Name: 前に、最初の初乳の授乳後細胞ストレスと新生児ラットにおける離散のオキシトシン分泌脳核の炎症を評価します。 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-14T14:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: 学ぶ新生児ラットの脳核分離法で、初乳授乳後の細胞ストレスとオキシトシン分泌脳核の炎症を評価します。この手法は神経発達と栄養ストレス応答の研究に有用です。

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著者は、このプロトコルの準備に彼らの支援のマノン レンジャーとアレクサンドラ ・ シュルツをありがとうございます。

本研究は、動物介護制度とコロンビア大学、ニューヨーク州立精神医学研究所利用委員会によって承認されました。
1. ティッシュの準備
<ol><li>ベンダーからタイミング妊娠ラットを注文します。</li>
	<li>続くタイミング妊娠ラット到着後数週間で成長している腹部を観察し、その後、ケージを調べることによって出産予定日に子犬を探してすべての 2 h 配信が開始されるまで。</li>
	<li>处置 p 子犬 (白いミルク腹がない明白な腹部を表示しているとき) または後 (その時点で白の胃が表示されます自分の腹部に) 発動を促された子犬の最初のフィードの最初のフィードの前に彼らの尾、timeli に従って手袋をはめた手で子犬を削除します。ne (図 S1)。 注: 最初の初乳フィード; 子犬をプライミングと呼ばれるしたがって、この子犬はその後初乳プライミングしている最初のフィードまで先読みです。</li>
	<li>すぐに、シャープできれいな手術のはさみを使用して無麻酔の子犬の首をはねます。</li>
	<li>鼻に正中線と頭蓋骨の上面を皮膚を切断することによって脳を削除します。その後、鉗子を使用して、優しく詮索離れて脳 (図 1 a) を公開および前、骨板が削除されると、ペンでマーキング (図 1 b) をローカライズする骨。</li>
	<li>急速に室温室温 (図 1) でスライス コロナ ポリメチル ・ メタクリ レート脳金型に脳全体を配置します。</li>
	<li>、遅滞なく新鮮なかみそりの刃を使用して 500 mm の厚さにスライスします。(図 2) のセクションの方向を維持するためにペトリ皿で尾側吻側のスライスを置きます。</li>
	<li>すぐに (アプライド; 1.0 mM KH2PO4、26 mM NaHCO3、118.6 mM NaCl、KCl、3.0 mM 203.3 mM MgCl2-6 H2O) の人工髄液糖なしを追加し、常に攪拌の 28-30 ° C で 60 分のスライスを孵化させなさい、代謝と特異的に初乳プライミング組織対、处置 p 挑戦する軌道のシェーカー。</li>
	<li>ティッシュ セクションの脳アトラス33と解剖学的ランドマークを使用してパンチに必要な脳核を識別します。ペトリ皿に関心の核を持つこのスライスを置き、解剖顕微鏡に移動します。</li>
	<li>可視化、一度すぐに 4 6 の異なる核最適問題の核をパンチするサイズを選択する掘削ツールを使用して、一貫してサンプル (図 2) の間をパンチします。 注: 残りの脳スライス、脳組織が削除された穴がある今。使用して次の核を摘出し, 本研究では、座標の下。すべて前方/後方 (A ・ P) 座標は、NTS、ショウブ Scriptorius に関連してある) を除く前から。すべての背/腹 (D/V) 座標は、NTS、髄質の表面からである) を除く皮質の表面からです。次の座標を含める A/P、内側/外側 (M ・ L)、および mm D/V: 1) 孤束核 (NTS、A/P、0.4 から 0.8;± 0.2 LD/V、0.3 (髄質の表面) から、2) 室傍核 (PVN、-0.8; ± 0.2 0)、3) スープラ網膜 (-1.1 息子; ± 1.4; 4.3), 4) 皮質 (CX、部分的な皮質領域 1、-2.8; ± 1.5; 0.6), 5) 線条体核 (STR、-0.0; ± 1.6 1.8)、6) 内側 preoptic核 (MPO、-0.6; ± 0.2 4.2)。</li>
	<li>急速に (手順 2.3 参照) 60 分のプロテアーゼ阻害剤・ フォスファターゼ阻害剤を含む、氷、タンパク質抽出バッファーの 0.06 mL でパンチの核を浸します。</li>
</ol>2. 蛋白質の抽出
<ol><li>予想される子犬配信前日にタンパク質溶解キット (資材表) を使用して蛋白質抽出溶液を準備します。</li>
	<li>解凍 (氷上) 換散バッファー キットのホスファターゼとプロテアーゼ阻害剤の水溶液の凍結 (-20 ° C)、氷の上の換散バッファーとプロテアーゼ/ホスファターゼ阻害剤の DMSO 溶液を配置します。</li>
	<li>きれいな冷たい 15 mL チューブに 1.85 mL の溶解バッファーを追加します。次に、阻害剤の水溶液と DMSO 溶解阻害剤 0.05 mL の 0.1 mL を追加します。最後に、キャップと簡単に渦管使用まで-20 ° C でそれを保つ。</li>
	<li>溶解手順 24 のきれいなマイクロ遠心チューブ用 (0.5 mL) のラベルを付けます。初乳处置 p グループ (U) 【 6 左 (L) と 6 の右側 (R) 脳核 】 と核の頭字語によるとラベルのための脳につき指定 12 管側し、条件 (e.g。 NTS L U、NTS R U、等)。初乳先読みサンプル 12 チューブの 2 番目のグループにラベルを付けます。</li>
	<li>ステップ 2.4 株式蛋白質のエキス (1.5 mL エッペン型チューブを使用して)、(0.5 mL チューブを使用して) サンプル準備の最初のセットでチューブの 2 つの追加セットのラベルを付けます。これらの管を 2 つ別のラベルが付いた凍結ボックス (それぞれ 100 管用に設計された) にしてください。1 つのボックスは、处置 p サンプルおよびプライミングのサンプルの他に使用されます。</li>
	<li>子犬は、配信日に氷溶解液を解凍し、アプライドで脳スライスを抱卵中溶解手順に因数 0.06 mL 換散解決方法 (ステップ 2.4) から管し核パンチを追加し、60 分氷で孵化させなさい。</li>
	<li>14000 rpm (10,000 x g) で冷却ミニ遠心機で 30 分間インキュベートした分離核を遠心し、慎重に正しく設定ピペットで上澄みの 0.055 mL を吸引します。(ステップ 2.5) から予冷の 1.5 mL のストック チューブに上清を転送し、氷の上に置きます。(-20 ° C) で蛋白質のストック チューブの凍結、前に (ステップ 2.5) から最初のサンプル準備のため 0.5 mL の予冷管清 0.012 mL に転送、氷の上にそれらを残します。</li>
</ol>3. 毛細血管でタンパク質の測定の前処理
<ol><li>キットを使用し、製造元の指示に従って分離試薬を準備します。標識蛋白質のエキスの 0.012 mL を含む氷の上 (ステップ 2.5) からチューブ 0.5 mL で 12 個の試料のそれぞれにマスター ミックス試薬の 0.003 mL を追加します。</li>
	<li>95 ° C に加熱ブロックをオンにし、手順 3.1 0.016 mL の脱イオン水で管内のビオチン化分子 (MW) はしごで試薬の 0.004 mL を追加します。はしごとサンプルの変性、95 ° C、5 分で熱ブロックではしごチューブと处置 p タンパク質抽出物の 12 のサンプルを配置使用するまで 4 ° C で保存します。</li>
	<li>初乳で刺激したラットからパンチ核試料調製に蛋白質の抽出から 2.0 に 3.2 の手順を繰り返します。</li>
</ol>4 電気泳動の準備
<ol><li>ビオチン標識、ベンチ (-80 oC でディープ フリーザーに格納) 剤を解凍し、製造元の指示に従って 4 ° C で氷の上タンパク質検出キットを用意します。</li>
	<li>過酸化水素の 0.15 ml ルミノールの 0.15 mL をミックスし、25 の井戸 (行 E、井戸 1-25) 西部機械用プレートに 0.01 mL を読み込みます。ストレプトアビジン-HRP の 0.008 mL をキットから D25 に井戸 D1 に読み込む</li>
	<li>C25 と B1 C1 を井戸に抗体希釈液 0.01 mL をロードします。</li>
	<li>チューブ キャップから、minicentrifuge での蒸発させた水をプールに 24 の蛋白質のサンプルおよび梯子チューブ簡潔に (2、3 秒) をスピンします。</li>
	<li>井戸 A2 A13、A25、A14 井戸に 12 初乳先読みサンプル 0.003 mL とも A1 にビオチン化はしごの 0.005 mL 12 处置 p サンプルの 0.003 mL に読み込みます。</li>
	<li>F の行を空のままにし行 F. カバー、プラスチック製のふた付きプレート残りの手順中に蒸発を避けるために以下の 3 行の各 5 区画のそれぞれに 0.45 mL の洗浄バッファーを読み込みます。</li>
	<li>簡単に渦解凍ビオチン標識剤およびその指定管に試薬の 0.15 mL を追加それに総蛋白溶解剤 0.15 mL を追加し、均一に混ぜます。</li>
	<li>プレートからカバーを取り外し、エージェント 1 と 2 の 0.01 mL を B25 に井戸 B2 に読み込みます。プレートをカバーし、様々 なソリューションから空気の泡を削除する 1,000 x g で 10 分間遠心します。バランスをとるのための遠心分離機の空板を使用します。</li>
</ol>5. 電気泳動
<ol><li>プレートが回転しながら、総蛋白質の試金を実行する「ファイル」からドロップダウンのページに示す、それぞれのスポットをクリックすると自動西部機械に接続されたコンピューターで実行ファイルを開きます。</li>
	<li>コンピューターの井戸によってサンプルの注釈を付けます。遠心分離機削除カバーからプレートを削除し、慎重に分離ソリューションのコンパートメントからアルミのカバーをはがします。</li>
	<li>自動化された西洋楽器でプレートを置き、キャピラリー カートリッジ ボックスからカバーを剥がし、その指定された場所にカートリッジを挿入して、ドアを閉めます。</li>
	<li>「実行」ボタンをクリックしてし、試金 (「総蛋白質」) のタイプのメッセージが表示されたら、サンプルの名前を入力 (たとえば、"2-13 と初乳プライミング 14-25" 处置 p)。"OK"をクリックし、活性化の実行日付と実行ファイルの ID 番号でメッセージが表示されたら、実行を終了する時刻のメモしておきます。</li>
	<li>(開始後 170 分) の実行の最後に、楽器の扉を開く、キャピラリー カートリッジを取り外し、シャープ処理に破棄します。生物学的問題の処分でプレートを破棄します。</li>
	<li>実行ファイルの解析ページの分離曲線アイコンをクリックし、すべてのサンプルが正常に実行がすべて毛細血管で複数のタンパク質の曲線を示していることを確認します。</li>
</ol>6. シグナル伝達タンパク質の解析
<ol><li>ラベル付き 1.5 mL チューブに抗リン eIF2a (p eIF2a) 抗体ウサギの 0.003 mL を追加し、抗体希釈適切な検出キットから 0.3 mL (1: 100 希釈) にそれを中断します。その後、氷の上それを保ちます。</li>
	<li>ルミノール チューブにラベルを付けるとこの検出モジュール キットから 0.15 mL ルミノールと過酸化物 0.15 mL を追加し、新鮮な自動化された西部のプレートの E25 に井戸 E1 に 0.01 mL を分注します。</li>
	<li>抗うさぎ抗体 D25、D2 井戸に二次 0.01 mL を塗布し、よく D1 にキットからストレプトアビジン-HRP の 0.01 mL を追加します。</li>
	<li>C25、C2 の井戸に (ステップ 6.1) から一次抗体の 0.01 mL を分注、C1 および B1 B25 からの井戸に抗体希釈 2 液 0.01 mL を追加します。</li>
	<li>空行 F 井戸のまま F 行の下 3 行の 5 区画に 0.45 mL の洗浄バッファーを記入してください。</li>
	<li>3 冷凍のサンプルを簡単にスピン s、A25 に A2 から始まって、総蛋白質の試金のため追加された順序と同じ順序で行 A に各サンプルの 0.003 mL を追加。A1 をよくし、プレートをカバーするビオチン化 MW ラダーの 0.005 mL を追加します。</li>
	<li>4.8 のステップでは、プレートを遠心します。プレートが回転しながら (自動化されたウエスタン関連ソフトウェアとコンピューター) で新しい実行ファイルを開くし、それぞれのスポットをクリックして分子サイズ測定を実行する「ファイル」からドロップダウンのページで示します。</li>
	<li>試金のページで各毛管にサンプル名を入力し、割り当てられたスポットの下に二次抗家兎抗体一次抗体の名前を入力します。</li>
	<li>遠心分離の終わり、今回実行ファイルに与えられた名前は「p-eIF2a 处置 p 2-13、14-25 の初乳先読み」をする必要があります除いて手順 5.3-5.5 を繰り返します。</li>
	<li>電気泳動分離後 40-43 kDa のサイズで抗原の免疫反応のピーク時に実行ファイルをチェックします。MW のピークのこのサイズが不足しているは、曲線の下を右クリックし、サイズとカーブの下の任意の量を記録することにより、ピークに MW を追加するドロップダウン リストの内部を示します。</li>
</ol>7. 結果を処理します。
<ol><li>開く自動ウエスタンで全体蛋白質のためのスプレッドシート ファイルを実行ファイルを実行し、ID 番号を提供します。</li>
	<li>曲線モードで解析ページで総蛋白質の試金の実行ファイルを開き、個々 の毛細血管でのすべてのピークをマークします。その後、コピー、スプレッドシートに貼り付けることと全体の毛細血管に記録されているすべてのピークの曲線の下の領域の合計します。</li>
	<li>別の列にキャピラリー数、それぞれ脳核と実行ファイルの ID 番号の名前と各列のタンパク質の総量を手配します。</li>
	<li>P eIF2a 抗原の単一の列のスプレッドシートを開き、それぞれのキャピラリー数、脳神経核、および実行ファイルの ID 番号の名前各キャピラリー サイド ・ バイ ・ サイドから曲線の下の領域を記録します。</li>
	<li>総蛋白列 (p eIF2a 曲線量に平行) を第 3 のスプレッドシートにコピーし、p を計算-3 番目の列の eIF2a:total 蛋白質の比率。</li>
	<li>手順 4 ~ 6 各脳核から結果を収集、核のグループでそれらを整理、バー グラフを生成します。</li>
</ol>

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離散の顕微解剖法、新生児ラット脳における脳核 OTR は、本稿で提示されます。脳内のよ特徴付けられた核内であっても、ニューロンを専門性の高いことも認識されます。特定の OTR の豊富な核を分離するこの再現性の高い方法により、堅牢な仮説のテストします。自動ウェスタンブロッティングを使用して、一貫性と結果の再現性がさらに向上。この技法の制限のまま適度な脳パンチ変動;このテクニックは、単一セル、全脳や脳スライス アプローチに対する事前を表します。単一セルのアプローチは、非常に限られたスナップ ショットを提供することによって複雑になります。脳全体を使用すると、任意の結果を効果が脳の領域や神経細胞サブタイプの制限場合希釈可能性があります。レーザーマイクロダイ セクションなし脳スライス アプローチは、特に明瞭な核のタイトなクラスタ リングのための本の研究では視床下部に問題があるスライスは単なるミクロン以内の結果の深遠な可変性を導入できます。標準化されたパンチと顕微鏡の援助を使って、蛋白質測定の変動が減少しました。
このプロトコルではいくつかの重要な手順があります。最初のフィードに関して組織収穫...

日-週に産後のコース上に発生する初期の脳の発達の理解と対照をなして比較的少し知られている無数のラットでの生活の最初の数時間で発生する動的な変更について。重要な課題は、ラット新生仔脳と離散脳領域または単一の細胞を分離するハイテク ツールのための要件の小さなサイズをされています。研究は、遺伝子の転写と翻訳ではない1,2, 活性化シグナル伝達分子の機能レベルのしっかりした理解を与えていないしばしば評価します。他の人は表現のレベル3の定量化のため許可しない参照脳領域に免疫組織化学を使用して式を調べます。これまでの研究はラットの最初初乳の迅速単離と犠牲と蛋白質の表現、蛋白質のリン酸化を使っている西の測定を要求する離散脳のフィードに関連付けられているシグナルの活性化は検査されません。しみが付きます。古いより大きい頭脳の脳レーザーマイクロダイ セクションが実行、間ない P0 脳の非単一細胞脳パンチを実行する参照を同定しました。比較的小規模なサンプルの蛋白質の表現を測定する比較的ローテクなパンチ法とウエスタンブロット プロシージャを用いた新生児の脳の制限された領域を分離するためのプロトコルを提案する.このプロトコルは蛋白質の表現およびポスト翻訳の修正の評価を必要とする研究課題に適した可能性があります (e.g、リン酸化)、任意の種の小さな脳の比較的制限された地域で提供する、。ユーザーは、アトラスと明確な目標物興味の脳の領域を視覚的に識別できます。
この技術は、フィード、オキシトシン (OT) が豊富である新生児ラットの最初の初乳の結果として脳の変化を理解するために開発されました。OT は、ミルクの失望と子宮の収縮を刺激するために、その能力の長い知られています。しかし、OT は今多くの身体機能や動作4規制の役割の広い範囲を再生する知られています。たとえば、OT が胃排出遅延、腸の通過を遅くにストレスと適応の親和行動5と組み合わせて炎症に反対します。OT 受容体 (OTR) は、腸溶性ニューロンと腸上皮6,7,8で識別されています。OT の消化管の効果は、出生後早期の間に幼児に特に重要です。例えば、母乳は新生児の腸9,10OT の大量の配信に関連付け、データ表示、OTR 大きくにおいて過剰発現十二指腸絨毛ミルク哺乳期間8時。
そのオキシトシン シグナリング経路11,12ストレスに重要な分子を調節してタンパク質の翻訳で規制の役割を果たして、細胞レベルで実証しているの腸細胞株を用いたin vitro実験12. これらの研究は、母親からの外因性のオキシトシンを含む牛乳の成分、細胞ストレス13を減らすために新生児の小胞体ストレス応答に重要な示唆しています。
体内と体外の研究は、初乳 OT が新生児ラットの腸絨毛における細胞ストレス応答、炎症、およびオートファジーのマーカーを調節することを示しています。新生児の腸内細菌叢に初乳14,15と OT9などのホルモンを含む多数の蛋白質の母親から腸を同時に公開する場合の内腔側に実質的なの細胞圧力に苦しむ,10,16。
脳に OT の効果は、研究17をされています。しかし、出生後早期に腸内で示した OT シグナリング メカニズム脳に研究されていません。本稿で新生児ラット脳幹と視床下部の電気泳動を用いた離散脳核を分離するためメソッドを使用して、分離脳の領域をプロファイルします。このメソッドの全体的な目標は、細胞内情報伝達の脳領域誕生、最初のミルクは最小のグリア ・ ニューロン インデックスの脳組織で、授乳の前後にできるだけ近い状態をキャプチャすることです。この技術の開発のための根拠は、自動化された西部のしみを使用して前のヴィヴォ研究のためのニューロンより均質なコレクションと新生児子犬に制限された、微細な脳領域の急速な隔離のためできます。方法論は、比較的小規模な解剖サンプルに非常に一貫した結果を提供しています。前の仕事の欠点 (脳スライスまたは全脳) 総郭清より古い動物18,19を含まれます。若い子犬の脳は、非常にダイナミック、グリア分化を生れの後の波を搭載します。子犬の最初の供給によって影響を受け脳変化を研究するために再現可能な郭清を伴う制限された神経細胞核を勉強が必要です。
脳の発達中の脳の領域への影響はほとんど勉強したに対し、牛乳フィードは通常 (たとえば、腸20,の21)、健康や遺伝子発現への免疫学的および栄養の影響を分析します。腸コレシストキニン受容体迷走リレー脳幹核が細胞内シグナル伝達経路22参考腸に牛乳輸送が脳機能に及ぼす影響を調べた。妊娠23日中に母親の栄養失調に発展途上の新生児脳の脆弱性に関する膨大な文献があるが、ストレスと炎症シグナルは扱われません。重要なは、現在のメソッドは、内臓刺激の迷走神経の中継から初乳の血生まれる刺激を分離する日ゼロ ラット新生児における現象の活用します。これは孤束の未熟な核 (NTS) によって特徴付けられるいわゆるストレス低刺激応答性期間-国税庁、室傍核 (PVN) を制限する出生24,25の直後に視床下部の回路と視索上核 (SON) は、血生まれる刺激に通知します。
このメソッドは複数のシグナル伝達経路の分析に役立つ、脳組織は母親が挑戦されているかどうかに加えて、または治療の任意の種類ではなく、ラットの生後日 0 で収穫される神経細胞に比較的制限妊娠中。リットルは、pre-feeding 信号対フィード初乳の影響を分析できます。豊富な蛋白質収量の比較と脳領域間の信号を比較すると、このメソッドは、毛細血管が蛋白質の抗原の免疫定量と並行でポリペプチド バンドの総蛋白質の毛細血管に決定をできます。このメソッドは、標準的な定量曲線なし同じ抗体と毛細血管あたり総蛋白への参照によって得られた結果の任意の単位を使用して、定量的な比較をできます。異なった抗体によって得られた結果を比較することは、定量的標準曲線を使用して可能です。
このメソッドは、双方向の両方の器官の26の機能に影響を与える可能性、腸と脳との間で発生するシグナル伝達の評価できました。近年27で広範囲にわたって研究されてきた、オキシトシンと食物の摂取の間の関連付けは、増加オキシトシン シグナリングと栄養アベイラビリティの間のリンクをサポートします。これらの研究は、赤字は、視床下部のオキシトシンがシグナル伝達の削減と結合エネルギー コンバース概念もサポートします。
OT の脳活動に及ぼす影響の以前の研究では、迷走神経切断術28耐火が視床下部の PVN、扁桃体、および梨状皮質における Cfo 転写を誘導腸の炎症に誘発を示した。ただし、セクレチンと OT の全身投与は腸28で誘発される炎症反応に対する脳の Cfo 反応を減少しました。これは外因性の OT の効果はおそらくエリア後野6,29を介して運ばれる血液媒介性シグナル分子で、迷走神経のリレー以外のルートで実施された提案しました。
本研究では、腸内で以前に観察した細胞ストレスのシグナル伝達経路は脳で評価されました。順番に及ぼす脳機能、乳成分、保護、又は微生物やその他の代謝物、腸の透過性におよぼす炎症を延期しました。IkB で明確な拮抗の違い BiP シグナリング初乳13によるプライミングの前後に絨毛が見つかりましたと提案を開発する過程で、まだ新生児の脳がこれらの腸の免疫誘導信号を感じるかもしれない。
小胞体ストレスに関連付けられている以前の腸実験で使用されるシグナリング蛋白質のマーカーを測定しました。彼らは小胞体シャペロン BiP、翻訳開始因子 eIF2a (ストレス応答インテグレーター30となる)、eIF2a キナーゼが含まれて-PKR、および 2 つの炎症シグナル伝達蛋白質 (NF kB とその阻害剤、IkB)。
六つの脳領域が分泌する、または OT に応答する大人の能力に基づいて選ばれました。上部髄質にある国税庁は、内臓の入力の最初のリレーで腸31とサイトカインは、おそらく血液生まれて、毒素、隣接する野32を介してホルモンで迷走神経の感覚ニューロンから直接信号を受け取る。PVN、視索上核 (SON), 線条体核 (STR)、大脳皮質 (CX) と内側視索前野核 (MPO) 国税庁を介して腸から信号を受信します。
その結果、細胞ストレス応答初乳プライミング前、PVN と息子と比較して国税庁で異なるが摂餌開始直後すぐ産後の期間中CX のシグナリング、STR と MPO 異なって PVN と息子同様。細胞ストレスと腸内の炎症を調節する前に示した OT の明確な保護機能、脳のいくつかの領域によって検出される可能性が高い。まとめて、データを示す細胞レベルで出産後、最初の時間の間に脳に応答する代謝ストレス栄養不足に関連付けられています。データも表示範囲とフィード初乳の変調効果の方向が地域依存性であること、および彼らの腸の例で示した OT 効果ミラー、いくつかの地域では。

<table><tbody><tr><td>Bradford solution</td><td>Bio Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Protein lysis kit</td><td>Protein simple</td><td>CBS403</td><td>Bicine/CHAPS</td></tr><tr><td>WES kits</td><td>Protein simple</td><td>WES-Mouse 12-230 マスターキット (PS-MK15), WES-Rabbit 12-230 マスターキット (PS-MK14), WES 12-230 kDa total Protein master kit (PS-TP07),</td><td></td></tr> <tr><td>anti-mouse IgG HRP conjugate</td><td>Protein simple</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rabbit抗リン酸化eIF2a</td><td>細胞シグナル伝達技術</td><td>SER51, 9721</td><td></td></tr><tr><td>マウスmAb抗PKR</td><td>細胞シグナル伝達技術</td><td>2103</td><td></td></tr><tr><td>ウサギ抗リン酸化PKR</td><td>Millipore</td><td>Thr451, 07-886</td><td></td></tr><tr><td>ウサギmAb抗PKR</td><td>細胞シグナル伝達技術</td><td>12297</td><td></td></tr><tr><td>ウサギmAb抗GAPDH</td><td>細胞シグナル伝達技術</td><td>2118</td><td></td></tr><tr><td>マウスmAb抗リン酸化IKB</td><td>細胞シグナル伝達技術</td><td>9246</td><td></td></tr><tr><td>マウスmAb抗IKB</td><td>細胞シグナル伝達技術</td><td>4814</td><td></td></tr>ウサギ抗<tr><td>BiP</td><td>細胞シグナル伝達技術</td><td>3183</td><td></td></tr>ウサギ抗<tr><td>GCN2</td><td>細胞シグナル伝達技術</td><td>3302</td><td></td></tr>ウサギ<tr><td>mAb抗リン酸化GCN2</td><td>BIORBYT</td><td>T899</td><td></td></tr><tr><td>妊娠Sprague-Dawleyラットチャー</td><td>ルズリバーラボラトリーズ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>パンチデバイス</td><td>WellTechラピッドコアまたはハリスユニコア</td><td>0.35、0.50、0.75、1.0、1.20、1.50</td><td></td></tr></tbody></table>

前に、最初の初乳の授乳後細胞ストレスと新生児ラットにおける離散のオキシトシン分泌脳核の炎症を評価します。

Assessing Cellular Stress and Inflammation in Discrete Oxytocin-secreting Brain Nuclei in the Neonatal Rat Before and After First Colostrum Feeding

このプロトコルの目的は、最初の初乳の授乳の前後に新生児の脳でオキシトシン受容体豊かな脳核を分離することです。西部にしみが付くことを使用して脳核分離株における代謝ストレス応答する知られていた蛋白質の発現を測定しました。これは、体内代謝ストレス誘発性の栄養不全が神経ストレスをトリガーするかどうかを評価するために行われました。以前新生児の栄養不全が腸内代謝ストレスを引き出すことができた。さらに、初乳オキシトシンは、最初のフィードの前後前に新生児ラットの腸絨毛における細胞ストレス応答、炎症、およびオートファジー マーカーを変調します。小胞体ストレスに関連付けられている蛋白質のマーカーをシグナリング [小胞体シャペロン結合免疫グロブリン蛋白質 (BiP) 真核生物翻訳開始因子 2 a (eIF2a) と eIF2a キナーゼ蛋白質キナーゼ R (p PKR)]、2 だけでなく、炎症シグナル伝達蛋白質 [核因子 κ B (NF kB) および阻害剤 κB (IkB)] 新生児脳核測定した [孤 (NTS)、室傍核 (PVN)、スープラ網膜神経核 (息子)、野 (CX)、線条体核 (STR) の核と内側視索前野核 (MPO)] 最初のフィード (初乳处置 p) の前に (初乳によってプライミング) 看護の開始後。Bip/grp78 と p eIF2a の発現はプライミング NTS 組織、处置 p で亢進とダウンレギュ レート。NF kB は、NF kB が低いとそのまま国税庁、PVN と息子の両方の条件に対し CX、STR と MPO の細胞質 (高) 保持されました。集団 BiP と p eIF2 所見は、ストレス応答と一致しています。eIf2a はだった息子、CX、STR、MPO で dsRNA 依存型キナーゼ (PKR-p) によりリン酸化されます。ただし、国税庁 (および PVN でより少ない程度に)、eIf2a は別のキナーゼ、一般制御 nonderepressible 2 キナーゼ (GCN2) によりリン酸化されます。いくつかの OTR の豊富な脳領域でミラー化される以前新生児の腸上皮細胞に見られるストレス変調構造が表示されます。国税庁、PVN 可能性があります他の地域から別のリン酸化機構 (栄養不足) 下を利用し、栄養不足の影響に抵抗性であります。総称して、このデータは、初乳プライミング上皮細胞からのシグナルによって栄養不足ストレス脳応答をオフセットすることを示唆しています。

総蛋白に対する免疫反応性の代表的なバンド示す非常に低い収穫された蛋白質と脳核。標準的な西部のしみに比べて高感度である自動化された西部のしみの技術の使用が必要です。このアプローチは、西部のしみのレーンあたりと比較して毛細血管あたり fortyfold より少ない蛋白質を実行できます。
差分脳核 BiP レベルに及ぼす初乳プライミング
ラットの頭脳のコロナ セクションは、初めての給餌 (準備万端) 前後送り (处置 p) 最初の初乳に収穫されました。サンプル (ウェス) のキャピラリー電気泳動で分画されましたし、毛細血管で総蛋白染色 (プロトコルを見なさい) キットを使用して蛋白質の定量を行った。自動化された西部の追加免疫キャピラリー分別には、それぞれの蛋白質の抗原の同定が用意されています。図 3 a...

ここでは、最初の初乳の授乳と組み合わせて新生児ラット脳における脳核を分離するプロトコルを提案します。この技法は、上皮細胞のシグナリングを用いた変調、脳の栄養不足ストレスの研究をできます。

The goal of this protocol is to isolate oxytocin-receptor rich brain nuclei in the neonatal brain before and after first colostrum feeding. The expression ...

この方法は、ミルク吸引が脳内のストレスシグナル伝達に影響を与える方法について、出生後の発達分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術は、最初の自然飢餓期間中に特定の脳領域をキャプチャし、最初の自然初乳フィードの直後にそれぞれの領域と比較するために使用することができます。吸引が行動や感情の生理学にどのような影響を与えるかを理解することで、元生体内脳組織分析中に様々な受容体に対するアンタゴニストの使用が可能になります。核パンチを得るために、手袋をした手で尾でラットの子犬を取り除きます。脳を収穫した後、迅速に室温でポリメチルメタクリレート脳型に臓器全体を配置し、すぐに組織の500マイクロメートルの厚いスライスを作るために新しいカミソリの刃を使用します。スライスのロストラルをペトリ皿に置き、セクションの正しい方向を維持します。脳全体が切り離されると、ブドウ糖のない人工脳脊髄液を素早く皿に加え、28~30°Cで60分間、軌道シェーカーで一定の攪拌を行います。各組織に脳アトラスと解剖学的ランドマークを使用して、パンチされる脳核を特定し、新しいペトリ皿に関心のある核を持つスライスを解剖顕微鏡の下に置きます。一度視覚化したら、4~6個の異なる核を素早く打ち抜き、プロテウス阻害剤とホスファターゼ阻害剤を含む適切な標識されたマイクロ遠心分離管に各パンチ核を0.06mLの氷冷タンパク質抽出バッファーに迅速に浸漬します。インキュベーションの終わりに、抽出した核を冷却されたミニ遠心分離機で遠心分離し、マイクロピペットを使用して、各チューブから適切な予熱1.5mLマイクロ遠心分離管に0.055mLの上清を慎重に移します。マイナス20°Cの貯蔵前に、各タンパク質ストックチューブから、最初のサンプル調製のために氷上の適切な0.5 mL事前冷却チューブに上清の0.012 mLを移します。毛細管内タンパク質測定用のサンプルを準備するには、0.5 mLラベルチューブ内の各サンプルに、タンパク質のリシスキットから0.003 mLのマスターミックス試薬を追加します。次に、0.016 mLの脱イオン水中のビオチン化分子量ラダー溶液に0.004mLのマスターミックス試薬を加え、ラダーとタンパク質抽出サンプルを摂氏95度の熱塊で変性させ、5分後にすべてのチューブを摂氏4度で保存します。シグナルタンパク質分析のために、新しい自動化された西洋プレートのウェルE-1からE-25、D-25への二次抗マウス抗体の0.01 mLに作りたてのルミノール過酸化物溶液0.01 mLを加え、キットからD-1-ウェルに0.01 mLのストレプトアビジン・ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼを加える。作製した初等抗体の0.01 mLをC-25にウェルC-2に加え、0.01 mLの抗体希釈液をウェルC-1とB-1からB-25に加えます。行Fウェルを空のままにし、F行の下の3つの行の5つのコンパートメントを0.45 mLの洗浄バッファで満たします。次に、冷蔵サンプルを30秒間簡単に回転させ、各サンプルの0.03 mLをA-2から始めて行Aの各ウェルに追加します。その後、ビオチン化分子量ラダーの0.005 mLをA-1ウェルに加え、遠心分離のためにプレートを覆います。プレートが遠心分離されている間、自動化された西洋関連ソフトウェアで新しい実行ファイルを開き、分子サイズアッセイを開始します。アッセイページでは、サンプル名を各毛細血管に入力し、一次抗体と二次抗体の名前を入力します。遠心分離の終わりに、自動西洋の器具にプレートを置き、キャピラリーカートリッジボックスからカバーを剥がします。遠心分離の後、毛細管の気泡が電気泳動電流を遮断し、ラウンド全体に失敗する可能性があるため、気泡がないか検査することを忘れないでください。カートリッジを器具内の指定位置に挿入し、ドアを閉めます。[開始] をクリックします。アッセイの種類を求められたら、適切なテキストボックスに実験の名前を入力し、[大丈夫]をクリックします。アクティブ化された実行日付と実行ファイルの ID 番号が表示されたら、実行が終了した時刻をメモします。走行の終了時に、キャピラリーカートリッジをシャープ処分に廃棄し、プレートを生体有害物質の処分に廃棄します。電気泳動分離後、リン酸化真核生物翻訳開始因子2Aを表す40〜43キロダルトンで抗原の免疫反応性ピークを実行ファイルで確認します。このサイズの分子量のピークが欠落している場合は、カーブの下を右クリックし、曲線の下のサイズと任意の量が記録されるように、ピークに分子量を追加を選択します。未形成組織サンプル内では、孤独なトラックの核中の結合アミノグロブリンタンパク質レベルは、他のすべての領域と比較して有意に高い。初乳を有する腸組織のプライミングは、孤独なトラックの核中の結合性アミノグロブリンタンパク質レベルを減少させ、パラベントリク核および超光学核に影響を及ぼさない。逆に、プライミングは、未形成組織に対する皮質内の結合性アミノグロブリンタンパク質レベル、ストリエーション核および内側プレオプティック核を増加させ、種々の試験された脳核における結合性アミノグロブリンタンパク質レベルが腸のプライミングに異なる反応を示すことを示唆し、試験された様々な核間のクロストークはまだ実証されていない。真核翻訳開始因子2Aおよびリン酸化真核生物翻訳開始因子2Aレベルは、他の核に対して未形成状態で上昇する。プライミング後、真核翻訳開始因子2Aおよびリン酸化真核生物翻訳開始因子2Aの両方のレベルは、未プライメーション組織と比較して、孤独なトラックの核に対して減少する。他のすべての試験核において、プライミングは、真核生物翻訳開始因子2Aおよびリン酸化真核生物翻訳開始因子2Aのレベルを未プライメーション組織に対して増加させる。しかしながら、リン酸化タンパク質キナーゼ受容体のレベルは、単一のトラックの核におけるプライミングされたサンプルに対して、未プライミングサンプルにおいて低く、真核翻訳開始因子2Aのリン酸化に別のキナーゼが関与していることを強く示唆している。その開発後、この技術は、出生後の発達の分野の研究者が、組織の成長と分化に関与するシグナル伝達経路と、それらが吸引の影響を受けるか独立しているかを探求する道を開いた。例えば、ジチオスレイトールのような揮発性還元剤を使用すると危険であり、この手順を準備する際には、化学フード内の準備などの予防措置を常に取るべきであることを忘れないでください。

assessing-cellular-stress-inflammation-discrete-oxytocin-secreting

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

我々は、神経内分泌機能と遅延の長期的、誇張された恐怖反応、PTSD患者の特性に永続的な変化を明らかにする心的外傷後ストレス障害（PTSD）のラットモデルを記述します。動物モデルとここで説明する方法は、機械論的であるが、末梢白血細胞におけるバイオマーカーと、患者で測定することができない脳核中のバイオマーカー、缶を相関させるために有用である。...

PTSDの、ニューラル血液学的および行動的相関関係を明らかにするための動物モデルにおけるバイオマーカー

このビデオは、新生児ラットの脳からオキシトシン受容体に富む核の分離を示しています。コロナルスライスとそれに続くオキシトシン受容体に富む脳核の同定と精密なパンチングにより、オキシトシン受容体に富む核を効果的に抽出し、さらなる分析を行うことができます。...

新生児ラット脳からのオキシトシン受容体リッチ核の単離

この記事では、げっ歯類の授乳のモデル産後うつ病や不安に動物行動学関連パラダイムとして慢性常駐侵入社会的ストレスの使用について説明します。...

げっ歯類の授乳でモデル産後うつ病への慢性的社会的ストレスを使用

本論文では、ラットの子の触覚刺激および神経形態のその後ゴルジコックス染色のための手順を説明します。触覚刺激は、家庭用ダスターで子犬をなでることで周産期に投与され、肯定的な経験である。ゴルジCOX染色は全体のニューロンの可視化を可能にする信頼性のある手順です。...

ゴルジコックス染色で樹状形態とシナプス接続に関するポジティブ初期の経験、触覚刺激の効果を可視化する

慢性前立腺炎/慢性骨盤痛症候群の前臨床モデルを誘導するために、新生児の母体の分離 - 私たちは、初期生活ストレスパラダイムを受けた雄のC57BL / 6マウスの前立腺におけるperigenital機械的感度および肥満細胞の活性化を測定しています。...

新生児母子分離のマウスモデルにおけるPerigenital感度と前立腺肥満細胞の活性化の評価

ストレスの多い生命事象は認知機能を損ない、精神疾患のリスクを高める。このプロトコルは、男性と女性のスプレイグ・ドーリーラットのパラダイムをシフトする自動化されたオペラ戦略を使用して、ストレスが認知の柔軟性にどのような影響を与えるかを示しています。特定の行動の根底にある特定の脳領域について議論し、結果の翻訳関連性を探求する。...

オペラ戦略シフトパラダイムを用いた認知の柔軟性に対するストレス効果の評価

慢性心理社会的ストレス(CGS)パラダイムは、母親と乳児の精神疾患をモデル化するために、マウスで妊娠中に臨床的に関連するストレータを採用しています。ここでは、このモデルを検証するためにCGSパラダイムとダウンストリーム評価を適用するステップバイステップの手順を提供します。...

母親と乳児の精神疾患に対する翻訳的に関連するパラダイムとしての妊娠における心理社会的ストレスのマウスモデルの使用

ここでは、早産ラットモデルを作成するための簡潔なプロトコルを提示し、出生後早期の疼痛管理に関する研究を促進します。この方法では、出産予定日の3日前に帝王切開を行い、子宮摘出術によって早産ラットの子犬を摘出し、代理母の生物学的子孫と統合します。...

疼痛研究のための早産ラットモデル

マウスにおける上行性膣感染症、早産、および新生児罹患率のモデル化

このプロトコルは、出生後初期の貧困環境と予測不可能な母親のケアによって引き起こされる幼少期の逆境が、脳の発達と精神障害の将来のリスクにどのように影響するかを研究するための動物モデルを示しています。...

マウスにおける幼少期の逆境のモデルとしての限られた寝具と営巣

この記事では、早期妊娠炎症が神経発達に与える影響を研究するための母体免疫活性化(MIA)マウスモデルを生成する包括的なプロトコルを提供し、信頼性と再現性を確保するための主要な指標も含めています。...

妊娠前の炎症が神経発達に与える評価のための早期妊娠母体免疫活性化マウスモデルの生成

学ぶ新生児ラットの脳核分離法で、初乳授乳後の細胞ストレスとオキシトシン分泌脳核の炎症を評価します。この手法は神経発達と栄養ストレス応答の研究に有用です。

前に、最初の初乳の授乳後細胞ストレスと新生児ラットにおける離散のオキシトシン分泌脳核の炎症を評価します。

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