Name: Tigriopusカイアシ類と仲間を守る行動の定量分析の個別培養 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 24 s
Description: 学ぶTigriopusカイアシ類の個別培養と仲間を守る行動の定量分析法。動画解析により生殖行動を評価し、行動生態学と進化遺伝学研究への応用が可能です。

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この作品は住友財団からの補助金によってサポートされている (基本的な科学研究プロジェクトを補助金付与数: 150932) や海洋無脊椎動物研究所、米国から助成金と RSB、STI に日本 (2018年個別研究助成)RSB に国立科学財団 (DEB-1556466)。養殖・ ステージング方法のフィードバックありがとうさんキアナ ミシェル ウッドワード。

1 原生動物の行動観察のための準備
<ol><li>受精卵を入手して孵化するようにします。<ol>
<li>妊娠女性のパスツール ピペット株式文化からクリア オレンジ (すなわち、受精と開発の先進的な段階で) 卵 (図 3) を運ぶを収集します。優しく文化で孵化したことがあります nauplial の幼虫を含む他の動物の転送を避けるためにクリーンな培地のそれらをピペッティングにより女性をすすいでください。 注: このプロトコルで 35% の塩分濃度と人工海水は培養培地として使用されます。実験の目的に応じて異なる媒体 (例えば人工海水塩分濃度が高いと追加の溶質) を使用します。 注: は、バレットら2015年12実験室培養株の確立のための法とペレイラら201613 t. ミヤコカブリダニの自然個体群のコレクション サイトの例を参照してください。ピーターソンらは、緯度と経度の情報9 t. ジャポニカス t. fulvus、 t. ミヤコカブリダニのコレクション サイトをまた報告しました。約 30-50 mL の容量を持つプラスチック製のピペットを使用して、岩のプールからTigriopusカイアシ類を収集します。</li>
		<li>きれいな培地 (図 4左) と 6 も細胞培養プレートのウェルに個別に各女性を配置します。他の動物 (nauplial の幼虫を含む) は井戸を汚染しないことを確認します。</li>
		<li>文化女性の卵の嚢がリリースされるまでに 12 時間の明暗周期を 20 ° c 設定インキュベーターでプレートを維持します。この手順は、通常種と胚の発達段階に応じて 1 ~ 10 日をかかります。一方、各妊娠女性細かく地面 (約 &lt; 0.5 mm 径) 魚料理の 2 つの穀物との週 2 回フィード (詳細については材料の表を参照してください)。 注: は、異なる温度及び実験の目的に応じて光のサイクルを使用します。高い温度は、胚のより急速な発展を促進できます。 注: は、井戸における腐食の余分な食品を放置しないでください。食べ物のかすは崩壊を開始する場合、井戸からパスツール ピペット ピペットします。</li>
		<li>卵嚢が解放された後、パスツール ピペット文化井戸から女性を削除します。 注: 受精女性子孫2,3の複数のクラッチを産卵が可能です。必要な場合は、さらにクラッチを収集するために他の井戸に女性を転送します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>個々 の文化のための copepodids を収集します。<ol>
<li>インキュベーターで孵化した給餌でプレートを保つ、彼らは最初のコペポタイド (CI) ステージ (図 4中間) の開発まで、給餌の文化します。この手順は、通常 1 ~ 2 週間かかります。細挽きのいくつかの穀物とも各飼料食品を 2 日に 1 回 CI 動物を捜している間魚。蒸留水の蒸発の飼育水を補充します。 注: 場合は浮かんでいる残骸は、ビューを妨げ、ペーパー タオルの小さい部分でそれをなぞる。</li>
		<li>CI の動物が登場し始め、すぐには約 8 μ L、10 X 40 X 倍率 (図 4右) に実体顕微鏡下で設定の分注量 P-10 マイクロ ピペットで井戸から収集します。優しくきれいな人工海水でピペッティングによる各 CI 動物を洗うし、人工海水の 2-3 mm 深さ (約 400-600 μ L) を含む 24 ウェルの細胞培養プレートのウェルに配置。 注: を避ける nauplial のぬけがらや個々 のカルチャの井戸に他の動物の上に運ぶ。</li>
	</ol>
</li>
	<li>脱皮のぬけがらをカウントすることによって、個人の開発を追跡します。<ol>
<li>(必要に応じて周波数を調整する) すべての 2 〜 3 日脱皮ぬけがらの各ウェル中 10 X 40 X 倍率で暗視野照明下での表面観察して調べる。透明な copepodids のぬけがらは、直立させた足、尾側枝 (すなわち、薄い尾側端構造の突出)、および/または prosome と urosome (図 5) の分割のペアと認識できます。フォーカスとよく (図 6 a) で異なる深さにぬけがらを検出する照明を変更します。 注: 脱皮ぬけがら、それら脱皮動物よりも小さくなります。古いの (すなわちより小さい) のぬけがらには高い倍率に動物と比較的最近のぬけがらシフトの低倍率から審査を開始します。 注: 井戸のぬけがらが破損した場合発達段階に対する誤判断を避けるためにさらに発達追跡から井戸を排除します。 注: 場合は浮かんでいる残骸は、ビュー (図 6 b) を阻害、ペーパー タオルの小さい部分でそれをなぞる。</li>
		<li>プレート蓋 (図 7) にタリー印の各ウェルにコペポタイドぬけがらの総数を記録します。新しいぬけがらは井戸を発見、マークに線を追加します。 注: 場合は井戸の汚染された nauplial のぬけがら、カウントからそれらを排除します。</li>
		<li>2 粒細挽きの各個人を養う魚の食品。塩分濃度を維持するために蒸留水と蒸着の飼育水を補充します。 注: フィード copepodids のすべての 2 〜 3 日を消費し、脱皮のぬけがらは、潜在的 (ステップ 1.3.4) の発達段階の推定に影響を与えることができる損傷からそれらを防ぐために。</li>
		<li>ぬけがらの数に基づいて動物の発達段階を推定します。ぬけがらはありませんが、個人が CI の段階で推定されます。1 ~ 4 のぬけがらなら、個人は CV の段階に CII でと推定されます。5 ぬけがらなら、個人が大人になると推定されます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>形態に基づく大人のセックスを識別します。<ol>
<li>その形態を調べることによって動物のセックス。Tigriopusの成人男性では、遠位端 (図 3 a) フックと球状の構造を持つ膝の最初アンテナを所有しています。成人女性では、男性のものよりも、(図 3 b) 滑らかな、比較的薄く最初レベルのアンテナを所有しています。一部の女性も自分の体 (図 3 b, 3 D) の生殖腺の脂質から深緑色を示します。</li>
		<li>よく (図 7 b) の蓋のセックスをマークします。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 行動テストと仲間を守る行動のビデオ録画
<ol><li>テストの日に必要なステージと行動テストのためのセックスの動物を選択します。<ol>
<li>細かく地上魚食糧文化井戸で選択した個人をフィードし、30 分のそれを食べることができます。一方、テスト室を準備する 2.1.2 のステップへ進みます。</li>
		<li>テスト室; として 2 つ 48 ウェル平底細胞培養皿を準備します。(以下、「プレート A」と呼ばれる) 1 つのプレートは男性、その他 (「プレート B」) は、ターゲット (例えばcopepodids、成人女性、成人男性)。プレートの井戸で 35% の塩分濃度ときれいな人工海水の 400 μ L を追加します。光を拡散 (図 8) として半透明のアクリル板で覆われている LED ライト パッドのプレートを配置します。 注: は、実験の目的に応じて異なるメディアを使用します。 注: 余分な熱を避けるためには、バックライトとしてに白熱灯や蛍光灯を使用しないでください。</li>
		<li>2.1.1 説明 30 分給餌時間後、は、優しくきれいな人工海水残骸とぬけがら文化井戸からのキャリー オーバーを防ぐために (図 9) 24 ウェル プレートの 4 つの井戸の連続にピペッティングで各動物をすすいでください。</li>
		<li>LED ライト パッドのプレート A と B の井戸で洗った個人を配置します。井戸に動物の調整のための 30 分を許可します。</li>
		<li>(図 8) 調整期間中に板の上のカメラを設定します。三脚やスタンドを使用して、カメラを保持します。</li>
		<li>プレート アンテナの観察を許可するように A の中の男性にピントします。 注: 映画でバックライトのちらつきを減らすためには、フレーム レートに等しいまたは電気周波数の半分に設定しより長い露光時間を使用します。また、2.1.2 の手順で説明されているように半透明のアクリル板で覆われた LED ライト パッドをしてください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>2.1.4 の手順に従って調整期間の後、ビデオ録画および行動テストを開始します。<ol>
<li>パスツール ピペットのプレートにプレート B からターゲットを転送します。実験中の化学成分に敏感な場合は、テストの各ペアのピペットを変更します。 注: プレート B から動物をピペッティング時は追わないパスツール ピペットで水で水妨害できる動物を刺激するし、その過剰な動きを引き出します。水表面をやや上回るピペットの先端を押しながら個々 の先端の下に来るを待ちます。人工海水の少量をピペット優しくから取り出してプレート A. に井戸の中へ</li>
		<li>実験計画に従って転送後観察の時間 (例えば10 分) の希望期間の各ウェルでやり取りをする男性とターゲットを許可します。</li>
		<li>観測時間後ビデオの録画を停止します。必要に応じて、カメラから録画したムービーをコンピューターにダウンロードします。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. マニュアル行動特性解析
<ol><li>各ターゲット板 A. 井戸に移されたとき、タイミングのための映画を調べる</li>
	<li>開始し、関心のあるイベントの終了タイミングを調べ、時間、待機時間、およびイベントの頻度を計算します。<ol>
<li>ターゲット (図 10、左上) の体のどの部分に男性のアンテナの接触として男性によってガードの試みの開始を定義します。触角の連絡先は、スウィフトによって頻繁に先行されて (&lt; 0.5 s) を追いかけるか、襲い掛かります。</li>
		<li>男性の両方のアンテナをターゲット (図 10、右上) の体から切り離すとき、ポイントとしてガードの試みの終了を定義します。警備として試行回数を計算します。 <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/58378/58378eq1.jpg">
</li>
		<li>(図 10右下) 女性のそれに対する urosome の反復的なプレスが続いている男性の体背部ベンドして交尾の開始を定義します。プッシュの周波数は、1 秒あたり数回です。 注: 警備の男性を交尾 (図 10、左下) の前に女性の体の尾下にクロールします。</li>
		<li>3.2.4 に記載されているイベントの後、urosomes の剥離によって交尾の終了を定義します。 注: 交尾一般的に起こるt. ミヤコカブリダニとt. ミヤコグサの場合に数分間。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4 個人やペアの次元の追跡
<ol><li>ムービー編集ソフトで手順 2 で記録映画をトリミングすることによって関心 (例えば最初の 3 s ガードの試み) のエピソードを備えたビデオ クリップを生成します。</li>
	<li>インストールから ImageJ14 : https://imagej.nih.gov/ij/download.html。ダウンロードして MTrackJ、ImageJ15、モーショントラッ キングのプラグインで次の手順の: https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/。</li>
	<li>ImageJ を開き、目的のムービーをインポート (例えば、ファイル &gt; インポート &gt; を使用して QuickTime; 画像処理に必要なメモリを削減する「8 ビット グレースケール変換」を選択)。</li>
	<li>空間と時間のキャリブレーションを実行します。<ol>
<li>空間キャリブレーションの ImageJ ウィンドウでまっすぐの線選択ツールを選択します。</li>
		<li>ムービー ウィンドウの既知の長さ (例えば井戸の直径) を持つオブジェクトに沿って選択線を描画します。</li>
		<li>「縮尺の設定」メニューを開く (分析 &gt; スケールを設定).「知られている距離」ボックスと「長さの単位」ボックスにそのユニット (mmなど) で既知長さを入力します。他のビデオ クリップのスケールを使用する「グローバル」チェック ボックスをクリックします。</li>
		<li>「プロパティ」メニューを開く (画像 &gt; プロパティ) 時間のキャリブレーションのため。「フレーム間隔」ボックスにフレーム間隔 (フレーム率の逆数) を入力します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>MTrackJ の追跡を構成します。<ol>
<li>プラグインから MTrackJ プラグインを開く &gt; ImageJ の MtrackJ。追跡を開く MTrackJ ダイアログ ウィンドウで「追跡」ボタンをクリックして設定メニュー。</li>
		<li>「ポイントを追加した後次の時間インデックスを移動する」をチェックすることによって追跡間隔設定と構成] ダイアログ ボックスで"時間ステップ サイズ」ボックス数値を入力。フレーム単位で追跡を実行するには、「時間ステップ サイズ」ボックスに「"1"」と入力します。</li>
		<li>「適用ローカル カーソル追跡時にスナップ」をチェックし、スナップ機能として「暗い重心」を選択します。このオプションは、カーソルを検出正方形 (「スナップの範囲」) の暗いオブジェクト (すなわち、個人またはペア) 重心の自動検出できます。全体のペアまたは映画 (例えば31 x 31 ピクセル) で動物をカバーする四角形のサイズを選択します。</li>
		<li>選択したオプションを適用する"OK"をクリックします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>二次元の追跡を実行します。<ol>
<li>追跡を開始する MTrackJ ダイアログ ウィンドウで「追加」ボタンをクリックしてします。</li>
		<li>ペアまたは追跡する個人をカバーするカーソル (検出広場) を置きます。正方形内のオブジェクトの暗い重心を検出するをクリックします。</li>
		<li>フレームの必要な数の 4.6.2 のステップを繰り返します。</li>
		<li>データ テーブルを生成するには、MTrackJ ダイアログ ウィンドウで「測定」ボタンをクリックします。データは、2 つのウィンドウに表示されます:「MTrackJ: トラック」ウィンドウ軌跡を追跡の概要、「MTrackJ: ポイント」は、時期ごとの詳細なデータを示しています。各テーブルを保存するには、ファイルを選択 &gt; ImageJ のメニューを付けて保存します。 注: 各データ列の詳細については (https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/manual/) の開発者によって提供されたオンライン マニュアルを参照してください。</li>
		<li>色付きの線として描画履歴軌道ムービーを生成するには、MTrackJ ダイアログ ウィンドウで「ムービー」ボタンをクリックしてします。生成されたムービーを保存するファイルを選択 &gt; ImageJ のメニューを付けて保存します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>全体の結果を保存します。データ (手順 4.6.4) と (手順 4.6.2 と 4.6.3) 軌跡を追跡を含む結果を保存する MTrackJ ダイアログ ウィンドウで「保存」ボタンをクリックしてします。</li>
</ol>

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</ol>

著者が明らかに何もありません。

個々 の培養とステージとセックスの決意
ここで私たちの以前の研究5 (図 4および図 7) の開発を追跡しながら制御ペアリング経験を持つ処女のTigriopus動物の準備に使用する方法について説明しました。Tigriopus種が毒物学16,18, 生態生理学19,20,21, などの様々 な生物学のモデル動物として使用されると進化遺伝学13,22,23,24, このメソッドこれらのカイアシ類のライフ サイクルに及ぼす環境および遺伝的要因の影響を評価する貴重な手段を提供する可能性があります。
後期のコレクションとして動物の誤ステージング成功したステージング、通常の検索と CI のコレクションを達成するために大衆文化 (ステップ 1.2) から copepodids は重要です。加えて、ぬけがら (手順 1.3) に徹底した検索も正確なステージングのために不可欠です。コレクション、種によっては数日に 1 つからの脱皮間隔が異なりますので、必要に応じてをステージングおよび飼育条件2,25,26の頻度が増加します。Copepodids と大人の女性のアンテナ形態の違いは目に見えていくつかの種とTigriopus16,25の人口の重要ではないです。したがって、雌雄鑑別する前にステージングはどちらかの性の高度な copepodids から成人女性を区別するのに役立ちます。
行動テストと行動特性の手動解析
一般に、スンクスの最も重要な部分の 1 つは、関心のあるイベントの定義と説明です。本稿で紹介したメソッド最初私たちの最近の研究5で開発され交尾と視覚補助 (図 10) の説明と補足。それに加え、動物取扱の一貫性はまた行動実験で重要な役割を果たしています。たとえば、カイアシ類の洗浄 (補足図 1) の行動のいくつかの側面を促進するかもしれない可能性があります、したがって 2.1.3 の手順で標準化などのサンプルの間で一貫した方法で実行することが望ましいです。本稿で提供される素材はTigriopus高潮のプールのこの豊かな住民の繁殖生態学的研究の推進の仲間を守る現象に関する制御で再現可能な研究を支援すると見込んでいます。
この方法で可能な制限の 1 つは、得られた画像の低倍率です。体制と記録映画 urosomes 男性最初アンテナなどの著名なボディ構造の同定を可能にします、1 つそれを採用していないので、当社の方法で足や性器などより多くの微妙な構造を観察することができない場合があります。ビデオ録画のための顕微鏡の倍率。ケリーらを彼らは男性から 100 倍の倍率 (記録ビデオ) で顕微鏡観察下でt. ミヤコグサの女性に転送精を観察することができた報告7、行ったものを観察することができる、画像の解像度の制限のためにおそらく、我々 の映画の精。
ペアの二次元の追跡
動物 (cfを化学的に分類せずに動物プランクトンの二次元流跡線解析を可能このメソッドには、動物の三次元トラッキングができないが.ラードら201027) 無料配布プログラムを利用しています。ムービー ファイルのサイズが大きすぎるため、ImageJ で処理される場合、ファイルの解像度を減らす、グレー スケール ムービーに変換できます。この方法t. ミヤコカブリダニ(図 12 、 図 13) のアダルトのペアとして開発された、それはまた大人少年ペアと単一の個人 (補足図 1) として利用可能原則的になく、他のTigriopusの種。我々 はさらに適切な調整と他の分類群の動物プランクトンの (2 番目の時間スケールにミリ秒) から短期に該当する軌道分析する方法を期待します。

潮間帯カイアシ類Tigriopus属のいくつかの大陸1ロッキー高潮間帯プールで広く分散します。これらのカイアシ類繁殖、成人男性が少年 (成人) 潜在的な仲間をキャプチャの一部としての仲間を守る現象が発生 (図 1 、 図 2) の交尾前にそのフック最初アンテナを利用した2 ,3,4,5。この現象がずっと数十年2,3,6、7、この現象の研究のための詳細な手順の子豚および生化学的研究の主題を含む原生動物の個々 の文化と仲間を守る試みに見られる行動のでき事の条件がうまく説明していません。したがって、ここでは制御の実験的環境下における挙動の研究を可能にする方法を確立します。
個々 の培養および動物のステージング
Tigriopusの生殖に関する以前の研究は従来の行動テストの稚魚 (copepodids) および大人女性を準備する方法をデタッチと実験3,8,9 を繁殖ペアを採用 ,10。ただし、このメソッドは、動物5動物の行動特性を変更するかもしれない (伊藤 198811で説明します)、テスト前に交尾して潜在的形のペアにできます。さらに、ステージングの外見上の本体サイズに依存しているように従来のプロトコルでカイアシ類の発育段階を見誤る可能性もあります。本稿で述べるTigriopus ミヤコカブリダニ5動物のペアリング操作を制御するおよび彼らの開発を追跡してによってこれらの制限に対処するために設計された当社の最近の研究で使用される個々 の培養方法大人の段階にコペポタイドから
仲間を守る行動の定量的解析
動物行動学2,6の分野のみならず環境毒性や進化遺伝学3,4,などの他のフィールドにTigriopus種の仲間を守る現象を研究されています。7,8,9,10ですただし、以前の研究の技術的な障壁を作成する動作と、それを研究する手法の概要を説明する十分な視覚的な図解なしのフォームを書かれたこの現象を主にのコースを説明している、。レプリケーションおよび研究の進歩。ここでは、私たちは視覚資料によってサポートされてTigriopusカイアシ類の仲間を守って行動における主要なイベントのいくつかの詳細な説明を提供します。また装置や行動の定量分析のための方法を示します。これらのメソッドは、正確にレプリケートされた実験で仲間を守る時に動物の行動特性の評価を許可します。
これらのメソッドとTigriopus属の仲間を守る現象の制御で再現可能な研究の方法論的基礎を提供するために目指しています。

<table><tbody><tr><td>インスタントオーシャンシーソルト</td><td>スペクトラムブランズ株式会社</td><td>SS1-160P</td><td>培地</td></tr><tr><td>PRO PlecoWafers</td><td>Tetra</td><td>16447</td><td>カイアシ類用食品(乳鉢で粉砕して使用)</td></tr><tr><td>蓋付き平底6ウェル組織培養プレート</td><td>コーニング(株)</td><td>353224</td><td>妊娠雌と孵化したノープリウスの培養用容器</td></tr><tr><td>蓋付き平底24ウェル細胞培養プレート</td><td>コーニング株式会社</td><td>353226</td><td>個別培養用容器</td></tr><tr><td>蓋付き平底48ウェル細胞培養プレート</td><td>(株) ネストバイオテクノロジー(株)</td><td>748001</td><td>行動観察室</td></tr><tr><td>LEDライトパッド</td><td>Shenzhen Huion Animation Technology Co., Ltd.</td>行動<td>観察用</td><td>ライト LP4</td> バックライト</tr><tr><td>カメラ</td><td>Canon</td><td>0591C003 (型式:Rebel T6i)</td><td>行動記録用</td></tr><tr><td>パスツールピペット</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>13-678-6A</td><td>カイアシ類の移管用</td></tr><tr><td>P10 マイクロピペットチップ</td><td>VWR</td><td>613-0735</td><td>C1ステージのカイアシ類の移管用</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>Version 1.49t</td><td>半自動用映画の解析</td></tr><tr><td>MTrackJ</td><td></td><td>Version 1.5.1</td><td>Erik Meijering 博士(Biomedical Imaging Group Rotterdam, Erasmus University Medical Center, The Netherlands)が開発したトラッキング用ImageJプラグイン</td></tr></tbody></table>

tigriopusカイアシ類と仲間を守る行動の定量分析の個別培養

Individual Culturing of Tigriopus Copepods and Quantitative Analysis of Their Mate-guarding Behavior

岩場の潮たまりで一般的な動物プランクトンであるTigriopus、属カイアシ類は、男性がペアを形成する潜在的な仲間を留め中の仲間を守る現象を表示します。この現象は、研究者の関心を集めており、その分析方法が記述されていません。ここで我々 は、手順を説明します: 1) 個々 の培養とTigriopus少年と大人と彼らの仲間を守って行動 2) ビデオ ベースの分析のステージングします。培養方法は、行動テストの前に彼らの開発を追跡する機能と同様、動物の経験をペアリングの実験的制御をできます。解析メソッドは、男性によって試みをキャプチャ、水泳仲間守るペアの軌道など、仲間を守る行動のいくつかの側面の定量的に検討できます。これらのメソッドは、 Tigriopusのスンクスの確立された最初が適切な変更で彼らも適用できます他の動物プランクトン, 毒物学、生理学など、異なる研究分野の研究に、生態学的遺伝学。

手順 1 で説明した個々 の培養方法では、準備とペアリングの経験がない処女動物のステージングをことができます。
手順 2 で説明した行動のテストでは、 Tigriopusカイアシ類の仲間を守る現象の動画記録と観察をことができます。手順 3 と 4 で説明した方法で録画したビデオの次の検討は、図 1に示す動作のいくつかの側面の定量的解析できます。
図 11は、男性女性のペアとt. ミヤコカブリダニのオス-オスのペアの間の試みを守っての平均期間の違いを示しています。手作業による分析は、オス-オスのペアが男性女性のペアよりもペアリングの比較的短い期間を示したことを示した。
軌跡解析法の例を図 12に紹介し、速度解析の代表的な結果を図 13に示します。T. ミヤコカブリダニの新しく形成されたガード ペアの二次元空間追尾は、オス-オスのペアが最初の 3 に男性女性のペアよりも高い速度を表示する傾向があることを明らかにした試みを守っているのです。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58378/58378fig1.jpg"> 図 1: Tigriopusの仲間を守って行動します。(A)成人男性 (青い矢印で示される) 最初のアンテナと少年 (コペポタイド) を握りしめます。バー = 1 ミリメートル。 (B)の仲間を守る現象の概要。男性は、ターゲット個人 (左) をキャプチャしようとし (中央) それとペアを形成します。オス-オスのペアといくつかの男性と女性のペアは、交尾することがなくガードしようとを終了します。この図は、Tsuboko 石井とバートン 2017年5から変更されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58378/58378fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58378/58378fig2.jpg"> 図 2: Tigriopusの発達段階です。Tigriopus種は、一般的に (nvi NI) からの六つのノープリウス ステージ、(CV CI) からの 5 つのコペポタイド ステージおよび大人の段階 (CVI)16を受けます。男性試みるガード copepodids ( t. ジャポニカスとt. fulvus6,17 CI) とt. californicus3CII の早い段階から稚魚だけでなく、男女の5 の大人に.この図は、Tsuboko 石井とバートン 2017年5から変更されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58378/58378fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58378/58378fig3.jpg"> 図 3: 大人 (T. ミヤコカブリダニ) 形態。(A)成人男性。(B)成人女性。(C)受精と開発 (クリア オレンジ) 卵の卵の嚢と妊娠の大人の女性。(D)妊娠アダルト女性と未受精卵または未開発の卵の嚢 (ダーク グリーン) 卵。矢印は、卵嚢を示します。バー = 1 mm.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58378/58378fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58378/58378fig4.jpg"> 図 4: 個々 の文化のための準備の概要。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58378/58378fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58378/58378fig5.jpg"> 図 5: ぬけがらを脱皮します。(A)のぬけがらは、CI からt. ミヤコカブリダニの単一動物の CV 段階。バー = 1 ミリメートル。 (B)も個々 の文化の段階の CV に CI から脱皮。白い破片が (画像では表示されていません) よく培養動物の排泄物です。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58378/58378fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58378/58378fig6.jpg"> 図 6: 顕微鏡の下のぬけがらを検索します。バー = 1 ミリメートル。 異なる深さでぬけがらの検出のための顕微鏡の(A)焦点の変更。マゼンタ色の矢印が集中のぬけがらを示し、灰色の矢印は、やり場のないぬけがらを示します。上の画像は、井戸の底に沈んだある左のぬけがらに焦点を当ててください。下の画像は、培地表面下に浮遊している右のぬけがらに焦点を当てください。(B)上の画像は、培地表面に浮かんで残骸によって閉塞試験の例を示します。緑の矢印は、瓦礫の下に隠された、ぬけがらを示します。下の画像は、表面クリーニング ペーパー タオルの小さい部分との結果を示しています。クリーニングの後、ぬけがら (緑色の矢印で示される) が表示されます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58378/58378fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58378/58378fig7.jpg"> 図 7: ステージングおよび動物の性判別します。ぬけがらの数と培養プレートの蓋の上の動物のセックスをマークする方法の例です。(A) 5 ぬけがらと大人の動物を含む井戸の例です。ふたにタリー印の行数は、井戸のぬけがらの数を表します。アンテナ形態に基づいて 5 ぬけがらの数に達すると、動物の性別を決定ことができます (図 3を参照してください)。(B)培養プレートのマーク付きの蓋の例です。上位行を含むより古い (大人に CIV) 動物と下行には若い (すなわち、新たに収集した) 動物 (CIII に CI) が含まれます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58378/58378fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58378/58378fig8.jpg"> 図 8: 行動テスト方式。仲間を守る現象 (左) のビデオ録画と行動実験 (右) の概要を設定します。この図は、Tsuboko 石井とバートン 2017年5から変更されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58378/58378fig8large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58378/58378fig9.jpg"> 図 9: 行動テストの前に動物のリンス<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58378/58378fig9large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58378/58378fig10.jpg"> 図 10: 手動解析で検討したイベントの定義。仲間を守る試みに関連して観測されたイベントのイラスト。イベントの定義し、手順 3 で解析の名前が強調表示されます。点線で囲まれたイベントは、いくつかの仲間を守る試みで観測されないことが。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58378/58378fig10large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58378/58378fig11.jpg"> 図 11: 違い男女ペアとt. ミヤコカブリダニのオス-オスのペアの間の期間を守っている。各三角形の記号は、1 つのテストのペアからデータを表します。バー、ひげは、中央値と四分位範囲をそれぞれ表します。キャプチャの平均期間の男性女性のペアが大きかった (男性女性 (n = 22)、オス-オス (n = 29); * * マン-ホイットニーの U 検定でp &lt; 0.01)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58378/58378fig11large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58378/58378fig12.jpg"> 図 12: 守る試みの最初の 3 秒でペアの軌跡。男女ペア (左) とt. ミヤコカブリダニの (右) オス-オスのペアの履歴二次元軌跡の例です。軌道上のドットは時間ポイント (30 フレーム/秒) を表します。バー = 10 mm<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58378/58378fig12large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。</a> 。
<img alt="Figure 13" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58378/58378fig13.jpg"> 図 13: は男女ペアとt. ミヤコカブリダニのオス-オスのペアの間を守る開始後平均速度の差します。各三角形の記号は、1 つのテストのペアからデータを表します。バー、ひげは、中央値と四分位範囲をそれぞれ表します。最初の 3 組の速度守る試みの s のオス-オスのペアが大きかった (男性女性 (n = 13)、オス-オス (n = 35). * * * マン-ホイットニーの U 検定でp &lt; 0.001)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58378/58378fig13large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Suppl Figure 1" src="/files/ftp_upload/58378/58378sfig1.jpg"> 補足図 1: Tigriopusの挙動に関する治療を洗浄の影響。各円または三角形の記号は、1 つのテスト個人またはペアからデータを表します。バー、ひげは、中央値と四分位範囲をそれぞれ表します。「すすぎ」、「リンスではなく」グループ内の個人は、「リンスではなく」グループは、30 分調整時間 (ステップ 2.1.4) 前に洗浄処理 (手順 2.1.3) を経験していないことを除いて、同じ方法で処理されました。(A)すすぎ男性の平均速度はないリンス男性よりになる傾向が (リンス (n = 6)、ないリンス (n = 6)、n. s.: マン-ホイットニーの U 検定により有意差は検出されなかったテスト)。30 の速度を測定した s ビデオに基づいて調整時間後に記録します。(B)すすぎ女性の平均速度はリンスしない女性よりも大きくなければがち (リンス (n = 6)、ないリンス (n = 6)、n. s.: マン-ホイットニーの U 検定により有意差は検出されなかったテスト)。30 の速度を測定した s ビデオに基づいて記録調整後、次のステップ 4 (トラッキング間隔 = 0.5 秒)。(C)試みを守る回数リンス個人のペアの大きかった (リンス (n = 6)、ないリンス (n = 6). * * マン-ホイットニーの U 検定でp &lt; 0.01)。(D)すすぎ個人のペアのためのより大きいする傾向に試みを守っての期間 (洗浄 (n = 6)、ないリンス (n = 6)、n. s.: マン-ホイットニーの U 検定により有意差は検出されなかったテスト)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58378/58378sfig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

仲間を守る行動は、属Tigriopusの潮間帯のカイアシ類で重要な役割を果たしています。ただし、この現象を研究するための方法も記載されていません。ここで述べる方法: 処女Tigriopus動物と彼らの仲間を守る行動の定量的解析 2) の 1) 個々 の文化。

Tigriopusカイアシ類と仲間を守る行動の定量分析の個別培養

Copepods of the genus Tigriopus, which are common zooplankton in rocky tide pools, show precopulatory mate-guarding behavior where a male clasps a ...

この培養技術の主な利点は、ペアリング経験を制御し、その開発を追跡しながら、処女のコペポッドを得ることができるということです。以下の行動分析方法は、岩の潮のプールで一般的な動物プランクトンであるティグリオプスコペポッドの仲間守りの挙動に関する制御および再現可能な実験を助けることができる。これらの方法は、Tigriopusの生殖行動に関する洞察を提供することができますが、遺伝的および環境的要因がこれらのコペポッドの生理学的および行動にどのような影響を与えるかを調べるためにも使用できます。まず、パスツールピペットを使用して、ストック培養から透明なオレンジ色の卵を運ぶグラビッドメスを収集します。穏やかなピペットを介してきれいな培養培地で女性を洗いす。次に、各メスを清潔な培養培地を用いた6ウェル細胞培養板の個々のウェルに入れる。その後、卵嚢を放出するまでメスを培養するためにインキュベーターにプレートを置きます。卵嚢が放出された後、パスツールピペットを使用してプレートの井戸からメスを取り除きます。最初のコペポディクな段階またはCIの動物が出現し始めるとすぐに、それらを収集するためにP-10マイクロピペットを使用してください。2~3日ごとに、溶融物の滲出について井戸を監視する。この後、彼らのアンテナ形態を調べることによって動物をセックス。成人女性を正しく識別するには、一部の集団では成人女性と少年の間のアンテナの形状の違いが目に見えて重要ではないので、培養井戸ですでに5つの滲出液を溶融していることを確認してください。適切な段階と性別の動物を選択した後、細かく粉砕魚の食べ物で選択した個人を養います。動物が食べている間、試験室として2つの48ウェル平底細胞培養プレートを準備する。30分が経過した後、きれいな人工海水で満たされた24ウェルプレートの4つの井戸の連続にそれをピペットで各動物を洗い流します。その後、LEDライトパッドのプレートAとBの井戸にすすい個体を置きます。動物が30分間順応することを許可し、パスツールピペットを使用してプレートBからプレートAにターゲットを転送します。まず、各ターゲットがプレートAの井戸に移されたタイミングのビデオを調べ、次に、男性がターゲットの任意の身体部分を持つ男性のアンテナの接触としてガードの試みの開始を定義します。男性のアンテナの両方がターゲットの体から切り離されるポイントとして、男性によるガードの試みの終了を定義します。次に、男性の後部身体屈曲による交尾の開始を定義し、続いてウロソームを女性のそれに対して繰り返しプレスする。まず、映画編集ソフトウェアでムービーをトリミングすることで、興味のあるエピソードをフィーチャーしたビデオクリップを生成します。次に、ImageJ を開き、ビデオ クリップをインポートします。画像処理に必要なメモリを減らすには、隠された 8 ビットのグレースケール オプションを選択します。次に、スペキシャルキャリブレーション用の直線選択ツールを選択し、ウェルの直径に沿って選択線を描きます。設定された尺度メニューを開き、既知の距離ボックスに既知の長さを入力し、長さの単位ボックスに単位を入力します。この後、プロパティメニューを開き、フレーム間隔ボックスにフレーム間隔を入力します。プラグインと MtrackJ を選択して、MTrackJ プラグインを開きます。次に、ダイアログ ウィンドウのトラッキング ボタンをクリックして、トラッキング構成メニューを開きます。トラック中にローカル カーソル スナップを適用し、スナップ フィーチャとして暗い中心点を選択します。次に、MTrackJダイアログウィンドウの追加ボタンをクリックしてトラッキングを開始します。トラックするビデオクリップの個人をカバーするためにカーソルを置きます。次に、クリックして、正方形内のオブジェクトの暗い中心を検出します。データテーブルを生成するには、MTrackJダイアログウィンドウで測定テーブルをクリックし、ムービーボタンをクリックして、トラック軌道を色付きの線で描いたムービーを生成します。最後に、MTrackJ ダイアログウィンドウの保存ボタンをクリックして、トラックされた 2 次元軌道のデータを含む結果を保存します。本実験では、ティリオプスコペポッドの仲間守り行動を記録し、観察した。分析は、男性と男性のペアの男性の男性が男性と女性のペアの場合よりも比較的短い試行時間を示したティグリオプスカリフォルニカスの男女ペアとの間のガードの試みの平均期間の違いを示しています。Tigriopus californicusの新たに形成されたガードペアの2次元空間追跡は、男性と男性のペアがガードの試みの最初の3秒間に男性と女性のペアよりも高い速度を示す傾向があることを明らかにしました。その開発後、この技術は、民族学、生化学、進化遺伝学の分野の研究者が、これらのタイプのコペポッドのユニークな交配システムを探求する道を開きました。

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Tigriopusカイアシ類と仲間を守る行動の定量分析の個別培養

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