Name: ブルー ネイティブ電気泳動によってチラコイド膜タンパク質複合体の解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-28T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: 学ぶブルーネイティブ電気泳動によるチラコイド膜タンパク質複合体の解析法。Arabidopsis thalianaを用いて光合成タンパク質複合体の組成と動的構造を解明し、環境変化への適応性を評価する。

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この研究の財政上支えられるフィンランド アカデミー (プロジェクト番号 307335 と 303757) および太陽エネルギーによってバイオマス (SE2B) - キュリー ・ スクウォドフスカ助成契約を締結 (675006)。プロトコルは、参考3に基づいています。

1 BN を準備するゲルの1,2,3
<ol><li>8 cm × 10 cm プレート (矩形ガラスとアルミナの切欠きプレート) 0.75 mm スペーサーを使用して製造元の指示に従ってゲル キャスターを設定します。</li>
	<li>撹拌プレート上グラデーション ミキサーを置き、ペリスタルティック ポンプ チューブで接続します。注射針をチューブのもう一方の端に接続し、ガラスとアルミのプレート間針を配置します。「重い」(H) に場所マグネチックスターラーの商工会議所。</li>
	<li>分離ゲル グラデーションの 3.5% (v/v)、12.5% (v/v) 15 mL コニカル遠沈管にアクリルアミド (AA) ソリューションを準備 (表 1のレシピを参照してください)。早すぎる重合を防ぐためには、ソリューションを準備している間氷上遠沈管を保ちます。 注意: アクリルアミドは神経毒性や発癌性、摩耗防護服と手袋です。</li>
	<li>グラデーションのミキサーにソリューションをピペッティングする前に 5 %temed と AP の権利を追加します。H チャンバーに 12.5% 溶液をピペットで移しなさい。<ol>
<li>ソリューション L チャンバーへの入力を許可する 2 つの部屋をつなぐ弁を開くことによって「光」(L) と H 室を接続するチャネルから空気の泡を削除します。ソリューションのトレース バック H 室にバルブとピペットを閉じます。</li>
		<li>最後に、ピペット L チャンバーに 3.5% ソリューション。</li>
	</ol>
</li>
	<li>磁性攪拌器のスイッチ (撹拌速度が、重要ではありませんが、それは重いと光ソリューションの適切な混合を確認してください)、バルブを開き、蠕動ポンプのスイッチします。ガラスとアルミのプレートの間をフローするゲル ソリューションを許可する、流量は約 0.5 mL/min をする必要があります。針は液体の上すべての時間をする必要があります、それはテープでガラス板の上部に付けることができます。</li>
	<li>H と L チャンバーを空にして、超純水でそれらを埋める、水ゲルの表面を優しくオーバーレイするようにします。ゲルの重合は、室温約 1-2 時間を取る</li>
	<li>3% アクリルアミド溶液を準備 (表 1のレシピを参照してください) したピペットでゲル、スタッキングのための重合分離ゲルの上にスタッキングのゲル (スタッキングのゲルを鋳造する前に削除ゲルの表面を覆う水) サンプル ゲル櫛を配置し、間、ガラスとアルミ プレート回避気泡。<ol>
<li>削除した純水の下でそっと櫛で 30-60 分を重合することができます。+4 ° C でゲルを格納します。 一時停止ポイント。ゲルは +4 ° C で数日間保存できます。井戸とゲルの表面の乾燥を防ぐため湿潤ゲルすべき。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2 チラコイドの可溶化1,2,3
注: すべての手順は非常に薄暗い光の下で行わなければなりません。サンプルおよび氷の上のバッファーを維持します。
<ol><li>最終的なクロロフィル濃度 1 mg/mL の冷たい 25BTH20G バッファーを分離チラコイドを希釈します。クロロフィルの 2 D BN SDS-PAGE 分析約 4-8 μ g の/サンプルが適しています。 注: 実験に用いたチラコイド (を参照してください3チラコイド分離のプロトコル) の新鮮な葉から分離する必要があります。</li>
	<li>洗浄バッファー、すなわち2% β-DM (w/v) または 2% の等量を追加ジギトニン (w/v)。ピペット先端部に優しくチラコイド サンプルに洗剤を混合し、空気の泡を避けます。洗剤の最終濃度が 1%、チラコイド 0.5 mg/mL のクロロフィルの。<ol>
<li>氷 (β-DM) やロッカー/シェーカー (ジギトニン) の連続的な穏やかな混合常温 10 分 2 分チラコイドを可溶化します。 注: ジギトニンと β DM 一般的にチラコイド膜タンパク質の可溶化に使用されます。その他の非イオン性洗剤を使用する場合洗剤の濃度と可溶化時間する必要があります最初最適化。通常洗剤濃度範囲 0.5%-5% (v/v) から。 注意: ジギトニンは毒性・保護服・手袋です。</li>
	</ol>
</li>
	<li>+4 ° C で 20 分間 18,000 × g で遠心分離によって不溶性物質を削除します。</li>
	<li>上清を新しい 1.5 mL チューブに転送し、CBB バッファーの 1/10 (v/v) をサンプルに追加します。 注: チラコイド膜蛋白質複合体の全体の構成を調べたところ、収量および可溶性画分の表されたチラコイド ドメインを決定する勧めします。可溶化された材料の降伏を決定する (CBB を追加する) 前に、新しいチューブに上清の 5 μ L を取るし、クロロフィル コンテンツとクロロフィル測定、/b 比5。</li>
</ol>3. BN-PAGE-1,2,3
<ol><li>垂直電気泳動システム (例えば、プラント SE 250) にゲルを設定します。青い陰極バッファーとチャンバー上部バッファー (表 1参照) と陽極バッファー バッファー下院を注ぐ。</li>
	<li>井戸にチラコイド サンプル (クロロフィルの例えば5 μ g) をロードします。</li>
	<li>電気泳動を開始し、徐々 に電圧を増加: 75 V で 30 分間、30 分間 100 V、30 分 125 V、150 V の 1 h および複合体まで 175 V が完全に分離されています。ゲル + 4˚C、寒い部屋を使用するか、冷却装置がゲルの温度を調整するを実行します。 注: は、サンプル フロントがゲルの約 3 分の 1 を移行したとき明確な陰極バッファーに青い陰極バッファーを変更します。</li>
	<li>電気泳動の実行後画像のアーカイブ photoscanner とゲルをスキャンします。</li>
</ol>4. 2 D SDS ページ
<ol><li>垂直電気泳動システム (ゲルのサイズ 16 cm × 20 cm) を組み立てます。1 mm のスペーサーを使用します。</li>
	<li>2 D 櫛 (1 つのストリップの分子量マーカーの 1 つの標準的な井戸も大きな) と標準の SDS ゲル (12% アクリルアミド、6 M 尿素、表 2のレシピを参照してください) を準備します。</li>
	<li>BN ゲルから車線を切断し、(5 mL) チューブでそれを置きます。2 mL の塩化物イオンとバッファー (5% β-メルカプトエタノールを含む) を追加し、室温穏やかな揺れで 45 分のためのストリップを孵化させなさい</li>
	<li>例えば空気の泡を回避するゲルの上に、スペーサーの助けを借りて、レーンを配置します。</li>
	<li>ピペット 5 μ L フィルター紙と場所も標準に紙の狭い部分の分子量マーカーの。</li>
	<li>BN-ゲルのストリップとマーカー紙をシールするには、ゲルのストリップの上に (実行バッファー) に 0.5% の agarose を注ぎ、固化することができます。</li>
	<li>標準的なプロトコルによると電気泳動を行います。後、電気泳動の実行など可視ルビー汚れが付いている蛋白質または6によると染色銀を視覚化します。</li>
</ol>

<ol><li>Schägger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+electrophoresis+for+isolation+of+membrane+protein+complexes+in+enzymatically+active+form%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form.</a> Analytical Biochemistry. 199, 223-231 (1991).</li>
<li>Kügler, M., Jänsch, L., Kruft, V., Schmitz, U. K., Braun, H. -P. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1023/A:1005882406718">Analysis of the chloroplast protein complexes by blue-native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE).</a> Photosynthesis Research. 53, 35-44 (1997).</li>
<li>Järvi, S., Suorsa, M., Paakkarinen, V., Aro, E. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+native+gel+systems+for+separation+of+thylakoid+protein+complexes%3A+novel+super-+and+mega-complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Optimized native gel systems for separation of thylakoid protein complexes: novel super- and mega-complexes.</a> Biochemical Journal. 439, 207-214 (2011).</li>
<li>Strecker, V., Wumaier, Z., Wittig, I., Schägger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+pore+gels+to+separate+mega+protein+complexes+larger+than+10+MDa+by+blue+native+electrophoresis%3A+Isolation+of+putative+respiratory+strings+or+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Large pore gels to separate mega protein complexes larger than 10 MDa by blue native electrophoresis: Isolation of putative respiratory strings or patches.</a> Proteomics. 10, 3379-3387 (2010).</li>
<li>Porra, R. J., Thompson, W. A., Kriedemann, P. E. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0005272889803470">Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. , 384-394 (1989).</li>
<li>Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/elps.1150080203">Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels.</a> Electrophoresis. 8, 93-99 (1987).</li>
<li>Aro, E. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+photosystem+II%3A+a+proteomic+approach+to+thylakoid+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Dynamics of photosystem II: a proteomic approach to thylakoid protein complexes.</a> Journal of Experimental Botany. 56, 347-356 (2005).</li>
<li>Suorsa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+acclimation+involves+dynamic+re-organization+of+the+pigment-protein+megacomplexes+in+non-appressed+thylakoid+domains%5BTitle%5D)+AND+%22The+plant+journal+for+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Light acclimation involves dynamic re-organization of the pigment-protein megacomplexes in non-appressed thylakoid domains.</a> The plant journal for cell and molecular biology. 84, 360-373 (2015).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+Structural+Proteins+during+the+Assembly+of+the+Head+of+Bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li>
<li>Schägger, H., Pfeiffer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supercomplexes+in+the+respiratory+chains+of+yeast+and+mammalian+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria.</a> The EMBO Journal. 19, 1777-1783 (2000).</li>
<li>Rantala, S., Tikkanen, M. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/pld3.39">Phosphorylation-induced lateral rearrangements of thylakoid protein complexes upon light acclimation.</a> Plant Direct. 2, 1-12 (2018).</li>
<li>Rantala, M., Tikkanen, M., Aro, E. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+characterization+of+hierarchical+megacomplex+formation+in+Arabidopsis+thylakoid+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Proteomic characterization of hierarchical megacomplex formation in Arabidopsis thylakoid membrane.</a> Plant Journal. 92, 951-962 (2017).</li>
</ol>

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光合成エネルギー変換機構は、大規模な multisubunit 蛋白質複合体は、チラコイド膜に埋め込まれているので構成されます。このプロトコルでは、BN-PAGE-2D SDS-PAGE と組み合わせるとシロイヌナズナから植物チラコイドのタンパク質複合体の分析のための基本的な方法について説明します。プロトコルはタバコとほうれん草のチラコイドからチラコイド膜タンパク質の解析にも最適ですが、微調整が必要な場合があります。
非イオン性洗剤、膜蛋白質複合体の可溶化のため、そのままの形で複合体を維持するためには彼らの能力のため使用されます。ここでは、2 つの一般的に使用される洗剤 β-DM とジギトニンが適用されました。ジギトニンは大きい蛋白質複雑なアセンブリ10の分析のため使用できるに対し、ドデシル maltoside 可溶性個々 の蛋白質の複合体です。かさばる構造ジギトニンはしっかりと密着グラナのパーティションに収めることができる、したがって可溶性チラコイド膜3,<...

大規模な multisubunit 蛋白質複合体の光化学系 PSI と PSII、Cyt b6f と ATPase 光合成の明反応で NADPH および ATP の生産を調整します。高等植物葉緑体密着グラナを有し、非密着の実質チラコイド構造的に異種の膜構造は、チラコイド膜の複合体があります。ブルー ネイティブ ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (BN-PAGE) は、ネイティブおよび生物学的にアクティブな形で大規模な multisubunit 蛋白質複合体の解析に広く使用された方法です。メソッドは、ミトコンドリア膜タンパク質複合体1の解剖のために設立されましたが、チラコイド膜ネットワーク3からの蛋白質の複合体の分離の後でカスタマイズされています。(I) の構造解析、タンパク質複合体のネイティブ相互作用を決定するためには (ii) と (iii) 蛋白質複合体の全体的な組織の分析のための個々 のチラコイドのタンパク質複合体の精製方法が適してください。環境のキューを変更します。
分離前に蛋白質の複合体は一般に軽度し、蛋白質の複合体のネイティブ構造を維持する厳選された非イオン性洗剤膜から分離されます。洗剤を含んで疎水性と親水性のサイト特定濃度は, 上記フォーム安定するミセルと呼ばれる臨界ミセル濃度 (CMC)。脂質脂質の相互作用の中断と蛋白質の複合体の可溶化 CMC 結果上記洗剤の濃度を増加させます。洗剤の選択には、興味の複雑な蛋白質の安定性と洗剤の可溶化能力によって異なります。日常的に使用されている洗剤には、α/β-ドデシル-maltoside とジギトニンが含まれます。次の天然状態の膜タンパク質の可溶化、不溶性物質が遠心分離によって削除されます。高等植物におけるチラコイド膜が構造で高いというヘテロなといくつかの洗剤 (例えばジギトニン) が選択的に膜3の特定の一部分だけを可溶化します。したがって、それは常に葉緑素含量とクロロフィル a/b を決定することにより選択した洗剤の可溶化能力を決定する重要な蛋白質の複雑な組織または蛋白質の複合体間の相互作用を特徴付ける、可溶化画分の収量および表されたチラコイド (サブ) ドメインをそれぞれ評価する上清の比率。そのままチラコイド成長光順化植物のクロロフィル a/b 比は、通常約 3 chl、チラコイド画分の b 値を豊かにグラナのいずれか/または実質チラコイドを下回る (2.5 ~) (~ 4.5) の合計の値を超えるかチラコイド、それぞれ。
タンパク質複合体に負の電荷を提供するには、Coomassie ブリリアント ブルー (CBB) 染料は可溶化されたサンプルに追加されます。電荷移動による蛋白質の複合体は陽極の方に移行、その分子の質量と形状によるとアクリルアミド (AA) グラデーションに区切られます。効果的かつ高分解能の分離は、線形アクリルアミド濃度勾配を使用して実現されます。自分サイズに依存した細孔サイズ制限に達するまで、電気泳動中に蛋白質複合体を陽極に向かって移行します。ポリアクリルアミドのゲルの細孔径によって異なります (i) 総アクリルアミド/ビス- アクリルアミド濃度 (T) と (ii) 架橋剤bis- アクリルアミド モノマー濃度 (C) 合計モノマー4を基準にして。BN ページと分離後、タンパク質複合体はさらに 2 番目の次元 (2 D) - SDS のページでに個々 のタンパク質サブユニットに分割できます。ここでは、BN-ページ/2 D-SDS-PAGE によるチラコイド膜蛋白質複合体の分析のための詳しいプロトコルについて述べる。

<table><tbody><tr><td>6-アミノカプロン酸 (ACA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A2504</td><td></td></tr><tr><td>BisTris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4429</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>アクリルアミド (AA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A9099</td><td>注意: 神経毒性!</td></tr><tr><td>n-ドデシル-ベータ;-D-マルトシドシド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4641</td><td></td></tr><tr><td>トリシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0377</td><td></td></tr><tr><td>トリス</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>VWR</td><td>442444H</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>VWR</td><td>28877.292</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>J.T. Baker</td><td>7044</td><td></td></tr><tr><td>フッ化ナトリウム(NaF)</td><td>J.T.ベイ</td><td>カー3688</td><td></td></tr><tr><td>EDTA二ナトリウム塩</td><td>J.T.ベイ</td><td>カー1073</td><td></td></tr><tr><td>ジギトニン</td><td>カルバイオケム</td><td>300410</td><td>注意:有毒!</td></tr><tr><td>Pefabloc SC</td><td>Roche</td><td>11585916001</td><td></td></tr><tr><td>Serva Coomassie Blue G</td><td>Serva</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-メルカプトエタノール</td><td>Bio-Rad</td><td>1610710</td><td></td></tr><tr><td>APS (過硫酸アンモニウム)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0700</td><td></td></tr><tr><td>TEMED (テトラメチルエチレンジアミン)</td><td>Bio-Rad</td><td>1610801</td><td></td></tr><tr><td>(N,N'-メチレン)-ビスアクリルアミド</td><td>Omnipur</td><td>2610</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher</td><td>G0800</td><td></td></tr><tr><td>染色済みタンパク質マーカー、ブロードレンジ (7-175 kDa)</td><td>New England Biolabs</td><td>P7708</td><td></td></tr><tr><td>Falcon, Conical Centrifuge Tubes 15 ml</td><td>Corning</td><td>352093</td><td></td></tr><tr><td>Dual gel caster with 10 x 8 cm plates</td><td>Hoefer</td><td>SE215</td><td></td></tr><tr><td>Gradient maker SG5</td><td>Hoefer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.75 mm Tスペーサー</td><td>Hoefer</td><td>SE2119T-2-.75</td><td></td></tr><tr><td>サンプルゲルコーム、0.75 mm</td><td>Hoefer</td><td>SE211A-10-.75</td><td></td></tr><tr><td>Mighty Small SE250 縦型電気泳動システム</td><td>Hoefer</td><td>SE250</td><td></td></tr><tr><td>IPCポンプ</td><td>Ismatec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>電源、PowerPac HV</td><td>Bio-Rad</td><td>164-5097</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>ロッカーシェーカー</td><td>Biosan</td><td>BS-010130-AAI</td><td></td></tr><tr><td> PROTEAN II xi Cell</td><td>Bio-Rad</td><td>1651813</td><td></td></tr></tbody></table>

ブルー ネイティブ電気泳動によってチラコイド膜タンパク質複合体の解析

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

光合成電子伝達鎖 (など) は、NADPH および ATP の形で化学エネルギーに太陽エネルギーを変換します。4 つの大きい蛋白質の複合体は、チラコイド膜の収穫 NADP+ 経由で2 ダメージを与えるに水から電子をドライブし、ATP の生産のために作成したプロトンの勾配を使用するための太陽エネルギーに埋め込まれます。光化学系 II 光化学系 PSI、チトクローム b6f (チトクローム b6f) および atp アーゼは、異なる方向とチラコイド膜ダイナミクスと多蛋白質複合体すべてです。ネイティブのゲルの電気泳動分離に続く穏やかな洗剤によって、複合体膜の完全性を可で組成、チラコイド膜蛋白質の複合体の相互作用に関する貴重な情報を得ることが、複合体。ブルー ネイティブ ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (BN-PAGE) は、ネイティブと機能的な形で蛋白質の複合体の分離に使用される手法です。詳細な構造解析のための蛋白質の複雑な浄化の方法を使用できますが、タンパク質複合体の動的相互作用を分析するためのツールも用意されています。メソッド、ミトコンドリア呼吸系膜タンパク質の解析用に開発されたが、以来最適化、チラコイドのタンパク質複合体の解離のために改善します。ここでは、不安定な光合成タンパク質複合体とシロイヌナズナにおけるそれらの相互作用の分析の詳しい最新のプロトコルを提供します。

図 1に代表的な 2 D/BN-PAGE SDS システムは、ジギトニンと β DM 可溶化チラコイド膜タンパク質の分離や詳細な蛋白質サブユニット組成を示します。可溶化ジギトニン チラコイド (図 1 aの上部に上水平ゲル) の蛋白質の複雑なパターンは、PSII LHCII PSI の megacomplex、2 つの大きな PSII LHCII の supercomplexes (sc)、PSI LHCII とらえ超複合体、PSI 単量体 (m)、PSII m/Cyt 含まれています。b6f、疎結合 (L)-LHCII 三量体 (図 1 a)。少し強い洗剤、β-DM、全体チラコイド膜 (図 1 bの上に水平のゲル)、可溶性しますが、蛋白質の複合体間の弱い相互作用を維持することはできなかった。Β DM とチラコイド...

プロトコル植物の解明のためチラコイドのタンパク質の複雑な組織と組成ブルー ネイティブ ポリアクリルアミドゲルとゲルの電気泳動 (BN-PAGE) と 2 D SDS ページの説明。プロトコルは、シロイヌナズナ、最適です、マイナーな修正と他の植物種に使用できます。

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

この方法は、植物性チラコイド膜中の光合成タンパク質複合体の組成および動的組織に関する重要な質問に答える助けとなる。この技術の主な利点は、天然タンパク質複合体間の機能的相互作用の分析を可能にし、様々な環境条件におけるタンパク質複合体組織の可塑性を解明することです。0.75ミリメートルのスペーサーを使用して、メーカーの指示に従って、ゲルキャスター8センチメートルを10センチメートルプレートで設定します。攪拌板に勾配ミキサーを置き、チューブで蠕動ポンプと接続します。チューブの反対側に注射針を取り付け、ガラスとアルミニウム板の間に針を置きます。重い部屋に磁気スターラーを置きます。分離ゲル勾配に使用するテキストプロトコルに詳述されているように、15ミリリットルの円錐型遠心分離管に3.5%および12.5%のアクリルアミド溶液を調製します。不時の重合を防ぐために、溶液を準備しながら、氷の上に遠心管を保ちます。ソリューションをグラデーションミキサーにピペットする直前に、5%APS と TEMED を追加します。重い部屋に12.5%の解決をピペット。2つのチャンバを接続するバルブを開き、溶液がライトチャンバーに入るようにすることで、軽いチャンバと重いチャンバーを接続するチャネルから気泡を取り除きます。バルブを閉じ、溶液の痕跡を重いチャンバーに戻します。最後に、3.5%溶液を光チャンバにピペットします。磁気スターラーのスイッチを入れ。バルブを開き、蠕動ポンプのスイッチを入れる。ゲル溶液が1分間に約0.5ミリリットルの流量でガラスとアルミニウム板の間を流れるようにします。針は常に液体の上になければなりません。重く、軽い部屋が空になったときに超純水でそれらを満たす。そして、水がゲル表面を穏やかに重ねるようにします。ゲル重合は室温で約1〜2時間かかります。室温で積層ゲル用に3%アクリルアミド溶液を調製します。重合分離ゲルの上に積層ゲルをピペットし、ガラスとアルミニウム板の間にサンプルゲルコームを配置し、気泡を避ける。ゲルを室温で30~60分間重合させた後、超純水の下でくしを静かに取り除きます。この時点でゲルは、数日間湿った状態で正の摂氏4度で保存することができます。氷冷25BTH20Gバッファーで分離したチラコイドを1ミリリットル当たり1ミリグラムの最終的なクロロフィル濃度に希釈する。各チラコイドサンプルに2本のチューブを用意し、β-DMとデジコニンの可溶化を行います。次に、等量の洗剤バッファーを追加します。洗剤とチラコイドサンプルをピペットでやさしく混ぜ、気泡を作らないようにします。β-DM可溶化のために氷の上で2分間チラコイドを可溶化する。またはジジトニン可溶化のためのロッカーまたはシェーカーに連続的な穏やかな混合と室温で10分。インキュベーションに続いて、摂氏4度で20分間18,000gで遠心分離により無溶化した材料を取り除きます。上清を新しい1.5ミリリットルチューブに移し、サンプルにクーマシーブリリアントブルーバッファーの1/10ボリュームを追加します。垂直電気泳動システムでゲルを設定します。上部バッファーチャンバーに青いカソード バッファーを充填し、アノード バッファーを下側バッファーチャンバに注ぎます。チラシッドのサンプルを井戸に積み込みます。電気泳動を開始し、テキストプロトコルにリストされている電圧を徐々に増やします。冷たい部屋を使用するか、冷却システムでゲル温度を調整するか、正の4度でゲルを摂氏4度で実行します。サンプル前面がゲルの約3/3を移行したら、青いカソードバッファーをクリアカソードバッファーに変更します。電気泳動の実行後、画像のアーカイブのための写真スキャナでゲルをスキャンします。2-SDS PAGEを行うために、1ミリメートルスペーサーを使用して垂直電気泳動システムを組み立てます。テキストプロトコルに記載されているように、2Dコームを使用して標準SDSゲルを準備します。BNゲルから車線を切り、5ミリリットルのチューブに入れる。その後、レムリバッファーの2ミリリットルを追加し、室温で穏やかな揺れで45分間ストリップをインキュベートします。気泡を避けるゲルの上にスペーサーの助けを借りて車線を置きます。濾紙の狭い部分に分子量マーカーのピペット5マイクロリットルを、標準ウェルに置きます。BNゲルストリップとマーカーペーパーを封止するには、ゲルストリップの上にランニングバッファに0.5%のアガロースを注ぎ、固化させます。標準的なプロトコルに従って電気泳動を行います。電気泳動の実行後、SUPROルビー染色または銀染色でタンパク質を可視化します。β-DMおよびジジトニン可溶化サンプルのチラコイドタンパク質複合体パターンの代表的な結果をここに示す。小さな複合体は、電気泳動の実行中に速く移動し、したがって、ゲルの下部にあります。一方、大きな複合体はゲルの上部にあります。デジコニンは一般的に大規模な集合体でタンパク質複合体を保存し、βDMは複合体間の不安定タンパク質とタンパク質の相互作用を妨げる。β-DMとジギコニン可溶化チラコイドのタンパク質複合体のサブユニット組成をここに提示する。各複合のサブ単位は、位置合わせされた複合系の下の垂直線から見つかります。原則として、2次元ゲル内の各スポットは、個々のタンパク質を表す。しかし実際には、同じ分子量のタンパク質が1箇所に存在する可能性があります。スポットの同定は質量分析分析に基づいています。この手順を適用した後、タンパク質複合体に構造的な洞察を得るために、青色の天然ゲルから溶出したタンパク質複合体の電子顕微鏡および単一粒子分析のような他の方法を継続することができます。未知のタンパク質サブユニットを同定するために、2次元SDS PAGEから個々のタンパク質スポットを質量スペックで分析することができる。アクリルアミドとジジトニンを使用すると非常に有害であり、保護手袋を着用するなどの予防措置は、常にこの手順を実行しながら取られる必要があることを忘れないでください。

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このビデオでは、我々は青いネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動（BN - PAGE）により、多タンパク質複合体（MPCは）の特性について説明します。最初の次元では、透析の細胞溶解物を、個々のMPCを識別するために、BN - PAGEによって分離される。二次元目SDS -...

細胞溶解物からの多タンパク質複合体の解析のための青いネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動（BN - PAGE）

このビデオでは、ミトコンドリア呼吸器タンパク質複合体をネイティブに折りたたまれ、機能的に活性な状態で分析するための、Blue Native...

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis:無傷のミトコンドリア呼吸鎖複合体の分析のための非変性分離技術

記載された比較、定量的プロテオミクスアプローチは、異なる条件下で多タンパク質複合体の組成物への洞察を得ることを目的と遺伝的に異なる菌株を比較することによって実証される。定量分析のためにショ糖密度勾配とは異なる画分の等し​​い体積を質量分析によって混合し、分析する。...

に基づいた多タンパク質複合体の比較分析のための新たなアプローチ<sup&gt; 15</sup&gt; N代謝標識および定量的質量分析

このプロトコルは、さまざまな下流のタンパク質分析技術と互換性がある、不均一なサンプルからの非共有結合生体分子集合体およびタンパク質のネイティブ分離技術である、透明なネイティブゲル溶出液体フラクションエントラップメント電気泳動(CN-GELFrEE)を準備し、実行する方法を説明しています。...

CN-GELFrEE  - クリア天然ゲル溶出液フラクションエントラップメント電気泳動

タンデムアフィニティー精製法は、プロテオミクスのための細胞抽出物、主に真核生物から天然複合体を単離するために広く使用されてきました。ここでは、構造研究のための天然複合体の精製に最適化されたTAPメソッドプロトコールを紹介します。...

タンデムアフィニティータグ法を用いた構造解析のためのネイティブ複合体の精製

ここでは、ラベルフリーの定量的質量分析法を用いたタンパク質相関プロファイリングに続く親和性タンパク質複合体の精製と青ネイティブPAGEによるそれらの分離のためのプロトコルを提示します。この方法は、異なるタンパク質複合体へのインタラクトームを解決するのに便利です。...

ブルーネイティブPAGEおよびタンパク質相関プロファイリングによってアフィニティー精製タンパク質複合体の解決

このプロトコールは、機能的ミトコンドリア電子輸送鎖複合体（Cx）IVおよびそれらのスーパーコンプレックスの、それらのアセンブリおよび構造に関する情報を明らかにするための天然の電気泳動の分離を記載する。天然ゲルは、イムノブロッティング、ゲル内アッセイ、および電気溶出による精製を受けて、個々の複合体をさらに特徴付けることができる。...

ネイティブ電気泳動、インゲルアッセイおよび電気溶出を用いたミトコンドリア電子輸送鎖のスーパーコンプレックスの解析

生理活性チラコイドの高収率分離のためにここのプロトコルおよび葉緑体ツイン アルギニン転流 (cpTat)、分泌 (cpSec1)、およびシグナル認識粒子 (cpSRP)...

生理活性とエネルギー依存性タンパク質輸送アッセイでの使用の分離

ネイティブ グリーン ゲル電気泳動による可溶化されたチラコイドの複合体を分離するためのプロトコルをご紹介します。緑のゲルのバンドが後で時間相関単一光子計数 (ピコ)...

Time-Correlated 単一光子のカウントを使用してネイティブ グリーン ゲル電気泳動とバンドによってほうれん草チラコイドのタンパク質複合体の分離

このプロトコルは、青いネイティブ...

ブルー ネイティブ ポリアクリルアミドゲル電気泳動法と免疫ブロットを使用して培養されたひと細胞のミトコンドリア呼吸鎖複合体の解析

ここでは、洗剤とクマシーブルーへの暴露を最小限に抑えるミトコンドリア supercomplexes...

ミトコンドリアの呼吸鎖 Supercomplexes の分離と分析のためのハイブリッドクリア/ブルーネイティブ電気泳動

学ぶブルーネイティブ電気泳動によるチラコイド膜タンパク質複合体の解析法。Arabidopsis thalianaを用いて光合成タンパク質複合体の組成と動的構造を解明し、環境変化への適応性を評価する。

ブルーネイティブ電気泳動によってチラコイド膜タンパク質複合体の解析

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ブルー ネイティブ電気泳動によってチラコイド膜タンパク質複合体の解析

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