Name: 異方性高分子人工抗原提示細胞 cd 8 + T 細胞活性化のための加工 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: 学ぶ異方性高分子人工抗原提示細胞の作製法。サイズと形状を独立制御し、CD8+T細胞活性化を促進する生分解性粒子の合成技術を解説。がん免疫療法や感染症治療への応用可能性を示す。

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EBA (DGE-1746891)、KRR (DGE-1232825) サポートの NSF 大学院研究フェローシップ プログラムをありがとうございます。RAM のおかげで国立研究サービス賞を受賞 NIH NCI F31 (F31CA214147) とサポートの大学科学者フェローシップの成果報酬です。著者に感謝 (R01EB016721 と R01CA195503) の NIH、失明ジェームスの防止およびキャロル無料カタリスト賞、研究サポートのためがん免疫療法のビジネスキャリー ブルームバーグ キンメル所。

ここで説明するすべての方法は、制度的動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) ジョンズ ・ ホプキンス大学のによって承認されています。
1. 可変サイズの球形の PLGA 粒子の作製
<ol><li>微粒子の合成のための材料の準備<ol>
<li>W/w ポリビニル アルコール (PVA) の 5% 溶液を準備します。<ol>
<li>磁気攪拌棒三角フラスコに 500 mL の純水 (DI) を追加、500 rpm とモニター温ホット プレート攪拌に温度計付き。蒸発を防ぐためにアルミ箔のフラスコをカバーします。</li>
			<li>水温約 70 ° C に達すると、追加 PVA の 25 g 合計小さなバッチで時間をかけて増やす前に解散する PVA を待っています。</li>
			<li>すべて PVA 溶解 (通常 30-60 分)、かつては、ソリューションのクールで滅菌フィルターをみましょう。将来の使用のための 4 ° C で保存します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>10 %w/w PVA フィルム鋳造ソリューションと 2%/w グリセリンを準備します。<ol>
<li>電磁攪拌棒、三角フラスコに DI 水の 500 mL を追加します。製粉によって室温とミックスでグリセロール 8 mL を追加します。</li>
			<li>温度計付き 500 rpm とモニター温ホット プレート攪拌にフラスコを配置します。蒸発を防ぐためにアルミ箔のフラスコをカバーします。</li>
			<li>溶液温度約 70 ° C に達すると、追加 50 g 合計 PVA の小ロットで、時間をかけて増やす前に解散する PVA を待っています。</li>
			<li>すべて PVA 溶解 (通常 60 分)、一度ソリューション クールで滅菌フィルター孔径 0.22 μ m のボトル上部真空フィルター システムを使用しなさい将来使用するため室温で保管します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>50 mL の 1%/w PVA の水溶液を準備します。100-150 の mL のビーカーに (1.1.1 製) 5 %pva 溶液 10 mL の純水 40 mL を追加します。</li>
		<li>100 mL 0.5%/w PVA の水溶液を準備します。150-250 mL ビーカーに 90 mL ・ ディ ・水と 5 %pva 溶液 10 mL を追加します。</li>
		<li>0.5 %pva の水溶液と化学フード 500 rpm で室温で撹拌プレート上の場所に磁気攪拌棒を追加します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>微粒子の合成<ol>
<li>ポリ (乳酸グリコール酸) 100 mg を量り (PLGA) シンチレーション バイアルにジクロロ メタン (DCM) の 5 mL で溶解。渦、PLGA を溶解します。</li>
		<li>50 mL の 1 %pva 溶液ホモジナイザーに置き、それに触れることがなく、できるだけ、ホモジナイザーがビーカーの底の近くにあります。ホモジナイザーをオンにし、必要な速度に調整-5 μ m 径の粒子、5,000 rpm 15,000 rpm (均質化速度減少粒子サイズを増やす) 1 μ m、3 μ m の 3,200 rpm。一度希望の速度でビーカーに PLGA ソリューションを追加し、1 分間ホモジナイズしてください。</li>
		<li>均質化後、1 を注ぐ %pva、PLGA 微粒子溶液撹拌プレートとフードの化学溶媒の蒸発のために少なくとも 4 時間攪拌 100 mL 0.5 %pva の水溶液にします。</li>
		<li>・ ディ ・水で 3 倍の粒子を洗浄します。<ol>
<li>5 分間、50 mL の円錐管に 3000 × g で遠心分離粒子溶液を注ぐ。上清を注ぐし、DI 水約 20 mL を加えます。</li>
			<li>ボルテックスによって粒子を再懸濁します。一度再停止、DI 水で 50 ml の円錐管を埋めます。</li>
			<li>同じことが 2 回以上何度洗ってください。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>ナノ粒子合成<ol>
<li>シンチレーション バイアルに PLGA の 200 mg を量り、DCM の 5 mL に溶かします。渦、PLGA を溶解します。</li>
		<li>氷を入れた容器に 50 mL の 1 %pva 溶液をビーカーを置きます。触れることがなく、できるだけ底の近くにビーカーに超音波発生装置のプローブを配置します。超音波処理を開始し、すぐにビーカーに PLGA ソリューションを追加します。200 のおおよその直径を持つナノ粒子を生成する 2 分の 12 W の力で超音波 nm。</li>
		<li>超音波処理後、1 を注ぐ %pva、PLGA ナノ粒子溶液 100 mL 0.5% の PVA 溶液撹拌プレートとフードの化学溶媒の蒸発のために少なくとも 4 時間撹拌に。</li>
		<li>50 mL の円錐管に微粒子を取除くために 5 分の 3,000 × g で遠心分離粒子溶液を注ぐ。上清を除去し、高速遠心管に注ぐ。</li>
		<li>3 回の DI 水で粒子を洗浄します。40,000 × g で 15 分間遠心します。上清を注ぐし、ボルテックス ・ ディ ・水で再懸濁します。同じことが 2 回以上何度洗ってください。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 可変形状のポリマー粒子の作製
<ol><li>PLGA 粒子を 3 回洗浄した後は、約 1 mL の純水で粒子を再懸濁します。フィルムの鋳造ソリューションを 2.5 mg/mL 粒子の最終的な粒子濃度の粒子に追加します。</li>
	<li>75 × 50 mm の長方形ペトリ皿ストレッチ一次元または二次元ストレッチ用 100 × 100 mm 角シャーレに 15 mL 因数でに粒子の懸濁液 10 ml のピペットします。いずれかのピペットを用いた気泡または側にプッシュの泡を削除し、膜化学フードで一晩乾燥。</li>
	<li>フィルムが乾燥すると、一度フィルムをプラスチック製の食器からピンセットで削除し、ハサミでフィルムの端が切れます。球状粒子として使用される 50 mL の円錐管にエッジを保存します。<ol>
<li>アルミ ブロックの上にフィルムをマウントすることによってストレッチ装置自動薄膜上にフィルムをロードします。1 D ストレッチ、ネオプレンゴムの 2 枚の間にフィルムの 2 つの短いエッジを配置することによってアルミニウム ブロック担架 (図 2) の 1 つの軸の上にフィルムをマウントします。六角レンチを使用して、場所にフィルムを保持するゴムの上に金属製のグリップをネジします。2 D ストレッチの両方の軸 (図 2) を伸ばすための 4 つのアルミ ブロックにすべての 4 つの端をマウントします。</li>
		<li>測定し、1 D ストレッチの 1 つの軸または 2 D ストレッチの両方の軸上のアルミ ブロックの間にフィルムの長さを記録します。倍伸縮する目的に基づいて 1 つまたは 2 つの方向にフィルムを伸ばすために必要な距離を計算します。</li>
		<li>90 ° C のオーブンで映画ロードの伸縮装置を置き、10 分以上温度にフィルムをもたらします。場所大ビーカーに少量の水と一緒にオーブンで。</li>
		<li>ストレッチ フィルム。</li>
		<li>ストレッチが完了したら、オーブンから伸縮装置を除去し、20 分間室温にフィルムを冷ます。</li>
		<li>1 D 端ストレッチ デバイスから映画をカット、ストレッチします。2D ストレッチ両方の軸のうち、中央の正方形は均一に伸びるフィルムの保存をカットします。チューブあたり 2 作品と円錐管でフィルムを置き、映画の残りの部分を破棄します。</li>
		<li>フィルムが溶解するまで各円錐管と渦に DI 水約 25 mL を追加します。</li>
		<li>フィルムが溶けると、一度は、DI 水で 3 回の粒子を洗浄します。<ol>
<li>微粒子、5 分間 3000 × g で遠心分離し、50 mL の円錐管を埋める、上澄みを注ぐ、DI 水の粒子を再懸濁しますに渦約 20 mL を加えます。</li>
			<li>転送高速遠心分離機管 40,000 × g で 15 分間遠心する粒子ナノ粒子上清を注ぐ、DI 水の粒子を再懸濁しますに渦約 20 mL を加えます。</li>
		</ol>
</li>
		<li>第 3 洗浄後約 1 mL の純水で粒子を再懸濁します。遠心チューブの重量を記録し、粒子をチューブに追加します。1 時間またはフラッシュ-80 ° C のフリーザーで凍結粒子を液体窒素で凍結します。凍結後は、粒子を一晩凍乾します。</li>
		<li>凍結乾燥、一度遠心チューブの粒子の重量を量るし、凍結乾燥粒子の重量を決定する空の管の記録できる体重を引きます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 表面蛋白質共役人工抗原提示細胞を作成するには
<ol><li>準備 2-(N Morpholino) ethanesulfonic 酸 (MES) バッファー。水で MES の 0.1 M 溶液を作成し、1 M 水酸化ナトリウム (NaOH) を滴定法による 6.0 に pH を調整します。</li>
	<li>ボルテックスでは、MES バッファーに 20 μ g/mL で凍結乾燥 PLGA/PBAE マイクロ/ナノ粒子を再懸濁します。MES バッファーの 900 μ L でポリプロピレン製遠心管を埋めるし、チューブに粒子溶液 100 μ L を追加します。</li>
	<li>EDC/NHS ソリューションを準備します。40 mg 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) カルボジイミド (EDC) および 48 mg N hydroxysulfoxuccinimide (NHS) 1 mL MES バッファーに溶解します。</li>
	<li>粒子と混合する渦に 100 μ L の EDC/NHS のソリューションを追加します。</li>
	<li>30 分間室温でインバーターのチューブを孵化させなさい。</li>
	<li>5 分 5 分、または 17,000 x g でナノ粒子の 5,000 × g で微粒子を回しなさい。上澄みを廃棄し、5 秒間 (ナノ粒子) 2-3 W でボルテックス (微粒子) または sonicating 1 mL PBS に再懸濁します。</li>
	<li>微粒子、パーティクルに所望信号 1 タンパク質と 10 μ g 抗マウス CD28 の 8 μ g (クローン 37.51) を追加します。ナノ粒子、16 μ g 信号 1 と 20 μ g 抗マウス CD28 を追加します。1.1 mL をチューブでボリュームをもたらすに PBS を追加します。</li>
	<li>4 ° C でインバーターのチューブを一晩インキュベートします。</li>
	<li>次の日は、粒子を洗浄します。5 分 5 分、または 17,000 x g でナノ粒子の 5,000 × g で微粒子を回しなさい。、上澄みを廃棄し、粒子を 1 mL の滅菌 PBS でボルテックス (微粒子) または 5 秒 (ナノ粒子) の 2-3 W で超音波処理によって再懸濁します。2 回繰り返します。</li>
	<li>即座の使用のための培地の必要な濃度で粒子を再懸濁します。長期保存 10 Mg/ml と 100 mM ショ糖液で粒子を再懸濁します。凍結、凍結乾燥、-80 ° C で粒子を保存</li>
</ol>4. 評価と aAPC の評価
<ol><li>AAPC サイズと形状 (図 3) の評価<ol>
<li>走査型電子顕微鏡 (SEM) を用いた画像の粒子が微粒子のサイズと形状を特徴付けます。アルミに付着したカーボン テープ上にイメージング、広がりの凍結乾燥粒子 SEM のためのタックし、スパッター ・金パラジウム コート。</li>
		<li>サイズと画像解析ソフトを用いた粒子の縦横比を分析します。</li>
		<li>粒子のサイズを決定するには、スケール バーを使用してスケールを設定し、粒子径を測定します。平均粒子径を決定し、粒子サイズのヒストグラムを生成する約 100 の粒子に対して繰り返します。</li>
		<li>縦横比を決定するには、長い軸と粒子の短い軸間の距離を測定、短軸で軸を分割します。各図形の平均粒子アスペクト比を決定し、ヒストグラムを生成する各図形の約 50 の粒子に対して繰り返します。</li>
		<li>透過型電子顕微鏡 (TEM) を用いた粒子をイメージングによるナノ粒子のサイズと形状を特徴付けます。サイズと縦横比 5.1.2 で説明されているように画像解析ソフトを用いたナノ粒子を分析します。また、動的光散乱 (DL) または追跡分析 (NTA) ナノ粒子を使用して球状ナノ粒子のサイズを測定します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>タンパク質共役効率<ol>
<li>1-3 の方法に従って aAPC の準備が、ステップ 3.7 で蛍光シグナル 1 蛋白質と抗マウス CD28 を使用します。活用、洗濯後最終濃度 2 mg/mL aAPC の 1 ml の PBS、aAPC を再懸濁します。</li>
		<li>黒ポリスチレン 96 ウェル マイクロ プレートでの蛋白質の標準を準備します。プレートの最初の井戸に PBS に蛍光に分類されたシグナル 1 蛋白質の 5 μ g を追加し、プレートの行 PBS で 10 1:2 の希釈液を作る。最後も空白のままにします。蛍光に分類された抗 CD28 と標準の別のセットを生成するこの手順を繰り返します。</li>
		<li>3 通で黒のポリスチレン マイクロ プレートの複製の井戸に aAPC 溶液 100 μ L をピペットします。</li>
		<li>適切な波長の蛍光プレート リーダーの蛍光を読み取る。蛋白質の標準から蛍光の測定値を使用すると、各蛍光抗体の標準曲線を生成できます。標準曲線を使用して、各サンプルよく抗 CD28 と信号 1 の濃度を計算し、表面のタンパク質と共役効率 (図 4 a, 図 5 a) の量を計算します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>AAPC体外cd8 T 細胞の刺激のための評価<ol>
<li>B' メディアを準備 (L グルタミン、10 %fbs、1% 非本質的なアミノ酸液、ピルビン酸ナトリウム 1%、1 %mem ビタミン溶液 RPMI 培 92 μ M β-メルカプトエタノール、10 ng/mL シプロフロキサシン、30 U/mL IL-2。</li>
		<li>二酸化炭素の暴露を介して黒 6 マウスを犠牲に。</li>
		<li>以前に確立されたプロトコル16によるとマウスから脾臓を収穫します。10-50 mL のコニカル チューブに脾臓を収集 15 mL PBS。乳棒を用いて 50 mL の円錐管に 70 μ m セル ストレーナー脾臓をマッシュします。マッシュ アップ、中に 40 mL の PBS でストレーナーを洗浄します。</li>
		<li>5 分間 300 x g で脾細胞をスピンします。上清を注ぎ、4 mL の赤の血液細胞を溶解する Ack 溶解バッファーで脾細胞を再懸濁します。1 分邪魔に座って管を許可する、PBS を 20 mL チューブにボリュームを表示するを追加します。</li>
		<li>5 分の 300 x g でセルを回しなさい。上清を離れて注ぎ、1 mL の PBS で細胞を再懸濁します。診断を使用してセルをカウントします。</li>
		<li>5 分の 300 x g でセルを回し、細胞分離バッファーの適切なボリュームで再懸濁します。Cd 8 + T 細胞 cd8 陰性選択 T 細胞分離キットには、次の製造元のプロトコルを使用して単一細胞懸濁液を分離します。</li>
		<li>磁気分離後 5 分の 300 x g cd 8 + T 細胞を回し、細胞分離バッファーを削除します。1 mL の PBS で細胞を再懸濁し、セルをカウントします。製造元のプロトコルに従って carboxyfluorescein サクシニル エステル (CFSE) とセルにラベルを付けます。</li>
		<li>8,333 cd8 陽性 T 細胞と 0.0833 mg (または必要な線量) 各ウェルで 150 μ L B' メディアに aAPC の 96 の孵化も組織培養治療プレート U 底。</li>
		<li>37 ° C で 7 日間インキュベートします。3-4 日後に、75 μ L 新鮮な培地を各ウェルに追加することによって培養培地を更新します。</li>
		<li>培養 3 日後増殖を評価する流れの cytometer で細胞を標識 CFSE を分析します。流れの cytometry CFSE ヒストグラムの各ピークは、各連続の細胞分裂と CFSE 希釈による細胞の世代を表します。</li>
		<li>7 日後に、各ウェル内のセルの数をカウントするのに、検定を使用します。カウント、前にトリパン ブルー溶液と死んだ細胞を染色します。最終的な細胞数から死んだ細胞を除外します。初期濃度倍拡大(図 4 および図 5) を計算するために最終的な細胞濃度を正常化します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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このプロトコルは、異方性高分子粒子の正確な生成のため汎用性の高い方法を詳しく説明します。ここで説明する手法を伸ばして薄い膜がスケーラブルな高い再現性で安価です。異方性粒子を生成するための代替技術はコストが高い、低いスループット、および限られた粒を含む多くの制限に苦しみます。薄膜のアプローチをストレッチは、合成後に異方性粒子が変更されるため有利であると、その結果、粒子サイズと合成技術の広い範囲と互換性が。図 1は、自動二次元ストレッチ デバイスのセットアップを詳しく説明します。このデバイスは、フィルムがストレッチの所望の程度に達するまで手動でネジを回すことによって電子のコンポーネントなしでも使用できます。しかし、我々 は自動化されたプロセスがはるかに一貫して手動操作15より迅速を発見しました。マイクロ アプローチ17,18,19、層によってコーティ...

彼らは堅牢な抗原特異的 T 細胞応答を生成できるため、人工抗原提示細胞 (aAPC) は免疫調節剤として約束を示しています。これらのプラットフォームに不可欠な効率的に T 細胞の活性化のための重要な信号を提示するという機能です。容易で安価を作製、スケール アップと翻訳の間に少ない課題に直面し、細胞ベースの治療に関連付けられているリスクを軽減するため、無細胞 aAPC、セルベース aAPC に魅力的な代替手段です。無細胞 aAPC は信号プレゼンテーション パラメーター制御の高度と T セル1に接続されます。 表面の物理的性質を有効にできます。
aAPC は、T 細胞の活性化に不可欠な 2 つの信号の最小値を要約する必要があります。シグナル 1 は、抗原認識を提供し、T 細胞受容体 (TCR) を認識し、MHC クラス I または II の同種の抗原を軸受を介して複雑な TCR シグナリングで最高潮に達する従事し場合に発生します。抗原特異性要件をバイパスするには、aAPC システムはしばしば特異的 TCR 複合体を刺激する CD3 受容体に対するアゴニスト抗体を負担します。MHC、特に MHC 多量の組換えの形態は、抗原特異性2,3を提供するために、aAPC の表面に使用されています。信号 2 は T 細胞の活動を指示する共刺激シグナルです。共刺激が引き起こす T 細胞の活性化に必要なを提供するために 4-1 bb など他の共刺激受容体が正常にターゲットを絞った4をされているが、CD28 受容体は一般的に aAPC 表面アゴニスト抗体で刺激されます。1 と 2 の信号タンパク質 aAPC を合成する剛体粒子の表面に通常固定されています。歴史的に、aAPC はポリスチレンの4、5と鉄デキストラン6を含む、材料の様々 なでつくられています。新しいシステムは利用するポリ (乳酸グリコール酸) のような生分解性ポリマー (PLGA) aAPC 蛋白質に信号を簡単に結合することができます、生体内直接管理に適しているとの持続的な放出を促進することができますを生成するにはサイトカインや可溶性因子 T 細胞活性化7、8を強化するためにカプセル化されます。
必要な信号蛋白質の存在に加え aAPC/T 細胞間相互作用の中に十分に大きい面積で受容体関与は T 細胞の活性化に不可欠です。したがって、aAPC のサイズや形状などの物理的なパラメーターを大幅にその接触面積を変更し、T 細胞を刺激するために彼らの能力に影響を与えます。ミクロン サイズ aAPC 刺激 T 細胞で、ナノスケールの対応9,10よりも効果的であることが示されています。しかし、ナノ aAPC は優れた体内分布および可能性があります、パフォーマンス強化体内にマイクロ aAPC11リンパ節よりよい排水を持つことができます。形状は、aAPC の粒子ベース システムへの関心の別の変数です。異方性 aAPC は最近刺激 T 細胞, と標的細胞の減らされた非特異的細胞取り込みと相まって強化された相互作用による主に等方性粒子よりもより効果的に示されています。細胞は優先的に楕円体粒子の長軸をバインドし、平坦なサーフェスの曲率半径を大きく aAPC と T 細胞の12のより多くの接触を可能にします。楕円体粒子の長軸は、貪食能、次の体内管理12,13球状粒子と比較して高められた循環時間の結果を落胆させます。これらの利点のため楕円体粒子仲介抗原特異的 T 細胞体外と体内の球形の粒子と比較しての拡大効果は観測マイクロおよびナノスケールの回路の両方で12、 13。異方性粒子を製造するための様々 な戦略がありますが、多様な粒子形状14の範囲を生成するために使用シンプルで広く受け入れられている方法は、薄膜のストレッチします。次の合成、粒子は映画にキャスト、粒子材料のガラス転移温度以上の温度で 1 つまたは 2 つの次元で伸びる。フィルム粒子を取得するために溶かします。異方性粒子の関心の高まり、にもかかわらず加工粒子ベース aAPC の現在のアプローチは等方性システムに制限されてほとんどと粒子形状を変更する方法は、実装が困難な特定 aAPC 合成と互換性がありません。戦略と精度と再現性の欠如15。当社の薄膜のストレッチ法は、手動で実行または急速に様々 な生分解性高分子から合成される異方性粒子を生成するための自動化された方法で 1 つまたは 2 つの次元のための15で必要な縦横比に拡大できます。
生分解性の粒子ベースのアプローチで急速に aAPC 可変サイズと形状を生成する T 細胞の拡大前のヴィヴォまたはのための標準化された方法でスケーラブルな薄膜ストレッチ技術と相まって開発した従来の仕事に基づいて、vivo。この aAPC システムに高度な柔軟性を与える目的の密度の粒子表面にカルボキシル基と関心の任意の蛋白を結合する蛋白質活用戦略を使用できます。サイズ、形態、表面蛋白質、aAPC のコンテンツを評価し、その機能の in vitro評価法についても述べる。このプロトコルは、展開前のヴィヴォ免疫細胞や生体内でさまざまな免疫療法のアプリケーションのために容易に適応することができます。

<table><tbody><tr><td>ポリ(ビニルアルコール)、MW 25000、88%加水分解ポリ</td><td>サイエンシズ社</td><td>02975-500</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>デジタル体温計</td><td>Fluke</td><td>N/A</td><td>モデル名: Fluke 52 II</td></tr><tr><td>浸漬温度プローブ</td><td>Fluke</td><td>N/A</td><td>モデル名: Fluke 80PK 22</td></tr><tr><td>デジタル・ホットプレート &スターラー</td><td>ベンチマークサイエンティフィ</td>ック <td>H3760-HS</td><td></td></tr><tr><td>マルチポイントスターラー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>50093538</td><td></td></tr><tr><td>リソマー RG 504 H, ポリ(D,L-ラクチド-co-グリコリド)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>719900</td><td></td></tr><tr><td>ジクロロメタン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D65100</td><td></td></tr><tr><td>ホモジナイザー</td><td>IKA</td><td>&nbsp;</td><td></td>0003725001</tr><tr><td>ソニケーター</td><td>ソニックス&マテリアルズ株式会社</td><td>N/A</td><td>型番:VC 505</td></tr><tr><td>Sonicator防音エンクロージャ</td>ー <td>Sonics &マテリアルズ株式会社</td><td>N/A</td><td>品番: 630-0427</td></tr><tr><td>ソニケータープローブ</td><td>ソニックス &マテリアルズ株式会社</td><td>N/A</td><td>品番: 630-0220</td></tr><tr><td>Sonicator microtip</td><td>Sonics &マテリアルズ株式会社</td><td>N/A</td><td>品番:630-0423</td></tr><tr><td>高速遠心分離機</td><td>ベックマン・コールター</td><td>N/A</td><td>型番:J-20XP(販売終了)、代替型式:J-26XP</td></tr><tr><td>高速遠心ローター</td><td>ベックマン・コールター</td><td>369691</td><td>型番:JA-17</td></tr><tr><td>高速ポリカーボネート製遠心チューブ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>3118-0050</td><td>50mL、スクリューキャップ</td></tr><tr><td>長方形ディスポーザブルペトリディッシュ</td><td>VWR インターナショナル</td><td>25384-322</td><td>75 x 50 x 10 mm</td></tr><tr><td>スクエア ディスポーザブル シャーレ</td><td>VWR インターナショナル</td><td>10799-140</td><td>100 mm x 100 mm</td></tr><tr><td>リーフ&nbsp;精製抗マウスCD3&epsilon;抗体</td><td>バイオレジェンド</td><td>100314</td><td></td></tr><tr><td>InVivoMab 抗マウス CD28、クローン 37.51</td><td>Bio X Cell</td><td>BE0015-1</td><td></td></tr><tr><td>N-(3-ジメチルアミノプロピル)-N&prime;-エチルカルボジイミド塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6383</td><td></td></tr><tr><td>N-ヒドロキシスルホスクシンイミドナトリウム塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56485</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 抗マウス CD3 抗体</td><td>Biolegend</td><td>100212</td><td></td></tr><tr><td>APC 抗マウス CD28 抗体</td><td>Biolegend</td><td>102109</td><td></td></tr><tr><td>コーニング&nbsp;96ウェルソリッドポリスチレンマイクロプレート</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3915</td><td>平底、黒色ポリスチレン</td></tr><tr><td>プロテインLoBindチューブ、1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22431081</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium(+ L-Glutamine)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135</td><td>Heat Inactivated, sterile-filtered</td></tr><tr><td>Ciprofloxacin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>17850</td><td></td></tr><tr><td>2-メルカプトエタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒト IL-2 (キャリアフリー)</td><td>Biolegend</td><td>589102</td><td></td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム (100 mM)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>MEM 非必須アミノ酸溶液 (100X)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>MEM ビタミンソリューション (100X)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11120052</td><td></td></tr><tr><td>CD8a+&nbsp;T細胞単離キット、マウス</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-104-075</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace CFSE 細胞増殖キット</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>LSカラム</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MidiMACS セパレーター</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>MACS マルチスタンド</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>フローサイトメーター</td><td>Accuri C6</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Synergy 2 マルチ検出マイクロプレートリーダー</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>autoMACS ランニングバッファー</td><td>Miltenyi BIotech</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>セルストレーナー</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>22363548</td><td>滅菌済み, 70 & micro;m ナイロンメッシュ</td></tr><tr><td>ACK Lysing Buffer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1049201</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J (Black 6) マウス</td><td>ジャクソン研究所</td><td>000664</td><td>オス、少なくとも7週間経過</td></tr><tr><td>U底 組織培養プレート</td><td>VWR</td><td>353227</td><td>滅菌済み、96ウェル組織培養処理済みポリスチレンプレート</td></tr><tr><td>DC40V 電源</td><td>Probotix</td><td>LPSK-4010</td><td></td></tr><tr><td>PTFE被覆線マ</td><td>ウザー</td><td>602-5858-100-01</td><td>これは100フィートのスプール用ですが、同等のワイヤーが機能します</td></tr><tr><td>ステッピングモータードライバー</td><td>Probotix</td><td>MondoStep5.6</td><td></td></tr><tr><td>IDCコネクタキット</td><td>Probotix</td><td>IDCM-10-12</td><td></td></tr><tr><td>マイクロコントローラー</td><td>Probotix</td><td>PBX-RF</td><td></td></tr><tr><td>4A ヒューズ</td><td>ラジオシャック</td><td>2701026</td><td>同等のヒューズも機能します</td></tr><tr><td>DB25オス-オスケーブル</td><td>Probotix</td><td>DB25-6</td><td></td></tr><tr><td>USB-A-USB-Bケーブル</td><td>ステープル</td><td>2094915</td><td>同等のケーブルも機能します</td></tr><tr><td>8ピンAmphenolコネクタオスおよびメス</td><td>マウ</td><td>ザー654-97-3100A-20-7Pおよび654-97-3106A20-7S</td><td></td></tr><tr><td>ステッピング</td>モーターProbotixHT23-420-8<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>右手リードスクリュー</td><td>ロトン</td><td>60722</td><td></td></tr><tr><td>左利き用リードスクリュー</td><td>Roton</td><td>60723</td><td></td></tr><tr><td>ネジ</td><td>McMaster Carr</td><td>92196A151</td><td></td></tr><tr><td>ネオプレンラバー</td><td>McMaster Carr</td><td>8698K51</td><td></td></tr><tr><td>右利き用フランジ付きリードナット</td><td>Roton</td><td>91962</td><td></td></tr><tr><td>左利き用フランジ付きリードナット</td><td>Roton</td><td>91963</td><td></td></tr><tr><td>Linux Control Computer</td><td>Probotix</td><td>LCNC-PC</td><td>仕様が一致し、Linuxオペレーティングシステムが動作するコンピュータであれば、</td></tr><tr><td>コーニングのボトルトップ真空フィルターシステム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS431097</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0.4 %</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr></tbody></table>

異方性高分子人工抗原提示細胞 cd 8 + t 細胞活性化のための加工

Fabrication of Anisotropic Polymeric Artificial Antigen Presenting Cells for CD8+ T Cell Activation

人工抗原提示細胞 (aAPC) は、T 細胞を刺激するために強力な能力による免疫変調の有望なプラットフォームです。無細胞基板は、信号プレゼンテーション パラメーターの正確な制御と T 細胞との相互作用を調節する aAPC 表面の物理的性質などを含む細胞ベースの aAPC 上重要な利点を提供しています。異方性粒子から構成されて aAPC 特に楕円体粒子結合の増加と T 細胞の大きい表面積のための刺激的な T 細胞の球形対応連絡先としてもより効果的であることが示されています。非特異的取り込みと強化された薬物動態特性を減少。異方性粒子の関心の高まり、にもかかわらず実装および再現性をもって使用する薄膜のストレッチが困難になるなど、異方性粒子を生成する方法をも広く受け入れ。
このため、我々 は可変のサイズ、形状を持つ生分解性異方性粒子ベース aAPC の急速な標準化された作製のためのプロトコルを記述して T 細胞拡張前のヴィヴォまたは生体内で、方法と一緒にプレゼンテーションを信号サイズ、形態、およびコンテンツ、表面蛋白質を特徴付けるその機能を評価します。異方性 aAPC の製造へのこのアプローチは、スケーラブルかつ再現可能な作って、aAPC「市販」免疫療法のための生成に理想的です。

ストレッチ装置自動 2次元薄膜の回路図は、図 1で与えられます。Ho ら17標準加工と加工技術を使用してアルミ部品から担架を構築で回路図と 1 D 薄膜デバイスのストレッチの説明を与えます。1 D 担架と同様に、2 D の担架は金属のグリップとガイド レールで構成されます。双方向鉛ねじは、回転運動を直線に変換する使用されます。レジンリード スクリューは、十分なトルクと同一のステッピングモータに機械タップを介して接続されています。8 のステッピング モーター制御ワイヤーは、薄膜を伸ばすためオーブンで制御コンソールに簡単に添付ファイルの 8 ピン耐熱性 amphenol コネクタに半田付けすることができます。十分な長さのポリテトラフルオロ エチレン (PTFE) をコーティングしたワイヤーはコントロール コンソール ドライバーにステッピング モーターを接続するために使わなければなりません。推奨されるコンピューター制御方式は、図 ...

ここでは、迅速かつ再現性をもって生物学的に促された、生分解性のバスユニットなど抗原提示し、可変サイズ、形状、および T 細胞の拡大前のヴィヴォまたは体内表面蛋白質プレゼンテーションと細胞 (aAPC) を生成するためのプロトコルを提案します。.

異方性高分子人工抗原提示細胞 cd 8 + T 細胞活性化のための加工

Artificial antigen presenting cells (aAPC) are a promising platform for immune modulation due to their potent ability to stimulate T cells. Acellular ...

この方法は、アミノ工学分野の主要な質問に答える助けになります。例えば、生体物質免疫細胞相互作用および活性化に対する粒子物性の役割は何である。この技術の主な利点は、バイオミメティック粒子のサイズと形状の独立した制御を可能にすることです。この技術の意味は、生体細胞介在免疫応答を引き起こす可能性のある既製粒子療法であるため、癌の治療にまで及ぶ。この方法は、癌のアミノ療法への洞察を提供することができますが, 他のシステムにも適用することができます。.例えば、感染症や1型糖尿病。微粒子合成の場合、まず、100ミリグラムのポリ(乳酸-コグリコール酸)またはPLGAをシンチレーションバイアルに計量し、渦を起こして5ミリリットルのジクロロメタンにPLGAを溶解させます。50ミリリットルの1%ポリビニルアルコール、またはPVA溶液を含むビーカーにホモジナイザーを入れて、ホモジナイザーがビーカーの底にできるだけ近く触れることなく近づくようにします。適切な速度にホモジナイザーをオンにし、均質化の1分間ビーカーにPLGA溶液を追加します。均質化の終わりに、ポリビニルアルコールPLGA微粒子溶液を化学フードの攪拌板に100ミリリットルの5%PVA溶液を含むビーカーに注ぎ、少なくとも4時間攪拌します。溶媒が蒸発したら、粒子溶液を50ミリリットルの円錐形チューブに注ぎ、遠心分離によって粒子を集める。各チューブ内の上澄み物を20ミリリットルの脱イオン水に置き換え、渦によって粒子を再懸濁させます。その後、各チューブの最終体積を新鮮な脱イオン水で最大50ミリリットルにし、実証したように粒子をさらに2回洗います。ナノ粒子合成の場合、5ミリリットルのジクロロメタンにPLGAの200ミリグラムを溶解し、ビーカーの底部に触れることなく氷上に1%PVA溶液の50ミリリットルを含むビーカーに超音波処理器プローブを配置します。12ワットで超音波処理を開始し、すぐに約200ナノメートルの直径を持つナノ粒子を生成するために2分間の超音波処理のためにビーカーにPLGA溶液を追加します。超音波処理の後、化学ヒュームフード内の溶媒蒸発の4時間の攪拌板上の5 PVA溶液の100ミリリットルを含むビーカーに1%ポリビニルアルコールPLGAナノ粒子溶液を注ぎます。すべての溶媒が蒸発したら、粒子溶液を50ミリリットルの円錐チューブに注ぎ、微小粒子を除去し、上清を除去します。次に、ナノ粒子を高速遠心管に移し、実証したように脱イオン水で3回のスリングを行います。ポリマー粒子製造の場合、最後の洗浄後、粒子を約1ミリリットルの新鮮な脱イオン水で再懸濁し、1ミリリットルの粒子の最終濃度にフィルム鋳造液を加える。1次元延伸のために75 x 50ミリメートルの長方形のペトリ皿に10ミリリットルのアリコートで粒子懸濁液を移す。または15ミリリットルのアリコートで100〜100ミリメートル平方のペトリ皿に2次元ストレッチ。化学フードで一晩乾燥した後、ピンセットを使用してフィルムを取り除き、はさみで縁を整えます。1D延伸の場合、1つのフィルムの2つの短いエッジをネオプレンゴムの2つの部分の間に置き、自動薄膜伸縮装置の1軸のアルミニウムブロックに取り付けます。その後、アレンレンチを使用して、ゴムの上の金属グリップをねじ込んでフィルムを所定の位置に保持します。2Dストレッチの場合、4つのエッジすべてを4つのアルミニウムブロックに取り付けて、両方の軸でフィルムを伸ばし、1つのDストレッチのアルミニウムブロック間のフィルムの長さを記録し、2Dストレッチの場合は1つまたは両方の軸を記録し、所望の折りたたみストレッチに基づいてフィルムを1つまたは2つの方向に伸ばすために必要な距離を計算します。その後、フィルムをオーブンに積み込んだストレッチ装置を摂氏90度のオーブンに置き、少量の水の大きなビーカーの隣に置き、フィルムを10分以上温度にします。延伸が完了したら、フィルムを室温まで20分間冷まします。1Dストレッチの場合は、フィルムを伸張装置の端から切り取ります。2Dストレッチの場合は、両方の軸で均一に伸ばされたフィルムの中心の正方形を切り取って保存します。フィルムをチューブあたり2本以下のフィルムを持つ50ミリリットルの円錐管に入れ、渦を出すために各チューブに約25ミリリットルの脱イオン水を加えます。フィルムが溶解したら、実演したように粒子を脱イオン水で3回洗浄する。最後の洗浄後、チューブあたり約1ミリリットルの新鮮な脱イオン水で粒子を再懸濁する。その後、1時間または一晩凍結乾燥のためにマイナス80度で粒子を凍結します。翌朝、凍結乾燥したマイクロまたはナノ粒子を、渦を伴って調製した新しいMESバッファーで1ミリリットル当たり20ミリグラムで再中断する。900マイクロリットルのMESバッファーを含むポリプロピレンマイクロ遠心分離管に100マイクロリットルの粒子溶液を加え、100マイクロリットルの新たに調製したEDC NHS溶液を加えます。粒子を渦で混ぜ、室温でインバータ上の粒子を30分間インキュベートします。インキュベーションの終わりに、遠心分離によって粒子を収集し、2〜3ワットで5秒の超音波処理によってPBSの1ミリリットルで微粒子ペレットを再懸濁するか、または再懸濁する。次に、1つのタンパク質と10マイクログラムの抗マウスCD28抗体の適切なシグナルの8マイクログラムをマイクロ粒子に加え、1タンパク質のシグナル16マイクログラムと抗マウスCD28の20マイクログラムをナノ粒子に加えます。各チューブの最終体積をPBSで1.1ミリリットルにし、摂氏4度でインバーターで一晩粒子をインキュベートします。翌日、デモンストレーションのように粒子を脱イオン水で3回洗浄します。これらのPLGAナノおよびマイクロ粒子は、透過および走査電子顕微鏡を用いて実証および画像化された単一のエマルジョン技術を用いて合成した。均質化後、マイクロ粒子は約3マイクロメートルの平均直径を実証した。球状の微粒子は約1のアスペクト配給を持ち、1D伸びた楕円体粒子は約3.5の大きなアスペクト比を持ち、2D伸ばした楕円体粒子は約1.2のアスペクト比を持ち、アスペクト比は1の大まかに維持した。結合効率の結果は、球状および楕円体のマイクロ人工抗原提示細胞、またはAAPCおよびナノAAPCの表面上の類似量のタンパク質を明らかにし、AAPC合成中のタンパク質結合が濃度依存的に起こることを実証する。プロレート楕円体AAPCは、01ミリグラムの用量で達成された最良の分離を有する球形AAPCよりもサブ飽和用量で高いレベルのT細胞増殖を誘導することが判明した。7日後、T細胞の手動カウントは、楕円体AAPCがより効果的に用量依存的な方法でマイクロおよびナノスケールで彼らの球形の対応物と比較してT細胞を刺激することを明らかにした。この手順に従って、 AAPC は、治療効果および薬物動態を測定する in vivo で管理することができます。.その開発後、この技術は、免疫工学の分野の研究者がAAPC有効性に対する異方性の影響を探求する道を開くのに役立ちました。

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Research

JoVE Journal

Environment

環境

抗原特異的T細胞の誘導と拡大のための新しいDCの独立した方法が記載されている。 HLA A2 - Igはベースの人工的な抗原提示細胞（aAPC）が効率的に多様な抗原特異性のCTLを拡大するHLA -...

HLA - Igは効率のためのベースの人工抗原提示細胞生体外で</emヒトCTLの>拡大

ここでは、人工抗原提示細胞（AAPC）を使用してバルクT細胞集団から、ヒトNKT細胞を活性化し、拡大するための方法を説明します。...

ナチュラルキラーT細胞の細胞（AAPC）媒介活性化と増殖を提示する人工抗原

このビデオでは、抗原性ペプチドをロードしたMHC-Igsと抗CD28抗体で機能化された磁性ナノ粒子ベースの人工抗原提示細胞(aAPC)を使用して、希少抗原特異的CD8+ T細胞を単離するためのプロトコルについて説明しています。抗原性ペプチド標的T細胞受容体を特異的に発現するCD8+ T細胞とaAPCsとの相互作用、およびその後のin vitroでの増殖により、このCD8+...

ナノ粒子による抗原特異的CD8+ T細胞の濃縮と増殖

このビデオは、UV照射を使用して光活性化可能なペプチド-主要組織適合遺伝子複合体をデカジッジする方法を示しています。デカジングプロセスにより、天然のペプチド配列が露出し、正確なT細胞の活性化が可能になります。...

光活性化ペプチドMHCによる制御されたT細胞活性化の評価

ガイドラインが提示細胞キラー人工抗原の生成のために提示され、KaAPC、ヒト抗原特異的T細胞のインビトロ枯渇および抗原のT細胞媒介性自己免疫疾患の治療のための細胞免疫療法の代替ソリューションのための効率的なツール残りの免疫系を損なうことなく、特定の方法。...

効率的なためキラー人工抗原提示細胞（KaAPC）体外ヒト抗原特異的T細胞の枯渇

私たちは、流体脂質二重層によって取り囲まれるナノメートルタンパク質のパッチでガラスを官能化するプロトコルを提示します。これらの基板は、高度な光学顕微鏡と互換性があり、細胞接着および遊走の研究のためのプラットフォームとして機能することが期待されます。...

サポートされている脂質二重層中のリガンドナノクラスター配列

このプロトコルでは、T リンパ球活性型ペプチド-MHC T 細胞活性化の正確な時空間制御を有効にするを使用してアクティブにするイメージング...

活性型アゴニストを用いた T 細胞活性化の空間的で、一時的なコントロール

抗原特異的 T 細胞は特性またはその極低周波による治療を利用しにくい。本明細書で我々 はこれらの細胞を豊かにする抗原特異的 T 細胞に結合することができます磁性粒子を開発するためのプロトコルを提供し、それらをいくつか展開する特性評価および治療の両方の 100...

豊かにし、磁性ナノ粒子でまれな抗原特異的 T 細胞を展開

このプロトコルの使用を記述する単一のチェーンの MHC のクラス I 人間 cd8 陽性 T 細胞活性化の分子間相互作用を調査する錯体: 世代人工抗原提示単一のチェーンを表現する細胞の構築では、人間 cd8 陽性 T 細胞クローンの文化そして T...

人間 cd8 T 細胞活性化における Co 作動を調査する単一のチェーン MHC 技術の使用

自己免疫性糖尿病モデルにおける機能試験用抗原特異的一次マウス細胞傷害性T細胞の高効率生成

本稿では、OP9/DLL1共培養系を用いて機能性腫瘍抗原特異的人工多能性幹細胞由来CD8αβ+単陽性T細胞を生成する方法について説明する。...

腫瘍抗原特異的T細胞の生成にヒト誘導多能性幹細胞を用いた

学ぶ異方性高分子人工抗原提示細胞の作製法。サイズと形状を独立制御し、CD8+T細胞活性化を促進する生分解性粒子の合成技術を解説。がん免疫療法や感染症治療への応用可能性を示す。

異方性高分子人工抗原提示細胞 cd 8 + T 細胞活性化のための加工

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