Name: イメージング 2 光子生体顕微鏡を用いたインフルエンザ ウイルス感染症の中に気管粘膜の細胞相互作用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: 学ぶ2光子生体内顕微鏡法による気管粘膜の免疫細胞動態解析。インフルエンザウイルス感染時の好中球と樹状細胞の相互作用をリアルタイムで観察し、呼吸器感染症における免疫応答の理解を深める方法です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この作品は、スイス国民基金 (SNF) 補助金 (176124、145038, 148183)、欧州委員会マリー キュリー復帰グラント (612742) や D.U.P. への交付金の SystemsX.ch によって支えられた (2013/124)。

<ol><li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+tissue+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).</li>
<li>Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+magic%3A+multiphoton+microscopy+in+the+biosciences%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences.</a> Nature biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).</li>
<li>Fein, M. R., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caught+in+the+act%3A+revealing+the+metastatic+process+by+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Caught in the act: revealing the metastatic process by live imaging.</a> Disease Models & Mechanisms. 6 (3), 580-593 (2013).</li>
<li>Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+imaging+of+hippocampal+place+cells+at+cellular+resolution+during+virtual+navigation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation.</a> Nature Neuroscience. 13 (11), 1433-1440 (2010).</li>
<li>Cahalan, M. D., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choreography+of+cell+motility+and+interaction+dynamics+imaged+by+two-photon+microscopy+in+lymphoid+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Choreography of cell motility and interaction dynamics imaged by two-photon microscopy in lymphoid organs.</a> Annual review of immunology. 26, 585-626 (2008).</li>
<li>Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Decade+of+Imaging+Cellular+Motility+and+Interaction+Dynamics+in+the+Immune+System%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A Decade of Imaging Cellular Motility and Interaction Dynamics in the Immune System.</a> Science. 336 (6089), 1676-1681 (2012).</li>
<li>Coombes, J. L., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+of+host-pathogen+interactions+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging of host-pathogen interactions in vivo.</a> Nature Reviews Immunology. 10 (5), 353-364 (2010).</li>
<li>Pulendran, B., Maddur, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+Immune+Sensing+and+Response+to+Influenza%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Science+Journal%22%5BJournal%5D)">Innate Immune Sensing and Response to Influenza.</a> Life Science Journal. 6 (4), 23-71 (2014).</li>
<li>Lim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+trails+guide+influenza-+specific+CD8+%2B+T+cells+in+the+airways%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil trails guide influenza- specific CD8 + T cells in the airways.</a> Science. 349 (6252), (2015).</li>
<li>Kim, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+tracheal+epithelial+cells+in+mice+during+airway+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+respiratory+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of tracheal epithelial cells in mice during airway regeneration.</a> American journal of respiratory cell and molecular biology. 47 (6), 864-868 (2012).</li>
<li>Kretschmer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autofluorescence+multiphoton+microscopy+for+visualization+of+tissue+morphology+and+cellular+dynamics+in+murine+and+human+airways%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+investigation%3B+a+journal+of+technical+methods+and+pathology%22%5BJournal%5D)">Autofluorescence multiphoton microscopy for visualization of tissue morphology and cellular dynamics in murine and human airways.</a> Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 96 (8), 918-931 (2016).</li>
<li>Veres, T. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intubation-free+in+vivo+imaging+of+the+tracheal+mucosa+using+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Intubation-free in vivo imaging of the tracheal mucosa using two-photon microscopy.</a> Scientific Reports. 7 (1), 694(2017).</li>
<li>Looney, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stabilized+imaging+of+immune+surveillance+in+the+mouse+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung.</a> Nature. 8 (1), 91-96 (2011).</li>
<li>Thornton, E. E., Krummel, M. F., Looney, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Imaging+of+the+Lung%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Live Imaging of the Lung.</a> Current Protocols in Cytometry. 60 (1), (2012).</li>
<li>Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+of+the+murine+pulmonary+microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation.</a> Journal of Applied Physiology. 104 (2), 338-346 (2008).</li>
<li>Fiole, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+intravital+imaging+of+lungs+during+anthrax+infection+reveals+long-lasting+macrophage-dendritic+cell+contacts%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+immunity%22%5BJournal%5D)">Two-photon intravital imaging of lungs during anthrax infection reveals long-lasting macrophage-dendritic cell contacts.</a> Infection and immunity. 82 (2), 864-872 (2014).</li>
<li>Secklehner, J., Lo Celso, C., Carlin, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+in+historic+and+contemporary+immunology%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy in historic and contemporary immunology.</a> Immunology and Cell Biology. 95 (6), 506-513 (2017).</li>
<li>Lambrecht, B. N., Hammad, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+Dendritic+Cells+in+Respiratory+Viral+Infection+and+Asthma%3A+From+Protection+to+Immunopathology%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Lung Dendritic Cells in Respiratory Viral Infection and Asthma: From Protection to Immunopathology.</a> Annual Review of Immunology. 30 (1), 243-270 (2012).</li>
<li>Camp, J. V., Jonsson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+neutrophils+in+viral+respiratory+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">A role for neutrophils in viral respiratory disease.</a> Frontiers in Immunology. 8, (2017).</li>
<li>van Gisbergen, K. P. J. M., Sanchez-Hernandez, M., Geijtenbeek, T. B. H., van Kooyk, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+mediate+immune+modulation+of+dendritic+cells+through+glycosylation-dependent+interactions+between+Mac-1+and+DC-SIGN%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Neutrophils mediate immune modulation of dendritic cells through glycosylation-dependent interactions between Mac-1 and DC-SIGN.</a> The Journal of experimental medicine. 201 (8), 1281-1292 (2005).</li>
<li>Gonzalez, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capture+of+influenza+by+medullary+dendritic+cells+via+SIGN-R1+is+essential+for+humoral+immunity+in+draining+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Capture of influenza by medullary dendritic cells via SIGN-R1 is essential for humoral immunity in draining lymph nodes.</a> Nature Immunology. 11 (5), 427-434 (2010).</li>
<li>Lindquist, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+dendritic+cell+networks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+immunology%22%5BJournal%5D)">Visualizing dendritic cell networks in vivo.</a> Nature immunology. 5 (12), 1243-1250 (2004).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+V%CE%B39V%CE%B42-T+cells+efficiently+kill+influenza+virus-infected+lung+alveolar+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Human Vγ9Vδ2-T cells efficiently kill influenza virus-infected lung alveolar epithelial cells.</a> Cellular and Molecular Immunology. 10 (2), 159-164 (2013).</li>
<li>Tran Cao, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+transgenic+cyan+fluorescent+protein+%28CFP%29-expressing+nude+mouse+for+%26%2334%3Btechnicolor%26%2334%3B+cancer+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Development of the transgenic cyan fluorescent protein (CFP)-expressing nude mouse for &#34;technicolor&#34; cancer imaging.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 107 (2), 328-334 (2009).</li>
<li>Jaber, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose+regimens%2C+variability%2C+and+complications+associated+with+using+repeat-bolus+dosing+to+extend+a+surgical+plane+of+anesthesia+in+laboratory+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Association+for+Laboratory+Animal+Science+JAALAS%22%5BJournal%5D)">Dose regimens, variability, and complications associated with using repeat-bolus dosing to extend a surgical plane of anesthesia in laboratory mice.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science JAALAS. 53 (6), 684-691 (2014).</li>
<li>Pizzagalli, D. U., et al. Leukocyte Tracking Database, a collection of immune cell tracks from intravital 2-photon microscopy videos. Scientific Data. , In press (2018).</li>
<li>Sommer, C., Straehle, C., Kothe, U., Hamprecht, F. A. <a target="_blank" href="https://ieeexplore.ieee.org/document/5872394/">Ilastik: Interactive learning and segmentation toolkit.</a> 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. , 230-233 (2011).</li>
<li>Beltman, J. B., Marée, A. F. M., De Boer, R. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19834485">Analysing immune cell migration.</a> Nature Reviews Immunology. 9 (11), 789-798 (2009).</li>
<li>Keller, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motility%2C+cell+shape%2C+and+locomotion+of+neutrophil+granulocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+motility%22%5BJournal%5D)">Motility, cell shape, and locomotion of neutrophil granulocytes.</a> Cell motility. 3 (1), 47-60 (1983).</li>
<li>Sumen, C., Mempel, T. R., Mazo, I. B., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15357943">Intravital Microscopy.</a> Immunity. 21 (3), 315-329 (2004).</li>
<li>Lambert Emo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Imaging+of+Influenza+Infection+of+the+Trachea+Reveals+Dynamic+Regulation+of+CD8%2B+T+Cell+Motility+by+Antigen%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Live Imaging of Influenza Infection of the Trachea Reveals Dynamic Regulation of CD8+ T Cell Motility by Antigen.</a> PLOS Pathogens. 12 (9), e1005881(2016).</li>
<li>Kjos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bright+fluorescent+Streptococcus+pneumoniae+for+live-cell+imaging+of+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+bacteriology%22%5BJournal%5D)">Bright fluorescent Streptococcus pneumoniae for live-cell imaging of host-pathogen interactions.</a> Journal of bacteriology. 197 (5), 807-818 (2015).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

この作業は、マウスの気管にインフルエンザ感染に対して転送された好中球と DC との相互作用の移行を示す 4 D 画像の生成のための詳しいプロトコルを示します。説明 2 P IVM モデルは気道感染症における免疫細胞動態に関連します。
最近では、気道の細胞動態の可視化に基づくいくつかのモデルは先進9,10、11,12,13,14,15 をされています。 ,16。ただし、肺の生体内イメージングはまだやりがいのある、このオルガンと呼吸サイクル...

光子生体顕微鏡 (2 P IVM) は、彼らがその自然環境1で発生すると、リアルタイム イメージング細胞間相互作用のための効果的な手法です。この方法の主な利点の 1 つは他は従来のイメージング技術2と比較して試料の深さ (1 mm 500 μ m) で細胞プロセスの研究をできるということです。同時に 2 光子レーザーによって生成された 2 つの低エネルギー光子の使用は、画像集録プロセス2に通常関連付けられている組織の写真-損傷を最小限に抑えます。最後の十年の間にいくつかの分野3,4、5の細胞間相互作用の種類を勉強する 2 P IVM を適用されています。これらの研究は、特に彼らの高いダイナミズムと著名な連絡先の他の細胞と環境によって生成された信号を次の形成によって特徴付けられる免疫細胞を調査に関連するされています。2 P IVM は病原体とホストの6間の相互作用の研究にも適用されています。確かに、種類と、その結果、免疫応答7を妨げて免疫細胞間接触の期間、いくつかの病原体を変更できますは以前示されています。
気道粘膜は空輸の病原体に対する免疫応答が、最初のサイトは、8を生成されます。したがって、生体内でこの組織でホスト病原体の相互作用の解析は伝染の間にホストの防衛メカニズムの開始を理解する重要です。しかし、気道の 2 P IVM は主に画像の取得のプロセスを妥協する動物の呼吸サイクルによって生成される成果物のために挑戦。最近では、手術の異なるモデルは、イメージング マウスの気管9,10、11,12と肺13,14,15、について記載されています。 16。気管の 2 P IVM モデル肺肺胞 2 P IVM モデルが感染の後期の勉強するより適切な上気道における免疫反応の初期段階を視覚化するための優秀な設定を表します。肺を開発モデルを提示するレーザーの光の透過を制限し、肺の気道の粘膜を生体内でイメージ投射17 にアクセスできなくなる空気で満たされた肺胞の存在に関連付けられている制限.逆に、連続上皮によって形成された気管の構造は、画像の取得を促進します。
ここでは、インフルエンザの感染、動物の手術の準備、気管の 2 P IVM を実行に必要な手順の詳細な説明が含まれているプロトコルを提案します。さらに、好中球、樹状細胞 (DC) インフルエンザ ウイルス18,19 に対する防御機構の仲介人として重要な役割を果たす 2 つの免疫細胞の種類の可視化の特定の実験の設定を述べる.最後に、好中球 DC の相互作用を分析する手順をについて説明します。これらの連絡先は、DC の活性化を調節するために示されていると、その後20病原体に対する免疫応答に影響を与える。

<table><tbody><tr><td>Gigasept instru AF</td><td>Sch&uuml;lke &Mayr GmbH</td><td></td><td>4% solution</td></tr><tr><td>CD11c-YFP マウス</td><td>ジャクソン研究所</td><td>008829</td><td>マウスを自社で飼育</td></tr><tr><td>CK6-ECFP マウス</td><td>ジャクソン研究所</td><td>004218</td><td>マウスを自社で飼育</td></tr><tr><td>1x ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水 Choride と塩化マグネシウムを使わずに修飾</td><td>Sigma</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>10x ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水は、チョライドカルシウムと塩化マグネシウムなしで修飾</td>されます <td>Sigma</td><td>D1408-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Percoll PLUS</td><td>Sigma</td><td>E0414-1L</td><td>4°C で保存します。C</td></tr><tr><td>ケタミン ラバテック</td><td>ラバテック ファーマ</td><td>7680632310024</td><td>RT で保管、4 °C で保管。C ケット/キシル混合物の溶液中</td></tr><tr><td>ロンプン 2% (キシラジン)</td><td>バイエル</td><td>6293841.00.00</td><td>RT で保存、4 °で保存;C ket/キシル混合物</td></tr><tr><td>26 G 1 mL Sub-Q BD Plastipak</td><td>BD Plastipak BD Plastipak</td><td>305501</td><td></td></tr><tr><td>30 G, 0.3 mL BD Micro-Fine Insulin Syringes</td><td>BD</td><td>324826</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 40 &micro;m Cell Strainer</td><td>Corning</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>2 mL シリンジ</td><td>BD Plastipak</td><td>300185</td><td></td></tr><tr><td>Microlance 3x 18 G ニードル</td><td>BD</td><td>304622</td><td></td></tr><tr><td>Introcan Safety 20 G (カテーテル)</td><td>Braun</td><td>4251652.01</td><td></td></tr><tr><td>6 Well Cell Culture Cluster</td><td></td><td>Costar 3516</td><td></td></tr><tr><td>RPMI medium 1640 + HEPES (1x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>42401-018</td><td>4°Cで保管。C</td></tr><tr><td>リベラーゼ TL 研究用グレード</td><td>ロシュ</td><td>5401020001</td><td>-20 °C;C /コラゲナーゼ(IおよびII)混合物</td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Amresco(VWR)</td><td>0649-50KU-20</td><td>°Cで保存。C</td></tr><tr><td>CellTrace バイオレット染色</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C34557</td><td>-20°C;C</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>シグマ</td><td>EDS-500G</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td>-20 °C で保管。C</td></tr><tr><td>PE-10マイクロ医療用チューブ</td><td>2生物学的機器SNC</td> <td>#BB31695-PE / 1</td><td></td></tr><tr><td>外科用プラスチックテープ</td><td>Mプラスト</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ビスコティアーズ</td><td>ボシュ&</td><td></td><td>RT</td></tr><tr><td>粘土</td><td>Ohropax</td><td></td><td></td></tr><tr><td>高許容ガラスカバースリップ15ミリメートルラウンド</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td>64-0733</td><td></td></tr><tr><td>SomnoSuiteポータブル動物麻酔システム</td><td>ケントサイエンティフィック</td><td>SS-01</td><td></td></tr><tr><td>Nuvoライトマーク5</td><td>GCEメドライン</td><td>14111211</td><td></td></tr><tr><td>MiniTag(ガス状麻酔と加熱ベンチ)</td><td>テムセガ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>サージカルボード</td><td>ベルン</td><td></td><td></td>大学</tr><tr><td>トリムスコープII 2光子顕微鏡</td><td>LaVision Biotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chameleon Vision Ti:Saレーザー</td><td>Coherent Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>25X NA 1.05水浸対物レンズ</td>オ<td>リンパス</td><td>XLPLN25XWMP2</td><td></td></tr><tr><td>キューブ&ボックスインキュベーションチャンバーと温度コントローラー</td><td>ライフイメージングサービス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>イマリス 9.1.0</td><td>ビットプレーン</td><td></td><td>イメージングソフトウェア</td></tr><tr><td>GraphPad プリズム7</td><td>GraphPad</td><td></td><td>統計ソフトウェア</td></tr></tbody></table>

イメージング 2 光子生体顕微鏡を用いたインフルエンザ ウイルス感染症の中に気管粘膜の細胞相互作用

Imaging Cell Interaction in Tracheal Mucosa During Influenza Virus Infection Using Two-photon Intravital Microscopy

細胞または細胞病原体相互作用体内の分析は、感染に対する免疫応答のダイナミクスを理解する重要なツールです。2 光子生体顕微鏡 (2 P IVM) は、画像集録中に生成された退色を最小限に抑えながら生きている動物、深部組織の細胞の相互作用の観察することができます。日には、リンパ系および非リンパ系臓器の 2 P IVM のさまざまなモデルが記載されています。ただし、呼吸器官のイメージングは、動物の呼吸サイクルに伴う動きのための挑戦を残ります。
ここでは、体内の免疫細胞の相互作用気管内 2 P IVM を使用してインフルエンザ ウイルス感染マウスを視覚化するプロトコルについて述べる.この目的に、手術手技と好中球と粘膜上皮における樹状細胞 (DC) の動的な画像の取得に続いて、気管挿管が含まれてカスタム画像処理プラットフォームを開発しました。また、気管内のインフルエンザ経鼻感染と流れフローサイトメトリー解析免疫細胞の実行に必要な手順を詳しく説明します。最後に、映画のコースの中に好中球 DC 運動との相互作用を分析しました。このプロトコルは、気管の細胞間相互作用の評価に必要な安定性と明るい 4 D 画像の生成のためできます。

この作品で述べるvivoにおける詳細なプロトコル運動と好中球と DC の間の相互作用マウスの気管 (図 3 a) でインフルエンザ感染中。この目的を分離 CFP+好中球 (純度 92%;図 3 b)CK6 生さからマウスと我々 に対してそれらに転送 CD11c YFP マウスではインフルエンザに感染します。その後、我々 は接種後 3 日で気管の 2 P IVM を実行フローサイトメトリーによる解析 (図 3) で示すように、この時点では、感染部位に好中球の明確な募集を観察しました。2 P IVM プロトコル齧歯動物 (図 1 a) の特定の手術ボードと酸素供給器の使用が必要です。呼吸、気管の博覧会を促進し、制御する器官の動き (図 1 b...

本研究ではマウスの気管粘膜のインフルエンザ ウイルスに感染後 2 光子生体イメージングと細胞の相互作用の解析を実行するためのプロトコルを提案する.このプロトコルは、呼吸器感染症の中に免疫細胞動態を調査している研究に関連するされます。

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. ...

この方法は、呼吸器感染症中の免疫細胞の相互作用のダイナミクスに関する空気中の病原体に対する免疫応答の研究における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、簡単な手術全体で気管上皮の明るく安定した4D画像を取得できることです。この方法は、インフルエンザ感染時の好中球と溶解性細胞の相互作用に関する洞察を得ることができますが、さまざまな免疫細胞や空気中の病原体の研究にも適用できます。一般的に、この方法に不慣れな人は、安定した最小限の炎症を起こした手術を維持するのに苦労します。さらに、心臓の欠陥が存在するため、画像分析が難しい場合があります。鼻腔内インフルエンザ感染症の場合、麻酔をかけた6〜8週齢のCD11c-YFPマウスを仰臥位に置き、つま先をつまむことに反応しないことで深い鎮静を確認します。ピペットを左鼻孔の近くに置き、マウスが15マイクロリットルの全容量のPR8接種液を吸入するまで、約20秒間隔で小さな液滴を鼻腔に分注します。2〜5分後、同じ方法で15マイクロリットルのウイルスを右鼻孔に送達します。すべての接種物が送達されたら、マウスが正常に呼吸していることを確認し、動物を完全に回復するまで監視しながら、動物をケージ内の外側褥瘡に置きます。感染後3日後、トランスジェニックCFP発現マウスから大腿骨と脛骨の両方を切除し、鉗子で骨を優しく洗浄します。骨端を切断し、26ゲージの針を備えた1ミリリットルの注射器を使用して、滅菌された冷たいPBSで各骨から骨髄を氷上の50ミリリットルのチューブに洗い流します。骨髄がすべて採取されたら、針先から骨髄を数回吸引し、解離した細胞懸濁液を40マイクロメートルのストレーナでろ過します。遠心分離により細胞を回収し、ペレットを2ミリリットルの冷たいPBSに再懸濁します。次に、3つのPercollグラジエントのそれぞれを2ミリリットルずつ、15ミリリットルのチューブ内で、最も濃縮度の高いものから最も低いものへと慎重に重ねます。次に、遠心密度勾配分離のために、2ミリリットルの骨髄細胞懸濁液を上部の勾配層に慎重に追加します。遠心分離の最後に、64%および72%グラジエント界面からバンドを慎重に取り外し、好中球を冷たいPBSで洗浄します。次に、ペレットを氷上の新鮮なPBSの100マイクロリットルに再懸濁してカウントし、PBS濃度100マイクロリットルあたり5倍から6番目の細胞で細胞を再懸濁して、接種したCD11c-YFPレシピエント動物に静脈内注射します。養子縁組の移管から12時間後、麻酔をかけたレシピエント動物を37°Cの加熱面上のカスタマイズされた手術用ボードに置き、シェービングと脱毛クリームでマウスの首から毛を取り除きます。マウスをプラスチック製のマウスの位置の上に置き、頭を位置の外側にして気管の挿管を容易にする角度にし、前肢、足、尾をサージカルテープで固定します。目に軟膏を塗り、露出した皮膚を消毒します。次に、胸の上部と下顎骨の下端を通る線の間の首の内側軸に沿って1センチの切開を行い、皮膚パッチと唾液腺を横方向に動かして気管を視覚化します。鉗子を使用して気管を慎重に解剖し、カテーテルでマウスを挿管し、すぐに人工換気を開始します。サージカルボードのロッドに接続されたサージカルフックを使用して、カテーテルの高さと向きを固定し、気管をあごまで露出させます。気管をワセリンで囲み、温かいPBSを数滴垂らして気管を水分補給します。次に、カバースリップを金属製のホルダーに接着し、ホルダーをXYZトランスレーターにねじ込んで、カバースリップを手術用製剤の上に置きます。気管を適切に露出させて伸ばし、カバーガラスで軽く押すことで、イメージングのために組織を安定させることが非常に重要です。in vivoでのタイムラプスイメージングを行うには、2光子顕微鏡の摂氏37度のインキュベーションチャンバー内に手術用ボードを置き、カバーガラスに水を一滴加えます。セットアップを中央に配置し、気管組織に焦点を合わせた後、スキャン周波数を 800 ヘルツ、520 x 520 ピクセル、視野角 440 x 440 マイクロメートル、ライン平均 1 に設定します。チタンサファイアレーザーを励起蛍光色素に応じて適切な波長と出力パーセンテージに設定し、同時に励起する3Dおよびタイムラプス取得モードを設定します。次に、z軸に沿って50マイクロメートルの範囲を3マイクロメートルのステップサイズで定義し、30秒ごとに30分間画像を記録します。この実験設定に続いて、感染した気管内で30分間の追跡期間にわたって安定した4D画像をその場で撮影することができます。4D画像の解析により、樹状細胞と動員された好中球の動きとの間には大きな違いがあり、後者の方が有意に速い速度を示していることが明らかになりました。樹状細胞の複雑な形態は、細胞追跡に頻繁なエラーを引き起こし、その結果、測定された方向性挙動の持続時間が短縮され、分散が増加する追跡が生成されます。そこで、飛跡の持続時間を考慮して方向性を測定するための堅牢な指標を作成し、樹状細胞と比較して好中球の方向性に大きな違いがあることを明らかにしました。さらに、好中球と樹状細胞との間の距離を計算することで、時間の経過とともにそれらの接触を検出および分析することができ、この代表的な実験では、一部の好中球は樹状細胞と複数の短い接触を形成し、一部はイメージング期間中に樹状細胞と接触を形成しません。さらに、好中球と樹状細胞との間の距離の経時的な平均傾向を研究することで、細胞の全体的な位置の研究が容易になり、特定の細胞の傾向を調べることで、個々の細胞の挙動を特徴付けることができます。この手順がわかれば、気管のフローサイトメトリーなどの他の方法を実行して、感染した気管におけるさまざまな免疫細胞の動員の定量化と特性評価を評価できます。インフルエンザウイルス株を扱うことは、たとえマウスに適応したとしても危険である可能性があるため、すべての手順はバイオセーフティレベル2の条件下で実施する必要があることを忘れないでください。

imaging-cell-interaction-tracheal-mucosa-during-influenza-virus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

インフルエンザウイルスとの同時感染は無症候性の中に侵襲性肺炎球菌疾患の誘導に関与する要因の一つです。...

の間に相乗効果を調査するために生物発光イメージングを使用して肺炎球菌幼児マウスで>とインフルエンザウイルス

我々は、彼らが病原体を貪食や好中球細胞外トラップ（NETS）を生成しながら、感染肺における好中球顆粒球の動態の観察のために、2光子顕微鏡を使用する方法を、示しています。...

2光子顕微鏡を用いて感染肺における好中球による貪食とNET -形成の直接観察

我々は、胸腺の生体内イメージング買収のための新たな研究ツールとプロトコルを開発しました。我々の技術は、T細胞の開発が発生した胸腺内で"ニッチ"の同定に役立つはずです。...

2光子顕微鏡を用いてマウスの胸腺の生体内イメージング

Source: Wang, M., et al, Evaluation of T Follicular Helper Cells and Germinal Center Response During Influenza A Virus Infection in Mice. J. Vis. Exp. (2020).This video demonstrates intranasal infection of a mouse with a pathogenic influenza virus to establish a respiratory tract infection. The procedure outlines the administration of the virus into the nasal cavity. The virus enters host cells, replicates, and activates the immune system.

Intranasal Infection of a Mouse with a Pathogenic Influenza Virus

ヒトインフルエンザAウイルスの全身および局所的なゼブラフィッシュ感染モデルが示されています。全身感染モデルを用いて、ゼブラフィッシュは抗ウイルス薬のスクリーニングに使用することができます。局所感染モデルを使用して、ゼブラフィッシュは宿主免疫細胞の応答を特徴付けるために使用できます。...

抗ウイルス薬をスクリーニングし、宿主の免疫細胞応答を特徴づけるために、ヒトインフルエンザAウイルス感染のゼブラフィッシュモデルを使用して、

ここで導入されたプロトコルでは、体内の炎症性条件の下で主要な人間のリンパ球のホーミング肺活量の評価をことができます。アレルギー性炎症のマウス...

In Vivo 光シート顕微鏡観察に基づくアレルギー性炎症の実験的肺ホーミング ヒトリンパ球のイメージング高度な

逆紡糸円盤共焦点顕微鏡によるマウス小腸のインビタルイメージングを用いてGFP標識γΔ...

マウス小腸における上皮内リンパ球の分体イメージング

生体内蛍光顕微鏡は、白血球 -...

真空安定化イメージングシステムを用いた実験的急性肺損傷における肺微小循環の生体内広視野蛍光顕微鏡

ここでは、移植したマウスの左肺を2光子顕微鏡で生体内イメージングするプロトコールを紹介します。これは、マウス肺移植後の細胞動態と相互作用をリアルタイムで研究するための貴重なツールです。...

移植されたマウス肺の生体内2光子顕微鏡検査

このプロトコルは、IAVの鼻腔内投与およびマウス肺損傷および関連する肺細胞型への転写変化の下流分析の指示を提供します。...

インフルエンザ感染後の異形成および機能的肺胞修復のモデル化

ここでは、減衰BSL-2承認の 結核菌...

初期血管内感染中のマウス肺における減弱型自生 性結核菌 のインバイタルイメージング

学ぶ2光子生体内顕微鏡法による気管粘膜の免疫細胞動態解析。インフルエンザウイルス感染時の好中球と樹状細胞の相互作用をリアルタイムで観察し、呼吸器感染症における免疫応答の理解を深める方法です。

イメージング 2 光子生体顕微鏡を用いたインフルエンザウイルス感染症の中に気管粘膜の細胞相互作用

さらに動画を探す

イメージング 2 光子生体顕微鏡を用いたインフルエンザ ウイルス感染症の中に気管粘膜の細胞相互作用

さらに動画を探す

イメージング 2 光子生体顕微鏡を用いたインフルエンザウイルス感染症の中に気管粘膜の細胞相互作用