Name: チミジン アナログ エドゥと線虫の生殖における細胞周期解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 58 s
Description: 学ぶ EdUを用いたC. elegans雌雄同体生殖腺における細胞周期解析法。トランスジェン不要で免疫蛍光染色と併用可能であり、S期細胞の同定と細胞動態の解析に有用です。老化や栄養研究への応用も期待されます。

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MG1693; のエシェリヒア属大腸菌のストック センターに感謝しておりますWormbase;国家機関の健康オフィスの研究インフラストラクチャのプログラム (P40OD010440) 系統; によって資金が供給される線虫の遺伝学センターザック ピンカス統計的アドバイス;愛平公使風水の試薬;ルーク ・ シュナイダー、アンドレア ・ シャーフ、サンディープ クマー、トレーニング、アドバイス、サポート、および有用な議論; のジョン ・フィードバックのために本稿では Kornfeld と Schedl ラボ。この作品は一部で健康の国民の協会によって支えられた [R01 AG02656106A1 株式会社、TS に R01 GM100756 へ] と全米科学財団を経て交わり [DGE 1143954 と ZK を DGE 1745038]。健康の国民の協会、全米科学財団、研究、収集、分析、およびデータの解釈のデザインにも原稿を書くに任意の役割を持っていた。

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<li>Fox, P. M., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Germline+Stem+Cell+Differentiation+Following+Loss+of+GLP-1+Notch+Activity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Analysis of Germline Stem Cell Differentiation Following Loss of GLP-1 Notch Activity in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 201 (9), 167-184 (2015).</li>
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<li>Agarwal, I., Farnow, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HOP-1+presenilin+deficiency+causes+a+late-onset+notch+signaling+phenotype+that+affects+adult+germline+function+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">HOP-1 presenilin deficiency causes a late-onset notch signaling phenotype that affects adult germline function in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 208 (2), 745-762 (2018).</li>
<li>Gumienny, T. L., Lambie, E., Hartwieg, E., Horvitz, H. R., Hengartner, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+control+of+programmed+cell+death+in+the+Caenorhabditis+elegans+hermaphrodite+germline%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Genetic control of programmed cell death in the Caenorhabditis elegans hermaphrodite germline.</a> Development. 126 (5), Cambridge, England. 1011-1022 (1999).</li>
<li>Hendzel, M. J., Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitosis-specific+phosphorylation+of+histone+H3+initiates+primarily+within+pericentromeric+heterochromatin+during+G2+and+spreads+in+an+ordered+fashion+coincident+with+mitotic+chromosome+condensation%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Mitosis-specific phosphorylation of histone H3 initiates primarily within pericentromeric heterochromatin during G2 and spreads in an ordered fashion coincident with mitotic chromosome condensation.</a> Chromosoma. 106 (6), 348-360 (1997).</li>
<li>Zetka, M. C., Kawasaki, I., Strome, S., Mü Ller, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapsis+and+chiasma+formation+in+Caenorhabditis+elegans+require+HIM-3%2C+a+meiotic+chromosome+core+component+that+functions+in+chromosome+segregation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">Synapsis and chiasma formation in Caenorhabditis elegans require HIM-3, a meiotic chromosome core component that functions in chromosome segregation.</a> Genes & development. 13 (17), https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC317003/pdf/x8.pdf 2258-2270 (1999).</li>
<li>Hansen, D., Hubbard, E. J. A., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-pathway+control+of+the+proliferation+versus+meiotic+development+decision+in+the+Caenorhabditis+elegans+germline%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Multi-pathway control of the proliferation versus meiotic development decision in the Caenorhabditis elegans germline.</a> Developmental Biology. 268 (2), 342-357 (2004).</li>
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<li>Zhao, H., Halicka, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+signaling%2C+impairment+of+cell+cycle+progression%2C+and+apoptosis+triggered+by+5-ethynyl-2%E2%80%B2-deoxyuridine+incorporated+into+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">DNA damage signaling, impairment of cell cycle progression, and apoptosis triggered by 5-ethynyl-2′-deoxyuridine incorporated into DNA.</a> Cytometry Part A. 83 (11), 979-988 (2013).</li>
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エドゥ ラベル細菌 (ステップ 1) の準備は、このプロトコルのトラブルシューティングの最初の点が重要です。4 h エドゥ パルス、エドゥ ラベル細菌の新しいバッチごとに便利なコントロールを作ってこれに非常に確実に野生型若い大人の両性具有のラベルです。さらに、(より古い動物または特定の咽頭/グラインダー欠陥変異) 腸を入力そのままのエドゥ ラベル細菌はクリックケミストリーにラベルを付けて、腸内で明るい長方形の点として表示されます。両性具有の分類のための代替技術は、EdU3の高濃度 (1 mM) で「浸漬」を使用します。この手法は、ラベルの持続期間のための動物を餓死、固定のトラブルシューティングを行うときに作るエドゥ ラベル細菌をバイパスし、クリックケミストリーする便利な方法を提供します。エドゥのフィードはありませんエドゥ「浸漬」実験が成功した場合は、新鮮なエドゥ ラベル細菌を準備します。また高い教育コンテンツを達成しながら十分な細菌の密度に達すると、1 つはエドゥとチミジンの濃度を調整する必要があります。
S 期のラベリング法の主な制...

動物の開発、数百、数千、百万、十億、または細胞の分裂も兆は、大人の有機体を形成する必要があります。細胞周期細胞イベントのセットから成る G1 (ギャップ)、S (合成)、G2 (ギャップ)、M (有糸分裂) 定義のシリーズと、イベントは各細胞分裂を実行します。細胞周期は、ダイナミックで技術的に難しいことができますリアルタイムで最高評価です。このプロトコルで説明する技法は、段階の測定を行い、静止画像からの細胞周期のタイミングに 1 つを許可します。
線虫(C. elegans) 大人の細胞周期ダイナミクスの研究で S 相を識別するゴールド スタンダードは、ヌクレオシド アナログ 5-エチニル-2'-デオキシウリジン (EdU) など 5-ブロモ-2'-デオキシウリジン (BrdU) 標識両性生殖1,2,3,4,5。彼らはどのような遺伝子構成に依存しないと、エドゥと BrdU をほぼすべての遺伝的背景に使用できます。BrdU を可視化、染色、しばしば共同の追加抗体の汚損によって視覚化他細胞マーカーの評価と互換性がない抗 BrdU 抗体の抗原を公開する過酷な化学治療が必要です。対照的に、エドゥを可視化するクリックケミストリー温和な条件下で発生し、従って抗体染色6,7と互換性のあります。
核のみ S 段階で DNA にチミジン (5-エチニル-2'-デオキシウリジン) 類縁体を組み込むので、ラベルの特異性は、はっきり。可視化は、固定組織で行われます。アジ化物を含む色素までひとりでにエドゥのラベルが表示されていないまたは fluorophore クリックの銅触媒を用いた化学8でエドゥのアルキンと反応して共有結合。エドゥのラベリングの核は、S 期、ラベリングの短いパルスを用いた即時情報を提供できます。エドゥも情報を提供できます動的パルス追跡または連続の分類; を使用してたとえば、パルス追跡実験ラベルは細胞分裂のたびに希釈または開発を経て、非分裂細胞進行を反映します。
線虫の両性生殖は、シグナリング細道、幹細胞、減数分裂、および細胞周期の研究の強力なモデル システムです。大人の生殖は、エントリと減数分裂前期、配偶子形成の段階より近位のコーディネート (図 1) の進行に続いて遠位端見られる幹細胞と偏光の流れ作業です。近位端に卵母細胞は成熟、排卵し受精し、子宮9,10,11の胚発生を開始します。細胞直径 20 〜 長い減数分裂前期のセルではなく、減数分裂期の S 期細胞前駆細胞有糸分裂サイクリングの生殖細胞系幹が含まれています、先端のセル付近と呼びます前駆ゾーン2,4,9,12. 細胞膜遠位の生殖細胞の核間の不完全な分離を提供しますが、前駆細胞のゾーンを経る有糸分裂細胞主として独立していないサイクリングします。若い大人の両性具有の生殖細胞のゾーンの中央の有糸分裂細胞周期期間は ~6.5 h;G1 期は簡単なまたは欠席、静穏化を1,2,13守らないと。生殖細胞系幹細胞の分化本質的に直接分化が発生し、こうしてトランジット増幅部門4を欠いています。Pachytene 段階の分化、約 5 のうち 4 核卵母細胞を形成しないが、アポトーシス、発展途上卵母細胞12,14細胞内容を寄贈ナース細胞として機能を代わりに受ける,15。
ヌクレオシド アナログ S 相の標識細胞に加えて、1 つは有糸分裂と減数分裂抗体の汚損を使用してセルを識別できます。有糸分裂の核は反リン酸化ヒストン H3 に陽性 (Ser10) (pH3 と呼出される) 抗体7,16。減数分裂の核は反彼 3 抗体 (減数分裂期染色体軸蛋白質)17に陽性です。前駆ゾーンの核は、彼 3、核質 REC 818の存在や WAPL 119の存在の有無によって識別できます。WAPL 1 強度、前駆ゾーンで高体生殖腺における最高低初期減数分裂 prophases19の間。プロトコルのいくつかのバリエーションを持ついくつかの細胞周期測定が可能な: 私) S 相の核を識別し、S 期のインデックスを測定II) M 段階で核を識別し、M フェーズ インデックスを測定III) 原子核は、有糸分裂または減数分裂 S 相; かどうかを決定します。IV) G2; 時間を測定します。V) G2 + M + G1 フェーズの duartion を測定します。VI) 減数分裂の入力の速度を測定します。VII) 減数分裂の進行の率を推定します。
1 つは、ウェット実験の種類から複数の細胞周期測定を行うことができます。以下のプロトコルは、エドゥ アンチ pH3 抗体と前駆ゾーン細胞アンチ WAPL 1 抗体の染色による染色による細菌や共同ラベリング M 期の細胞をラベルにc. の elegans大人の両性具有を供給することにより 30 分パルス ラベルについて説明します。エドゥのフィード (ステップ 2.5)、抗体の種類の期間の変更の採用 (手順 5)、追加の計測に必要な解析 (ステップ 8.3)。

<table><tbody><tr><td>大腸菌 MG1693</td><td>Coli Genetic Stock Center</td><td>6411</td><td>は、標準的な未補充のLB</td></tr><<tr><td>em>E. coli OP50</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td>OP50</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT EdU Alexa Fluor 488 イメージングキット</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>C10337</td><td></td></tr><tr><td>5-エチニル-2&プライム;-デオキシウリジン</td><td>Sigma</td><td>900584-50MG</td><td>または、キットで提供されているEdUグル</td></tr><tr><td>コース</td>シ<td>グマ</td><td>D9434-500G</td><td>D-(+)-デキストロース</td></tr><tr><td>チアミン(ビタミンB1)</td><td>シグマ</td><td>T4625-5G</td><td>試薬グレード</td></tr><tr><td>チミジン</td><td>シグマ</td><td>T1895-1G</td><td>バイオ試薬</td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム七水和物</td><td>シグマ</td><td>M1880-1KG</td><td>MgSO4、試薬グレード</td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム、二塩基性、無水</td><td>フィッシャー</td><td>BP332-500G</td><td>Na2HPO4</td></tr><tr><td>リン酸カリウム、一塩基性</td><td>シグマ</td><td>P5379-500G</td><td>KH2PO4</td></tr>塩化<tr><td>アンモニウム</td><td>シグマ</td><td>A4514-500G</td><td>NH4Cl、試薬プラス</td></tr><tr><td>細菌寒天</td><td>米国生物</td><td>C13071058</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム二水和物</td><td>シグマ</td><td>C3881-500G</td><td>CaCl</td></tr><tr><td>LBブロス(ミラー)</td><td>シグマ</td><td>L3522-1KG</td><td>25g/L レ</td></tr><tr><td>バミゾール</td><td>シグマ</td><td>L9756-5G</td><td>0.241g/10ml</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>Calbiochem Omnipur</td><td>6506</td><td>自家製 PBS も同様に機能します</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P1379-500ML</td><td></td></tr><tr><td>16% パラホルムアルデヒド、EM グレードのアンプル</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>15710</td><td>10ml アンプル</td></tr><tr><td>100% メタノール</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A454-1L</td><td>金標識メタノールは、特定の抗体による適切な形態に不可欠です</td></tr><tr><td>ヤギ血清</td><td>Gibco</td><td>16210-072</td><td>Lot 1671330</td></tr><tr><td>rabbit-anti-WAPL-1</td><td>Novus biologicals</td><td>49300002</td><td>Lot G3048-179A02, used at 1:2000</td></tr><tr><td>mouse-anti-pH3 clone 3H10</td><td>Millipore</td><td>05-806</td><td>Lot#2680533, used at 1:500</td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギ IgG 標識 Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A11012</td><td>ロット 1256147、1:400</td></tr><tr><td>ヤギ抗マウス IgG標識 Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A21236</td><td>ロット 1511347、4</td></tr><tr><td>',6-ジアミディノ-2-フェニルインドール二塩酸塩 (DAPI) を含む 1:400 Vectashield 退色防止封入剤</td>で使用)<td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td>DAPIなしの封入培地は、別のDAPIインキュベーション</td></tr><tr><td>マニキュア</td>ウェット<td>nワイルド</td><td>DTC450B</td><td>任意の透明なマニキュアが動作する必要があります</td></tr><tr><td>S-medium</td><td>の様々な</td><td></td>プロトコルM9バッファ<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>の wormbook.org を参照してくださいプロトコル<td></td></tr><tr><td>M9寒天</td>の<td>様々な</td><td>M9バッファと同じレシピ</td>の wormbook.org <td></td> を参照してくださいが、1.7%寒天を追加します</tr><tr><td>線虫成長媒体、</td><td>さまざまな</td><td></td><td>プロトコル解</td></tr><tr><td>剖時計ガラス</td><td>カロライナバイオロジカル</td><td>42300</td><td></td></tr><tr><td>パラフィルム実験室フィルム</td><td>ペチニープラスチック包装</td><td>PM-996</td><td>4インチ幅の実験室フィルム</td></tr><tr><td>ペトリ皿</td><td></td><td></td><td>直径60ミリメートル</td></tr><tr><td>長いガラスパスツールピペットのための</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr>wormbook.org を参照してください<td>1ml遠心分離管</td><td>MidSci Avant</td><td>2926</td><td></td></tr><tr><td>ヒント</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>セロロジカルピペット</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>500 mL 三角フラスコ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>アルミホイル</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>25G 5/8インチ針</td><td>BD PrecisionGlide&nbsp;</td><td></td><td></td>305122</tr><tr><td>5mlガラス遠心分離管</td><td>パイレックス&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラス管1ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ガラススライド</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>No1カバーガラス22 x 40 mm</td><td></td><td></td><td>いいえ1.5は、また</td></tr><tr><td>37 &degで動作する可能性があります。Cシェーカーインキュベーター</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>卓上遠心分離</td><td></td><td></td><td></td></tr>機<tr><td>臨床遠心分離</td>機<td>IEC</td><td>428</td><td>、6スイングバケットローター付き</td></tr>ミニ<tr><td>遠心分離</td><td></td><td></td><td></td></tr>機<tr><td>20 &deg;Cインキュベーター4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&deg;C冷蔵庫</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-20°C;C冷凍庫</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Observer Z1顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan Apo 63X 1.4 油浸対物レンズ</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultraview Vox スピニングディスク共焦点システム</td><td>PerkinElmer&nbsp;</td><td></td><td>ニコンのスピニングディスク共焦点システムも非常にうまく機能しますが、ここで説明しているように http://wucci.wustl.edu/Facilities/Light-Microscopy&nbsp;</td></tr></tbody></table>

チミジン アナログ エドゥと線虫の生殖における細胞周期解析

Cell Cycle Analysis in the C. elegans Germline with the Thymidine Analog EdU

真核生物における細胞周期解析はよく染色体形態、式および/または細胞サイクルのさまざまな段階やヌクレオシド アナログの取り込みに必要な遺伝子産物の局在を利用しています。S 期には、DNA ポリメラーゼはマーキング解析のための細胞の染色体 DNA に EdU など BrdU チミジン類似体を組み込みます。線虫 c. エレガンスのヌクレオシド アナログ エドゥ規則的な文化の中にワームに送られ、蛍光技術と互換性のあります。線虫 c. エレガンスの生殖細胞は透明、遺伝子、減数分裂前期や細胞分化/配偶子形成で発生するので、経路、幹細胞、減数分裂、および細胞周期をシグナル伝達の研究の強力なモデル系、線形アセンブリのようなファッション。これらの機能は、エドゥ サイクリング有糸分裂細胞と生殖細胞の発生の動的側面を勉強する素晴らしいツールを確認します。このプロトコルが正常に野生型に餌をエドゥ細菌を準備する方法をについて説明しますc. の elegansの両性具有、両性の生殖腺を解剖、エドゥの DNA 混入のため様々 な細胞周期を検出する抗体で染色し、発達のマーカーは生殖腺をイメージし、結果を分析します。プロトコルでは、さまざまなメソッドおよび S 相インデックス、M フェーズ インデックス、G2 期間、細胞周期期間、減数分裂のエントリの率および減数分裂前期の進行の率の測定のための分析について説明します。このメソッドは、細胞周期や他の組織、段階、遺伝的背景、および生理的条件でセルの歴史を研究する合わせることができます。

DNA 合成はエドゥを組み込む必要があるので 1 つはエドゥ ラベル核がエドゥ ラベル時間ウィンドウの中に S 期を受けたと判断できます。1 つは解剖の時に S 段階の核として細菌というラベルの付いたエドゥと 30 分授乳のラベル核を解釈かもしれません。もはや連続教育実験を給餌、ラベル核早く時間ウィンドウで、左の S 期以降に可能性がありますが、ラベル付けや教育期間の後半部分にラベルが場合があります。エドゥの信号を共同 DAPI 信号をローカライズします。他の核エドゥ信号を 1-2 明るい点 (図 4) にローカライズいくつか核エドゥ信号すべての染色体、カバーします。おそらく、これらの点が S 段階13後半複製 x 染色体です。
ここでは、動物がいた 30 分間継続的にエドゥにうんざりし、解剖、上記と図 5で説明したよう。成功した教育は、...

イメージング手法の説明 S 相を識別し、チミジンを使用して線虫の両性生殖における細胞周期ダイナミクスの分析に使用できるアナログ教育。このメソッドは、遺伝子を必要とせず、免疫蛍光染色と互換性のあります。

Cell cycle analysis in eukaryotes frequently utilizes chromosome morphology, expression and/or localization of gene products required for various phases ...

この方法は、C.elegansの細胞周期および生殖細胞集団の動態に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、トランス遺伝子を必要とせず、免疫蛍光染色と互換性があり、多くの異なる条件下で細胞を研究するように改変できることです。私は最初にこの方法がSchedaラボで使用されているのを見たとき、私は非常に興奮していました。この方法は、C.elegans細胞周期に関する洞察を提供することができますが、老化、栄養、または遺伝子型の変化に関するより広範な質問にも適用できます。一般的に、この方法に新しいラボは、最初の特異性またはC.elegansヘマトキシリン染色に苦労する可能性があります。M9バッファーの100ミリリットルに10ミリモルEdUの200マイクロリットルを追加する無菌技術を使用して始め、そして新鮮な一晩MG 1693大腸菌培養の4ミリリットルに適切なサプリメント。特異な作りは、EdU とチミジンの補充の微妙なバランスを必要とします。.チミジンの量は大腸菌が十分に成長するのに十分でなければならないのに対し、EdUの量はレベリングに対する堅牢なシールドに十分でなければならない。摂氏37度と200RPMで24時間を超えなくなった後、無菌技術を使用して、遠心分離のために2〜4個の無菌50ミリリットル円錐管の間で培養を分割します。新鮮なM9バッファーのペルチン4ミリリットルを再懸濁し、同じピペットを使用して、個々の室温60ミリリットルM9 Aガードシャーレの中心にEdUラベル付けEColi MG1693溶液の約8滴を適用します。線虫にEdU標識細菌を供給するには、新鮮なPBSを使用して、線虫増殖培地皿からC.Elegansを1.5ミリリットルのチューブに洗浄し、動物が重力によって短時間沈着できるようにします。PBSの1ミリリットルで動物を1〜2回洗い、ガラスパスツールピペットを使用して、PBSの小さな一滴でEdU芝生の中央に線虫を転送します。液体が吸収されるまで数分待ち、実験プロトコルに従って摂氏20度で少なくとも30分間培養を行います。インキュベーションの最後に、2ミリリットルのPBSを使用して、EdU培養プレートからガラス解剖皿にワームを洗い流します。先に説明したように線虫性腺の解剖と固定化の後、0.1%トゥイーン20を補ったPBSで小さな1ミリリットルのホウケイ酸ガラス管と長いガラスパスツールピペットをすすいで、ピペットを使用して少量のPBSツイーーンで固定ゴナドをチューブに移します。遠心分離によって生殖腺を収集し、ゴナドペレットを乱すことなく、できるだけ多くのスーパーナテントを除去するために、長く、引き出されたガラスの牧草地ピペットを使用しています。EdU検出のために、100マイクロリットルのクリックEdUカクテルを生殖腺に加え、室温で30〜60分間インキュベーションするために実験室フィルムでチューブを覆います。インキュベーションの最後に、反応リンスバッファーの100マイクロリットルで1回、PBSトゥイーンの1ミリリットルで4回生殖腺を洗浄します。最後の洗浄後、DAPIを添加した25マイクロリットルのアンチフェード実装媒体をサンプルに加えます。培地が生殖腺の上に落ち着いている間、大きな2.5%のアガロースパッドを標準的なガラス顕微鏡スライドの上に置きます。その後、2番目のスライドで平らにします。次に、長いガラス製のパスツールピペットを使用し、ピペットの狭い先端に液体と生殖腺のすべてを保持して、パッドに生殖腺を移す際のサンプル損失を最小限に抑えます。爪楊枝に接着したまつげを使用して、アガロースパッドの上に生殖腺を配布し、ほこり粒子を取り除きます。その後、ゆっくりと長方形のガラスカバースリップを生殖腺に下げ、気泡を避けるように注意し、ラボ組織で余分な溶液を取り除きます。3次元のセルを確実に数えるには、いくつかの練習が必要です。フィジーのセルカウンタープラグインとスクリプトのようなスクリプトを使用して、セルに重複を削除するマークを付けると、カウントを再現しやすくなっています。カバースリップが一晩落ち着くようにした後、セルカウンタープラグインとフィジーを使用して各核を手動でカウントし、ホスホヒストン3 EdUまたはプレジェネターゾーンセル標識の有無に応じて個々の核にラベルを付けます。EdU 信号は DAPI 信号と共にローカライズします。いくつかの核では、EdU信号はすべての染色体をカバーし、他の核では、EdU信号はS相後期に複製されるX染色体上の可能性が高い1〜2つの明るいパンクタに局地する。正常な30分標識からのEdU信号は、プレジェネタゾーン内の核の約半分に局地化する。この技術は野生型の若年成動物では一貫して機能しますが、交尾した5日間の雌雄同体のかなりの部分は、30分間のEdUパルスでラベル付けに失敗します。G2の持続時間は、時間経過でEdU陽性であるM相の核の割合を分析することによって推定することができ、G2の中央値および最大持続時間の計算を可能にする。G2およびG1の持続期間は、EdU陽性であるプレジェネターゾーン核の全ての割合から推定することができ、組み合わされたフェーズの最大持続時間の計算を可能にする。この手順を試みる際には、実験間の変動を最小限に抑えるために、同じ EdU 皿のバッチを使用することを忘れないでください。この手順に従って、追加の抗体による染色のような他の方法を、細胞周期、細胞運命、またはシグナル伝達経路に関する追加の質問に答えることができます。核酸アナログやパラフェルメルダハイドの操作は危険であり、ニトロール手袋を着用するなど、常にこの手順を実行する間に予防措置を講じるべきであることを忘れないでください。

cell-cycle-analysis-c-elegans-germline-with-thymidine-analog

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

我々は、細胞分裂の2つの連続ラウンドを定量化するために、成体マウスの組織へのチミジン類似体（CldUとIDU）のシーケンシャル取り込みを検出するための戦略を導出している。この戦略は、細胞の寿命の長い組織の売上高は、発癌性形質転換、またはトランジット増幅細胞を検出するのに便利です。...

一次組織の二つのチミジン類似体の免疫蛍光検出（CldUとIDU）

細胞集団の細胞周期の位置を決定する、または信号が増殖にどのような影響を与えるか理解する、容易にこのプロトコルを使用してフローサイトメトリーによって測定することができる。我々は、細胞を染色し、細胞周期内の位置を定量化するための簡単​​な実験的なアプローチを報告する。...

哺乳動物細胞における細胞周期の位置の解析

妊娠マウスにおけるチミジンのEdUおよびBrdUの二類似体の投与は、胚性マウス脳の神経細胞および前駆細胞における細胞周期進行の分析を可能にする。この方法は、脳の発達の間に、電離放射線を含む遺伝毒性ストレスの効果を決定するために有用である。...

神経幹細胞の細胞周期の進行を評価し、マウスでの前駆細胞は、遺伝毒性ストレス後の脳の開発

ここでは、(細胞周期)キナーゼのミトコンドリア局在を研究する方法と、その亜ミトコンドリア位置と潜在的なミトコンドリア基質/標的を決定する方法を概説します。タンパク質のミトコンドリアへの強制発現は、目的のタンパク質のミトコンドリア局在の機能的影響を研究するための有用なツールを提供します。...

ミトコンドリア局在と原子力細胞周期キナーゼ、Cdk1のの機能を研究するための実験的アプローチ

ここでは、C.エレガンスの発生過程を追跡し定量化する方法を示しています。提示されている方法は、簡単に実装できるオープンソースのツールに基づいています。3D細胞形状モデルの再構築方法、細胞内構造の手動追跡方法、皮質収縮流の解析方法などを実演します。...

の発達過程を追跡し、定量化<em&gt; C。エレガンス</em&gt;オープンソースのツールを使用しました

我々は、細胞周期の特定の段階に関連する事象を研究するための状況を提供する2つの細胞同期プロトコールを報告する。我々は、このアプローチが、摂動のない細胞周期または細胞周期に影響を及ぼす薬剤への暴露で特定の遺伝子の調節を分析するのに有用であることを示す。...

2つの相補的細胞同期プロトコルによる細胞周期制御遺伝子発現の研究

線虫生殖.の三次元再構成のための自動化手法を提案します。本手法は、数と生殖と生殖細胞蛋白質の分布の解析と細胞骨格構造内にある各核の位置を決定します。...

核の分布、蛋白質および細胞骨格を研究する線虫生殖細胞の解析

提示されたプロトコルは、フローサイトメトリーを使用して、培養マウスエンターイドにおける増殖細胞および死細胞の数を定量化する。この方法は、オルガノイドの増殖および生存に対する薬物治療の効果を評価するのに役立つ。...

腸内細胞増殖細胞および死細胞の定量化

5-エチニル-2'-デオキシウリジン(EdU)およびホスホヒストンH3(pH3)標識による細胞周期解析は、広範な最適化を必要とし得る多段階の手順である。ここでは、異なる細胞周期段階で細胞を区別するための画像解析および定量化を含む、この手順のすべてのステップを説明する詳細なプロトコルを提示する。...

5-エチニル-2'-デオキシウリジン/ホスホヒストンH3細胞周期進行解析用二重標識プロトコル

出芽酵母における5-エチニル-2'-デオキシウリジンの取り込みを用いたS期持続時間の決定

学ぶ EdUを用いたC. elegans雌雄同体生殖腺における細胞周期解析法。トランスジェン不要で免疫蛍光染色と併用可能であり、S期細胞の同定と細胞動態の解析に有用です。老化や栄養研究への応用も期待されます。

チミジンアナログエドゥと線虫の生殖における細胞周期解析

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