Name: 思春期の発症を確認マウスおよびラットの不妊治療法を実行することで生殖能力の決定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: 学ぶマウスおよびラットの思春期発症を非侵襲的に評価する手法。包皮分離と膣開大を指標に生殖能力を決定し、遺伝的要因による不妊の診断に応用可能です。

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この文書の基礎である初期の作品への貢献の著者に感謝します。おかげでアイトール アギーレ, ジュヌビエーブ E. ライアンとエリカ L. ソエラーさんの原稿を準備をお手伝い。ジェシカそらリーとオースティンあごに原稿に関する技術的な支援ありがとう。H.M.H. は、ユーニス · ケネディ · シュライバー国立衛生研究所の子 & 受賞番号 R00HD084759 の下で健康の国民の協会の人間の開発によって支えられました。

ここで説明したすべてのメソッドは機関動物ケアおよび使用委員会のミシガン州立大学によって承認されケアと実験動物の使用のためのガイドに従って実施します。
1. 思春期の発症を決定します。
<ol><li>最低限の衣服制度ガイドラインに従ってください、きれいな白衣と清潔な手袋を着用する必要があります。常に清潔な手袋を着用してマウスを処理します。</li>
	<li>テーブルの上にパッドを配置することによって作業領域を準備します。<ol>
<li>パッドの上向きグリッドとクリーン マウス ケージ上部に配置します。</li>
		<li>作業領域のスケールを設定します。規模と風袋をクリーンの 500-1000 mL ビーカーを置きます。</li>
		<li>作業領域は、レコードの体重と包皮分離、膣開口部または最初の発情の横にシートを配置します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>研究用マウスを識別します。思春期に達するまで思春期発症の日常点検を実行します。研究を通して一日の同時検査を実行します。思春期の発症は早ければ生後 11 1219, 発生する可能性がしかし、最も実験的設定で思春期発症の監視が始まります 〜 22 日.</li>
	<li>(ステップ 1.2) 作業領域にマウス ケージを配置します。ケージを開き、テーブルの上のふた、水のボトル、食品ホルダーを配置します。</li>
	<li>雄マウスの包皮分離を決定します。<ol>
<li>尾、マウスを押しながらステップ 1.2.1 からクリーン マウス ケージ上に配置します。テールから軽く押し、ながら聞かせて 〜 5 のケージ上部のグリッドを探るマウス s。</li>
		<li>そっと尾を引いて後方。これは通常その脚でグリッドに保持しながら前進動物で起因します。皮膚へのアプローチ他の手には首と耳が近くです。</li>
		<li>肩と首を親指と人差し指の間のたるんだ皮膚を把握します。それは噛まないようにしてその頭を回ってからマウスを防ぐ、皮膚の良いホールドを得ることが重要です。</li>
		<li>残りの指で背中の皮膚をつかんで手を押すことによってそれを保持します。呼吸、血流、または有害な骨は、筋肉や皮膚を妨げることがなくしっかり保持します。手の手のひらにマウスの背中を支えながらマウスの腹を公開する手をオンにします。</li>
		<li>無料の手でゆっくり押し戻しますペニスの周りの皮膚を行わず。包皮分離で包皮の皮膚はスライド後方陰茎亀頭(図 2 a、包皮分離を示す矢印) を公開します。包皮分離の有無を記録します。</li>
		<li>ゆっくりステップ 1.2.2 から 500-1000 mL ビーカーにそれを配置することによって、マウスの重量を量る、重量を記録します。</li>
		<li>ケージの床にビーカー 0-2 cm を保持することによって住宅ケージ内マウスを再導入し、独自に終了するマウスを許可するビーカーの上ゆっくりとヒントします。きれいに水と中性洗剤でビーカーとスケールにそれを返すとスケールを風袋の前にそれを乾燥させる。</li>
	</ol>
</li>
	<li>雌マウスの膣に開口部を決定します。<ol>
<li>作業領域 (ステップ 1.2) に綿ボール、ビーカーと滅菌水のボトルを置きます。ビーカーに水を注ぐ。滅菌水でコットン ボールを湿らせるし、ステップ 1.2.1 からケージ上部の横に配置します。</li>
		<li>(ステップ 1.2) 作業領域でマウス ケージを配置し、尾の根元を持ち、ホーム檻からケージ上部 (ステップ 1.2.1) へマウスを転送します。軽くマウスの前方への動きを奨励する尾部を引き戻します。</li>
		<li>無料の指を使って腰をサポートしながら、尾を持ち上げます。ケージの上部が付いている接触を維持するために後肢を許可します。マウスがあまりにも多く、それを保持する、手 1.5.1-1.5.4 の手順で説明するように。</li>
		<li>ゆっくりステップ 1.6.1 から水加湿コットン ボールで外陰部をきれいに。各マウスのクリーン加湿コットン ボールを使用します。膣口、外陰部を検査、膣が完全に開いているかどうかを判断する (図 2 a、女性の膣口)。</li>
		<li>膣口が発生した場合に記録します。マウスの重さし、手順 1.5.6-1.5.7 で説明したよう、ホームのケージに戻る。</li>
	</ol>
</li>
	<li>最初の発情初回排卵のインジケーター。<ol>
<li>作業領域 (ステップ 1.2) に滅菌水、ラベルの付いたガラス スライド クリーン チップ 200 μ L ピペットとビーカーを置きます。</li>
		<li>手順 1.6.2-1.6.3 で説明したように女性を保持します。膣の開口部に滅菌水の 〜 50 μ L を含むピペットの先端を配置します。</li>
		<li>優しく膣壁から導入し、2-4 倍 〜 50 μ L の水を再吸収によってセルをフラッシュします。ラベルの付いたガラス顕微鏡スライド上にピペット チップからコンテンツを塗りつけます。</li>
		<li>慎重に 10 倍または 20 × 対物を用いた明視野顕微鏡で細胞の形態を観察または ~ 1 h の汚れセンサーをしましょうと、対比染色 (ddH2O に溶解) 0.1% メチレン ブルー溶液で (図 2 b)。0.1% メチレン ブルー溶液に乾燥したスライドを浸し、対比染色に 〜 30 s。スライドの空気を 1 時間乾燥してみましょう。</li>
		<li>ステップ 1.7.4 10 X、20 X の明視野顕微鏡のスライドを確認します。発情周期 (図 2 b) の 4 つの段階を区別することができる細胞の形態を観察することによって発情周期 (図 2 b)20のステージを確立します。 注: Metestrus は、白血球と核の上皮細胞と角化上皮細胞 (図 2 b) による発情の混合物によって角化扁平上皮細胞、白血球、白血球による発情、proestrus の混合物によって特徴付けられます。20。</li>
		<li>体重を記録し、手順 1.5.6-1.5.7 で示すように、その家のケージにマウスを返します。腟脂膏ときマウスが (図 2 b)、最初の発情日に終了します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 望ましい飼育部屋条件
<ol><li>飼育室が温度 20 〜 24 ° C、55 ± 10% の湿度と同種ルーム 300 〜 400 の強さの光ルクス床21の上方約 1 m。この光の強度には、望ましい 25 80 ルクスの中期ケージ光強度ことができます。光の強度をテストするには、照度計を使用します。</li>
	<li>実験全体の照明の適切なタイミングを確保するための飼育室で照明を制御するのに自動システムを使用します。光と 10 h の闇 (LD14:10) のための21の 14 h で「夏のような"条件に 12 h 日 (12 h 光と闇 12 h、LD12:12) からの齧歯動物の範囲で不妊治療を評価するために最適な日長条件。</li>
	<li>繁殖ケージを準備します。<ol>
<li>蓋、水、食糧、寝具および繁殖ペアあたりネスト クリーン マウス ケージを準備します。</li>
		<li>セックスを含むすべての必要な情報とケージのカード記入生年月日、マウス株とを交配を設定するときの日付。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 不妊治療研究
<ol><li>不妊治療研究に使用される動物を識別します。動物が性的に成熟した (ステップ 1) であることを確認します。マウスにおける不妊治療を設定する一般的に使用される年齢は、年齢は、ほとんどの実験条件で性的成熟が完了した、年齢 10-16 週です。</li>
	<li>きれいなテーブル ステップ 2.3 で準備飼育ケージを配置します。</li>
	<li>キャッチし、マウスを押したまま。<ol>
<li>ゆっくりとマウス ケージに手袋をはめた手を紹介します。手袋と手の香りに合わせてマウスを許可する短い期間 (5 ~ 30 秒)、ケージに手をおきます。多忙なぎくしゃくした動きを避けます。</li>
		<li>ケージの底に近いカップ状の手を下げ、ゆっくりとマウスにそれに近づきます。彼らはすぐに実行されます。手を実行するときは、親指と人差し指の間の 1 つのマウスの尾をトラップします。</li>
		<li>2-3 s の尾によってマウスを持ち上げます。マウスより長く保持される場合、尾を保持し、尻尾にホールドを維持するカップ状の手でマウスを置きます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>尾 (ステップ 3.3) でそれらを保持することによって繁殖ケージに 1 男性とその後 1 女性を転送します。不妊治療法を設定するとき、女性同じ発情期にいるを確認します。ステップ 1.7 に従って膣スミアを実行することによって、女性の発情期を決定します。</li>
	<li>ケージを閉じてマウスが食料、水、ネスティング材料を持っていることを確認します。ケージ ケージのカードとケージのカード ホルダーに取り付けます。</li>
	<li>ハウジング ラックに飼育ケージを配置します。不妊研究の全期間放置飼育ケージとしてできるだけ妨げられていません。30 日間の不妊治療の研究を行います。各繁殖ペアの詳細記録を保つし、1) セットアップ交配日、2) 出産した日、3) 死者と生きている子犬を含む生まれ、子犬の数に注意してください。研究を通して毎日トイレ チェックを実行します。</li>
	<li>不妊治療を長引かせる手順 3.6 で追加の 30-60 日ない場合や不妊治療に対する弱い影響の研究が確立されます。</li>
</ol>

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著者は、何を開示します。

マウスの全面的な福利は成功した不妊試金21にとって重要です。不妊治療法を実行すると、物理的にマウスを毎日チェックこれはストレスを引き起こす可能性があることが重要です。これらはストレスも、さらにケージの頻繁な変更を避けます。理想的には週に 1-2 回以上ケージの変更が行われます。暗い段階露光夜行性の齧歯動物の繁殖に悪影響します。暗い時間の間飼育室でライトを切らないでください。暗い時間の間に部屋にエントリが必要な場合赤薄明かりの照明を使用します。別のストレス過剰な悪臭、振動やノイズ研究のすべてまたは一部のビバリウムでの存在であります。ストレスの緩和し、マウスの健康と繁殖の向上が、濃縮の材料または他の型の入れ子マウスを与えます。巣作りはマウスで重要な動作で、繁殖成功を高めます。巣はまたマウスを非表示にし、再生する場所を許可します。健康で栄養状態が良く動物の品種がよく、したがって自由への高品質の食品と水を提供するために重要です。繁殖ペアなど皮膚炎 (c57bl/6 j で頻繁に)、歯の不正咬合等の疾患の症状を示すように開始する場合は、研究からこれらのマウスを除外します。さらに、研...

思春期までの移行は、性的成熟と生殖能力を達成するために必要です。思春期の転移と成人期の肥沃度の維持は、視床下部-下垂体-性腺軸 (図 1) とも呼ばれます、生殖軸によって調整されます。思春期発症のタイミングと肥沃度の維持が子孫、親1,2の生存の可能性を高めるための内部として環境要因によって堅く調整されます。このプロトコルはマウスおよびラット生殖能力を評価するために不妊治療研究を設定する前に性的に成熟を確認する思春期の発症を決定する非侵襲的なアプローチを提供します。
不妊治療研究性成熟動物でされるので、動物は思春期を経て後開始することができます。思春期の発症する前に生殖の軸は静止、思春期 (図 1) を開始する不十分な量で下垂体に性の成熟、性腺刺激ホルモン放出ホルモン (GnRH) のキーのドライバーがリリースされます。思春期の発症は、正中隆起の GnRH 放出の増加の結果複雑なプロセスです。GnRH は黄体形成ホルモン (LH)、卵胞刺激ホルモン (FSH) の分泌、下垂体から生殖腺の成熟と生殖機能 (図 1)3,4,5に不可欠な 2 つのホルモンを促進します。.
生殖軸への侮辱減らされた豊饒とも事前または遅延思春期発症することができます。内分泌撹乱化学物質6,7体の増加/減少体重1,8の変更への露出のような思春期の発症と生殖能力のタイミングに影響を与える知られている状況日長2,9と遺伝的変異10,11,12,13,14,15。
性的成熟度の発症は、不妊治療法を設定する前に完了する必要がある重要なステップです。採血や動物16,の犠牲を必要としない場合、包皮分離、腟口、最初の発情思春期発症の決定の利点はこれらのプロシージャの非侵襲的な特性17。
思春期の発症を決定したら不妊研究を正しく設定生殖軸の整合性に関する重要な情報を提供して通常 (改良) のさらなる研究のための実験動物の生成の 2 番目の利点は、18します。 このプロトコルで記述されている不妊治療研究のセットアップは男性と女性の生殖能力のマイナーおよびメジャーの赤字を検出できます。キー パラメーター評価 1) 最初のごみ、2) 所定の時間枠と 3) ゴミの大きさで生成リットル数時間が含まれます。最後に、フォロー アップの不妊治療障害の原因を識別するために行なうことができる研究の種類に関する推奨事項が含まれます。
記述されていたプロトコルはマウスと代表のデータ反映トランスジェニック マウスでの作業。ただし、含まれているすべてのプロトコルはラットで均等に有効です。

<table><tbody><tr><td>滅菌コットンボールフィ</td><td>ッシャー</td><td>22456885</td><td></td></tr><tr><td>表面保護剤</td><td>フィッシャー</td><td>1420637</td><td></td></tr><tr><td>露出計</td><td>VWR21800-014</td><td></td><td></td></tr><tr><td>メチレンブルー&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9140</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スライド</td><td>Genesee Scientific</td><td>29-101</td><td></td></tr><tr><td>ケージ付きオプティマウスラック</td><td>AnimalCare システム</td><td>C89100</td><td></td></tr><tr><td>ウォーターボトルバスケット&nbsp;</td><td>アニマルケアシステム</td><td>C61011</td><td></td></tr><tr><td>フィルター付きケージトップス</td><td>アニマルケアシステム</td><td>C78210</td><td></td></tr><tr><td>オプティマイススタンダードフィーダー</td><td>アニマルケアシステム</td><td>C40100SG</td><td></td></tr><tr><td>ケージカードホルダー</td><td>アニマルケアシステム</td><td>C43251</td><td></td></tr><tr><td>ケージカード</td><td>アニマルケアシステム</td><td>M52010</td><td></td></tr><tr><td>ボトルアッサンブリー</td><td>アニマルケアシステム</td><td></td><td></td>C79122P</tr><tr><td>ベッドR'Nestネスティング</td><td>アンダーソンズ</td><td>BRN4WSR</td><td></td></tr><tr><td>1/8 "コーンコブ寝具&nbsp;</td><td>アンダーソンズ</td><td>8B</td><td></td></tr><tr><td>標準マウスチャウ</td><td>テクラッド</td><td>7904(7004)</td><td></td></tr><tr><td>スケール</td><td>VWR10205-004</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ポリプロピレンビーカー</td><td>フィ</td><td>ッシャー14-955-111F</td><td></td></tr></tbody></table>

思春期の発症を確認マウスおよびラットの不妊治療法を実行することで生殖能力の決定

Determination of Reproductive Competence by Confirming Pubertal Onset and Performing a Fertility Assay in Mice and Rats

生殖能力の評価は、治療や生殖の軸は、視床下部-下垂体-性腺軸とも呼ばれますに遺伝子操作の影響を理解する重要です。生殖軸は再生のための有利な条件に不妊治療の適応環境と内部の入力のキー インテグレーターです。マウスおよびラットの不妊治療研究に着手、前に性的に成熟を観察される生殖表現型に起因する可能性を除外する評価遅延または不在の思春期発症。このプロトコルでは、膣口と最初の発情を女性、男性包皮分離の決断のもとで思春期の発症を評価する非侵襲的なアプローチについて説明します。思春期の補完と性的成熟度の達成の確認後不妊治療研究を開始できます。プロシージャには、マウスとラット、不妊研究をセットアップする方法を評価し、治療や遺伝子欠失の肥沃度の影響があるかどうかを判断するパラメーターに最適な飼育条件がについて説明します。

これらの結果は、転写因子腹側前部ホメオ 1 (Vax1) ヘテロ マウス (HET)13、またはVax1 とここで呼ばれる 1 つの対立遺伝子に全身でされている 2 つの異なるトランスジェニック マウス モデルから内 GnRH ニューロン22、ここで条件付き KO (cKO) と呼ばれる条件付きで削除されています。不妊治療研究を設定する前に、すべてのマウスで思春期の発症を確認することが重要です。
まず、日および腟口と包皮分離で重量は確立されました。ヘット マウスの腟口と包皮分離の同じ年齢とコントロール マウスのように体重で発生した (図 3 aとF、それぞれ)。対照的に、膣口と包皮分離大幅 cKO 女性と男性で遅延され、増加体重に...

多くの治療法や遺伝的変異性成熟と不妊治療のタイミングに影響を与えます。このプロトコルでは、マウスおよびラットの性成熟動物で不妊治療研究を設定する前に思春期の発症を評価する非侵襲的な方法について説明します。

Assessment of reproductive competence is critical for understanding the impact of a treatment or genetic manipulation on the reproductive axis, also ...

この方法は、前接分離、膣開き、および不妊治療研究を行う前に最初の発情を確立することによって、マウスおよびラットの思春期発症を決定する方法など、生殖分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、実証された非侵襲的アプローチを用いて思春期発症を確立することによって、性的に成熟した動物に従って不妊治療研究を行うことは可能である。この技術の影響は、内分泌破壊化学物質などの生殖能力に影響を与えやすい遺伝子変異または治療によって引き起こされる生殖障害の診断にまで及ぶ。この方法は、マウスの生殖能力に関する洞察を提供することができますが、ラットやハムスターなどの他のモデルシステムにも適用できます。この方法の視覚的なデモンストレーションは、良い、繊細な動物の取り扱いスキルを必要とするため、重要です。特に、以下の前置分離と膣開きの視覚同定のために、マウスを正しく保持することが重要である。作業領域を準備するには、テーブルの上にパッドを置きます。その後、グリッドを上に向けて、パッド上にきれいなマウスケージの上を置きます。次に、作業領域にスケールを設定します。スケールにきれいな500〜1000ミリリットルのビーカーを置き、それをつばきます。次に、ワークシートを作業領域の横に配置して、データを記録します。この後、マウスケージを作業領域に配置します。ケージを開け、蓋、水筒、食品ホルダーをテーブルに取り外します。尻尾でマウスを保持しながら、きれいなマウスケージの上に置きます。尾のホールドを維持しながら、マウスはケージの上のグリッドを探索することができます。尾を後ろ向きにそっと引っ張り、もう一方の手を首と耳に近い皮膚に近づけます。肩と首の間のゆるい皮膚を親指と人差し指でつかみます。その後、残りの指で背中の皮膚をつかみ、手にそっと押し付けてマウスを保持します。自由な手で、陰茎の周りの皮膚をそっと押し戻します。前接頭分離時に、前皮は後方に滑り、亀頭陰茎を露出する。検査後、前置分離の有無を記録する。この後、マウスの重量を量り、その重量を記録します。次に、ケージの床の上にビーカーを保持し、マウスが自分で出るようにすることによって、ハウジングケージにマウスを再導入します。作業エリアに綿球、大きなビーカー、滅菌水のボトルを置きます。ビーカーに滅菌水を注ぎます。次に、ビーカーに滅菌水を入れて綿球を加湿し、清潔なケージの上に置きます。マウスケージを作業領域に配置します。その後、尾の付け根でマウスを保持してケージの上にマウスを移します。マウスの尻尾を軽く引っ張り、マウスの前方移動を促します。この後、3本の指で腰を支えながら尾を持ち上げます。加湿した綿のボールで外陰部をきれいにし、外陰部を調べて膣が完全に開いているかどうかを判断します。膣の開口部が発生した場合に記録します。その後、マウスの重量を量り、ホームケージに戻します。マウスの飼育ペアごとに、ふた、水、食べ物、寝具、および入れ子材料を備えたきれいなマウスケージを準備します。その後、必要な情報をケージカードに入力します。準備した寝具ケージをきれいなテーブルの上に置き、手袋をした手をゆっくりとマウスケージに入れ、ケージに短時間放置します。手袋をした手でゆっくりとマウスに近づきます。マウスが手の上を走ったら、親指と人差し指の間でマウスの尾をつかみ、尾でマウスを持ち上げます。マウスは、最大2〜3秒間、体のサポートなしで尾で保持することができます。準備された飼育ケージにマウスを置き、オスマウスとメスマウスが食物、水、および巣の材料を持っていることを確認した後、ケージを閉じます。提示された方法を用いて、2つの異なるトランスジェニックマウスモデルが研究された。膣の開口および前形分離は、ヘテロ接合マウスおよび対照マウスの両方で同じ年齢および体重で起こった。逆に、膣の開口部と前の分離は、条件付きノックアウト女性と男性で有意に遅れ、体重の増加に関連した。4.5週齢で、女性のコントロールと条件付きノックアウトマウスは体重に匹敵し、条件付きノックアウトオスはコントロールよりもわずかに重かった。これは、経膣開口および条件付きノックアウトマウスの前体分離の遅延が体重増加の遅延と関連していないことを示している。思春期の発症が終わったら、不妊治療の研究は10〜16週で始まった。オスとメスのヘテロジゴテマウスの両方が亜肥沃であった。ヘテロジゴテ雌は3ヶ月間の研究で少ないごみを生成し、男性と女性のヘテロジゴトマウスの両方が小さなごみを生成しました。生殖アッセイを設定する前に思春期発症を確認することの重要性を説明するために、生殖能力は条件付きノックアウトマウスで評価した。70日間の不妊治療研究の間、条件付きノックアウト男性も女性もゴミを発生させました。この手順を試みる間、注意してマウスを扱い、動物に近づいて扱いながら落ち着いておくことを忘れないでください。この手順に従って、循環性ホルモンレベルを測定するような他の方法は、不妊症または他の不妊症が異常なテストステロン、エストロゲン、卵胞刺激ホルモン、および黄体形成ホルモンレベルによって引き起こされたかどうかなどの追加の質問に答えるために実行することができる。マウスを使用すると、噛み付きやアレルギーの発症のリスクがあるため、危険な場合があることを忘れないでください。露出を減らすために、手袋やラボコートの着用、マウスの注意深い取り扱いなどの予防措置は、この手順を実行する際に必ず服用する必要があります。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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マウスラウンド精子細胞注射

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思春期の発症を確認マウスおよびラットの不妊治療法を実行することで生殖能力の決定

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