくつかの代謝障害に摂動された経路を主要な代謝経路を構成しています。ここでは、マウス初代肝細胞の単離を実証し、β - 脂肪酸の酸化および脂質生成の定量化について説明します。...

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ここでは、脂肪肝のin vivoおよびin vitroモデルを生成し、脂肪性の表現型と関連する生理学的パラメータを分析するための最適化された方法が説明されています。...

の最適化分析<em&gt;インビボ</em&gt;と<em&gt;インビトロ</em&gt;脂肪肝

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精製マウス肝類洞内皮細胞と肝細胞の灌流

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誘導多能性幹細胞由来肝細胞を用いた家族性高コレステロール血症ひと肝臓キメラマウス モデル

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ここで提示するプロトコルは、修飾コラゲ素灌流技術を用いた成体マウス肝臓からのマウス肝細胞の単離のためのプロトコルである。また、3Dコラーゲンサンドイッチ設定における肝細胞の長期培養と、胆道形成および治療に対する応答を研究するための細胞骨格成分の免疫標識についても説明する。...

インビトロにおける胆道カネラ形成における細胞骨格の役割を研究する原発マウス肝細胞の単離と3Dコラーゲンサンドイッチ培養

マウス初代肝細胞単離のための時間と労力の効率的なプロトコルの改善

脂肪酸β酸化は、肝細胞を含む多くの異なる細胞型においてエネルギーを生成する役割を担う必須代謝経路である。ここでは、...

単離したてのマウス肝細胞の懸濁液中の脂肪酸β酸化の測定

ここでは、初代マウス肝臓正弦波内皮細胞(LSEC)単離のためのプロトコールを概説し、実証する。このプロトコールは、肝臓コラゲナーゼ灌流、低速遠心分離による非実質細胞精製、およびCD146磁気ビーズ選択に基づいている。また、フローサイトメトリーと走査型電子顕微鏡を用いて、これらの単離されたLSECの表現型と特性評価も行っています。...

マウス初代肝臓正弦波内皮細胞の単離と特性評価

このプロトコルでは、変異型L274G-メチオニンtRNA合成酵素(MetRS*)を発現するマウス株を使用して、アジドノールロイシン(ANL)による細胞種特異的タンパク質標識を実行する方法と、標識された細胞種特異的タンパク質の単離に必要な手順について説明します。生きたマウスにおける2つの可能なANL投与経路を、(1)飲料水と(2)腹腔内注射によって概説します。...

変異型メチオニンtRNA合成酵素マウス株を用いた複合体組織からの細胞型特異的タンパク質精製・同定

学ぶ非放射性L-アジドホモアラニンラベル法を用いたマウス原代肝細胞の分離と新生タンパク質合成解析。肝エネルギー代謝と代謝性疾患の分子メカニズム研究に応用できます。

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