Name: 多嚢胞性卵巣症候群を研究するハイパーアンドロゲン マウス モデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: 学ぶ多嚢胞性卵巣症候群のマウスモデル構築法。ジヒドロテストステロンペレットを用いてハイパーアンドロゲン状態を再現し、生殖内分泌学と子孫への影響を研究する。一貫したホルモン放出と費用対効果の高い手法です。

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この仕事は健康の国民の協会 (南西に R00 HD068130 で補助金) とボルチモア糖尿病研究センターによって支持された: パイロットと可能性 (南西) に付与します。

詳しいプロトコル DHT ペレット作製と挿入、および生殖および代謝テストを紹介します。本研究で使用されるマウス混血 (C57/B6、CD1、129Sv) が維持された食糧とのジョンズホプキンス大学でブロードウェイ研究棟動物施設で 24 ° C で 14/10 h/明暗サイクルで水を自由医学。すべてのプロシージャは、ジョンズ ・ ホプキンス大学動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。
1. PCOS のようなマウス ・ モデルを作成します。
<ol><li>
DHT ペレット作製
	<ol>
<li>滅菌するオートクレーブ シラスティック チューブです。シラスティック チューブをかみそりの刃で 15 mm の長さにカットします。</li>
		<li>3 mL の注射器に接続されている 20 G の鈍い針とチューブにメディカル粘着シリコンを注入することによって 1 つの側面をシールします。プランジャーは、注射器とし、貯水池に挿入接着剤から撤退する必要があります。プランジャーを挿入し、針から出現し始めるとそれまで粘着プッシュ ダウン。鈍い針は強力なハサミで 20 G 針の鋭い先端側を切断によって行われます。シリコン チューブの長さはポスト プロダクション トリミング; のように 2 mm 以上にする必要があります。</li>
		<li>一晩乾燥;シール側の気泡を確認します。空気泡無しとのそれらは DHT ペレットに使用されます。他の人は、いいえ DHT 制御ペレットに使用できます。</li>
		<li>皮膚に DHT の露出を避けるためにフードの DHT ペレットを作る前に手袋、マスク、ゴーグル、白衣を着用します。</li>
		<li>プラスチックに注ぐ DHT 粉ボートと接着剤の開放側が DHT 粉にチューブ (A1.1 で生産) を頂いたプレスの重量を量る。</li>
		<li>DHT の粉末が整えられる、大型のクリップとを押さえ込んだことができます。 DHT 4 mm (または長さ) の高さに達するまで続行します。チェック定規、シールとシリコン、開いている側と DHT の長さは一晩乾かします。</li>
		<li>それぞれのシール側シリコン長さ 2 mm の長さにカットします。ペレットの長さの合計は 8 mm になります。</li>
		<li>コントロール (いいえ DHT) ペレットとして空シラスティック チューブの両サイドをシールします。</li>
		<li>ペレットを使用するまで室温で (露光しないように) 箔巻き 50 mL の円錐管にしてください。DHT ペレットは、ストレージの少なくとも 3 ヶ月の完全性を維持します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
DHT の挿入と置換
	<ol>
<li>20 DHT までペレットまたはコントロールのペレットが、30 mL 滅菌 0.9% 生理食塩水 37 °C 挿入直前平衡の 24 h で 50 mL の円錐管に別々 に沈んでいます。</li>
		<li>術前 clidox で表面と手袋を消毒、作業面がきれいなプラスチック バックアップ吸水紙 (外科パッド) で覆われています。 動物と接触するすべての楽器は、オートクレーブによる動物施設に入る前に浄化します。 ナショナルインスツル メンツは、乾燥して使用する前に冷却する許可されます。</li>
		<li>2 ヶ月齢の雌マウスを使用 (マウス/ケージ 4-5)。マウスはキシラジンを腹腔内に注入される (3.5 mg/kg bw) とケタミン (78.8 mg/kg bw) インスリン注射器を使用しています。混合と麻酔を投与量の計算は、テーブル 1にあります。</li>
		<li>適切な麻酔が達成される, つま先反射の消失によって測定される呼吸を減速した後、マウスは手術の準備中でしょう。</li>
		<li>滅菌ガーゼを使用して betadine で領域の皮膚を消毒して、70% エタノールできれい. 地域は、betadine に再び塗装されます。</li>
		<li>5 mm 程度で長さはさみ首付近の皮膚の下穴を開けます。10 G trochar を使用して、吻側方向に小さなトンネル (15 mm) を作る。ペレットは、trochar と背側に挿入されます。</li>
		<li>開口部を接着剤で封印します。手動でおおよそ傷の端鉗子と近似の創傷部に液状接着剤の薄膜を適用する穏やかなブラシ ストローク。蓄積 3 接着剤を確実に接着剤の薄層は、傷に均等に分散されます。接着剤タンブレロ傷の端のそれぞれの側に 1 cm を拡張してください。穴を閉じるには縫合や手術クリップが使えます。マウスを個別に収容、回復のための熱パッド、ケージに戻します。アンドロゲン暴露の一定レベルを維持する 4 週間ごとのペレットを交換します。オリジナルのペレットが削除され、新しいペレットは A1.15 同様の立場で説明するように挿入されます。</li>
		<li>DHT 挿入の 3 日後に発情周期をテストします。発情周期のステージは、膣細胞診により評価されます。 膣の細胞は、16 日間連続 p10 pipettor を使用して膣腔に滅菌生理食塩水 (約 10 μ L) を噴出して同じ滅菌ピペット チップと生理食塩水の撤回によって収集されます。 膣壁から脱皮腟の細胞生理食塩水を混ぜて、収集しました。</li>
		<li>ラベル付きのスライド上に細胞を生理食塩水を拡散します。各スライドは、六つのサンプルを含めることができます。スライドは、六つの場所のそれぞれでどのサンプルを配置するラベルです。</li>
		<li>生理食塩水の後が完全に乾いてスライドで、スライドを入れセルを修正し、100% エタノールが付いている容器。スライドは、少なくとも 5 分間固定する必要がありますが、定着剤でさらに使用されるまで無期限に残ることができます。</li>
		<li>バッファー B に 1 分間染色ソリューションと水道水、常温乾燥の C. 洗浄スライドにスライドを置きます。</li>
		<li>10 X の客観的光顕微鏡下で細胞の形態を調べます。 参照27,28,29proestrus (P)、発情 (E)、metestrus (M)、発情 (D) を区別するために細胞の形態を説明します。</li>
		<li>各日の段階し、各段階での時間の割合を計算する日数の合計数で割った値の数。</li>
		<li>DHT 挿入後 21 日目のマウスを一晩 (16 h) を断食と 20% ブドウ糖の 2 g/kg 体重を腹腔内に注入することによって耐糖能をテストします。たとえば、マウスの体重は 25 g、そのこのマウスを 20% ブドウ糖の 250 μ L で 50 cc (0.5 mL) インスリン注射器で挿入されます。ブドウ糖のレベルは、0、15、30、60、90 で尾静脈からの血液をサンプリングすることによって glucometer およびテスト ストリップによって評価されて 120 分。これについてはで詳細に他の場所で30。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
血のコレクション
	<ol>
<li>顎下腺静脈出血ランセット (ステロイドの 100 μ L、LH ・ FSH の試金のための 30ul コレクション ボリューム制限) DHT 挿入後様々 な日に 9 と 10 の間の血液を収集します。これは11で説明されます。</li>
		<li>4 ̊C, 10 分間で 6,000 x gで血液を遠心分離し、アッセイまで-80 °C で保存することができます別の 1.5 mL チューブに血清層を収集します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 生殖を評価する慢性的な DHT から女性の子孫のプロファイルは、ダムを挿入
<ol><li>
交尾
	<ol>
<li>テストする雌マウスは、ペレット挿入後 15 日間で実績のある肥沃な男性 (つまり雌マウスの子犬が既に) とケージに移動されます。</li>
		<li>マウスが妊娠しているかどうかにダムの体重毎週を文書化します。ダム一週間で 3 g 以上の体重増加量は、妊娠を示します。</li>
		<li>我々 は前に、の週から 3 g より大きいダムの体重増加を観察した後 2 週目ダムの血を収集します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
膣口と発情した思春期
	<ol>
<li>目視検査後、子犬は引き離される毎日で膣口を確認 21 日に出生後 (PND)、肛門性器間距離を測定し、膣口の年齢を記録します。</li>
		<li>膣が開いたらは、発情周期をチェックする 1.2.8–1.2.11 で説明したように膣に細胞を毎日収集しています。</li>
		<li>説明 1.2.12 として細胞の形態を観察し、最初の発情は日付として定義されているすべての細胞が角化上皮細胞であります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
本体重量と耳パンチ
	<ol>
<li>ランセット先端を浸しタトゥー ペーストと参照12/7 PND で説明として爪先のタトゥーとそれぞれの子犬をマークし、70 日齢まで 7 日ごとマウスの重量を量る。</li>
		<li>耳パンチ マウスそれらの番号は、図 1 12 に 16 の PND との間でシステムを使用してください。セックスを区別、体の腹側を調べて、女性に見える乳首があります。</li>
		<li>21、26、70 の血を集める PND 1.3.1 で上記の出産後</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ホルモン測定
	<ol>
<li>血清中の DHT レベル両方の酵素免疫測定法 (ELISA) により測定し、液体クロマトグラフィー ・ タンデム質量分析計 (LCMS)23,24,31,32。T は、LC-MS、またはラット/マウス再生23,24の研究センターでヴァージニアの大学リガンド アッセイ コアによって検証されている elisa 法によって測定されます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Klein, S. L., Bird, B. H., Glass, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+differences+in+Seoul+virus+infection+are+not+related+to+adult+sex+steroid+concentrations+in+Norway+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Sex differences in Seoul virus infection are not related to adult sex steroid concentrations in Norway rats.</a> J. Virol. 74 (17), 8213-8217 (2000).</li>
<li>Siracusa, M. C., Overstreet, M. G., Housseau, F., Scott, A. L., Klein, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((17beta-estradiol+alters+the+activity+of+conventional+and+IFN-producing+killer+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">17beta-estradiol alters the activity of conventional and IFN-producing killer dendritic cells.</a> J. Immunol. 180 (3), 1423-1431 (2008).</li>
</ol>

何も開示します。

検索は、PCOS の重要な機能です。このプロトコルで使用される (2 つの DHT マウスなし DHT マウスでより高い倍) 血清 DHT レベル前の研究で他の研究者によって報告されるそれらより低いし、比例して PCOS5,19、女性を模倣するように校正されています 20,21。他のモデルとは異なりこの 2 倍の DHT モデルは体重と DHT 挿入23,24後 3.5 ヶ月間なし DHT マウスと比較して全体の身体組成を変更しません。これら移植 DHT の成体は、継続的な外因性 DHT によって維持されます。全身体組成は変わらないがリーン PCOS 女性20構造の変化と脂肪細胞の機能を観察されています。異なる拠点の精査...

検索は、NIH の基準に従って多嚢胞性卵巣症候群 (PCOS) とアンドロゲン過剰な PCOS (AE PCOS) 社会の特徴です。PCOS をもつ女性は妊娠しにくいがあるし、1妊娠合併症のリスクを増加しています。妊娠する場合でも、彼らの女性の子孫は、健康への悪影響成果2,3を持っています。動物モデルは、様々 な戦略4,5,6,7,8,9,10,11を使用して開発されています。,12 PCOS (無排卵、または障害者の血糖、インスリン耐性) の体重増加と肥満肥大脂肪細胞サイズと重量は増加した脂肪細胞に関連付けられている機能の多くを展示します。PCOS を研究に使用される動物のモデルを生産する 2 つの主要な方法があります。13出生後治療高レベルのアンドロゲン直接 (外因性アンドロゲン注射/挿入) または直接 (アンドロゲンへの変換エストロゲン アロマターゼ阻害剤をブロック) などであります。別は、アンドロゲンの胎児 hyperexposure 妊娠14,15中に子孫を勉強します。たとえば、アカゲザル16,17、羊18、および子宮内胎児期アンドロゲン男性レベルにさらされる齧歯動物からの女性の子孫は、人生の後半 PCOS のような形質を開発します。これらのモデルは大幅上昇アンドロゲン効果と胎児のプログラミングや子宮環境への影響の理解を強化しました。ただし、これらのモデルは独自の制限があります: 1) 動物が肥満を開発し、生殖性肥満や代謝不全; から hyperandrogenemia の効果を分離するは困難です2) 妊娠前に PCOS をもつ女性は既にアンドロゲンの高レベルを示す、従って卵子は受精; 前に過剰なアンドロゲンにさらされています。3) 薬理学的用量テストステロン (T) または出生後または妊娠の間に使用されるジヒドロテストステロン (DHT) は、多嚢胞卵巣のアンドロゲン環境を表さない場合があります。卵巣の卵胞液や血清テストステロンと DHT のレベルが測定され、テストステロンと DHT のレベルが 1.5 〜 3.9 倍 PCOS5,19,20,21 の女性で高い ,22,23影響を受けない女性と比較されました。我々 は、成体マウス モデル23,24,25の 4 mm のペレットの挿入から慢性の DHT 露出の開始の 2 週間以内生殖、代謝不全を開発作成クリスタル DHT パウダー (ペレットの長さの合計は 8 mm)。このモデルは、DHT 処置なしコントロール マウスの場合に比べて倍高い (2xDHT と呼ばれる) については、血中 DHT を生成します。2xDHT マウスが基底血清エストラジ オール、テストステロン、LH の変化を示さない、肥満を開発しないように、表示する同様の卵巣重量, 血清コレステロール、遊離脂肪酸、レプチンは、tnf α, il-623,24、 25相対的に制御する DHT 挿入23,24,25後さらに最大 3.5 ヶ月。また、PCOS の機能を既に開発している雌を交配による子孫15の代謝と生殖に関する健康にハイパーアンドロゲン母体環境の影響を学ぶことができます。
この新しいパラダイム (NIH と AE PCOS 社会基準に関連する) は、比較的同じようなレベルのこれらの女性にアンドロゲンで PCOS 2 ~ 3 倍より高いテストステロンまたは影響を受けない女性に比べて DHT レベルを生成することによって病気をモデル化します。ただし、このモデルが DHT を撤回したら、継続的な外因性 DHT によっておよびプログラムされた内因性検索からではなくが管理されます。この記事の全体的な目標は、1 に焦点を当てるには) どのように DHT ペレット;2) マウス モデルのようなリーン PCOS を生成する方法3) これらのダムから女性の子孫を評価する戦略。他の測定と表現型の評価、本稿では取り上げませんが、5,15,23,24,25,26で見つけることができます。

<table><tbody><tr><td>結晶性5&-DHT粉末</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>A8380-1G</td><td></td></tr><tr><td>ダウコーニングシラスティックチューブ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>11-189-15D</td><td>0.04インチ/ 1ミリメートル内径x0.085インチ/ 2.15ミリメートル外径</td></tr>医療用<tr><td>接着剤シリコーン</td><td>第II因子、InC。</td><td>A-100</td><td></td></tr>ゴー<tr><td>グル、白衣、手袋、マスク。</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 &micro;フィルターなしLピペットチップ</td><td>USA Scientific</td><td>11113700</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スライド 塗抹標本用</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-003</td><td></td></tr><tr><td>細胞染色用 Diff Quik</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>NC9979740</td><td></td></tr><tr><td>ランセット</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>NC9416572</td><td></td></tr><tr><td>3 mL シリング</td><td>ベクトン、ディキンソン・アンド・カンパニー (BD)、</td><td>30985</td><td></td></tr><tr><td>付属の針:20G</td><td>BD</td><td>305176</td><td></td></tr><tr><td>定規:ミリメートルスケールで10cmより任意の長さ。</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>キシラジン</td><td>獣医1 AnnSeA LA、MWI、ボイシ</td><td>NDC13985-704-10</td><td>100 mg / mL</td></tr><tr><td>ケタミン塩酸塩</td><td>Hospira、Inc</td><td>NDC 0409-2051-05</td><td>100 mg / mL</td></tr><tr><td>外科用ステープル</td><td>AutoClip&reg;システム、ファインサイエンスツール</td><td>12020-00</td><td></td></tr><tr><td>インスリン注射器</td><td>BD</td><td>329461</td><td>1/2 CC、低用量 U-100 インスリン注射器</td></tr><tr><td>トロカール</td><td>革新的な研究</td><td>アメリカの MP-182</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>カールツァイス プリモスター</td><td>415500-0010-001</td><td>ドイツ</td></tr><tr><td>耳穿孔器</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>13-812-201</td><td></td></tr><tr><td>テストステロンラット/マウス ELISAキット</td><td>IBL</td><td>B79174</td><td></td></tr><tr><td>DHT ELISA キット</td><td>アルファ診断インターナショナル</td><td>1940</td><td></td></tr><tr><td>ワンタッチウルトラグルコメーター</td><td>ライフスキャン株式会社</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ワンタッチウルトラテストストライプライフ</td><td>スキャン株式会社</td><td></td><td></td></tr><tr><td>エッペンドルフチューブ</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>05-402-18</td><td></td></tr><tr><td>カミソリブレード</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-640</td><td></td></tr>クリ<tr><td>ドックス</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>NC0089321</td><td></td></tr><tr><td>外科用アンダーパッド</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>50587953</td><td>メーカー:アンドウィンサイエンティフィック56616018</td></tr><tr><td>ベタジン消毒液</td><td>ウォルグリーン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3M Vetbond (n-ブチルシアノアクリレート)</td><td>3M Science.人生</td><td></td><td></td>への応用</tr></tbody></table>

多嚢胞性卵巣症候群を研究するハイパーアンドロゲン マウス モデル

A Hyperandrogenic Mouse Model to Study Polycystic Ovary Syndrome

Hyperandrogenemia は女性の生殖、代謝機能に重要な役割を果たしているし、多嚢胞性卵巣症候群の特徴であります。PCOS をもつ女性を模したリーン PCOS のようなマウス モデルの開発は臨床的に意味があります。このプロトコルでは、このようなモデルについて述べる.DHT (ジヒドロテストステロン) 結晶粉末ペレットの 4 mm 長さを挿入することによって (ペレットの長さの合計は 8 mm)、それを毎月交換して血中 DHT レベル 2 倍ない DHT (いいえ DHT) で移植したマウスより高いと PCOS のようなマウスのモデルを生成することがおります。体重と体組成を変更することがなく生殖、代謝不全を見ました。不妊症の高度を示す、これらの PCOS のような雌マウスの小さなサブセットは妊娠して得ることができる、彼らの子孫は、大人として思春期遅発症、増加したテストステロンを表示します。PCOS のような無駄のないマウス PCOS とこれらの PCOS のようなダムから子孫の病態を検討する有用なツールです。

血中 DHT 濃度とブドウ糖負荷試験
DHT のレベル測定した血清の収集から両方の elisa 法による LCMS によるプロトコル 1.24-1.25、2.9 3.0 によると.DHT の絶対値が異なる質量分析法と elisa 法、ただし、DHT 対なし DHT 挿入されます。 両方の試金からと全体実験15,23,24 (の相対倍 (約 2 倍)図 2 a)。 DHT のレベルが DHT となし DHT マウスの妊娠による先入観から大幅に増加、しかし、DHT のレベルが倍 (交尾の前に 1 日) pregestational 両方でなし DHT マウスに比べて DHT マウスで高いと妊娠 (およそ 14 日間)時...

PCOS とこれらの PCOS のようなダムから子孫の病態を検討するジヒドロテストステロン ペレット リーン PCOS のようなマウス モデルの開発について述べる.

Hyperandrogenemia plays a critical role in reproductive and metabolic function in females and is the hallmark of polycystic ovary syndrome. Developing a ...

この方法は、再生の分野で重要な質問に答える助けになります。そして内分泌学。多嚢胞性卵巣症候群またはPCOSおよび高アンドロゲン症の研究に適用可能である。この技術の利点は、それが一貫した促進することです, 均一な, 高価な効果的な方法でホルモンの長期放出.手順を治療するJHは、私の研究室の技術者であるPing Xueになります。ジヒドロテストステロンまたはDHTペレット調製の場合は、カミソリの刃を使用して15ミリメートルのシリコーンチューブを切断します。そして、鈍い20ゲージ針を装備した3ミリリットルの注射器を使用して、チューブの一端に2〜5ミリメートルの医療用接着剤シリコーンを注入します。チューブを一晩乾燥させます。そして、密閉された端に気泡を確認してください。適切な個人用保護具を着用すると、流れの中でプラスチック製のウェイボートにDHT粉末を注ぎます。接着剤キャップチューブの開いた端を粉末に押し付けます。大きなストレートペーパークリップを使用して、DHTが適切な実験深度に達するまで、粉末をチューブに踏み込みます。その後、チューブの開いた側を一晩シリコーンで密封します。翌朝、各密封された側を切り、DHTの両側に2ミリメートルの長さのシリコーンを得て、DHT制御ペレットを得なかった。その後、ペレットを最大3ヶ月間室温でホイルで包んだ50ミリリットルの円錐管に保管します。PCOSマウスモデル生成のために20までのDHTまたはコントロールペレットを含む別々の50ミリリットルの円錐管で0.9パーセントの生理食塩水の30ミリリットルを含む摂氏37度で24時間。翌日、生後2ヶ月の雌マウスのつまみへの応答の欠如を確認し、滅菌ガーゼを使用してシーケンシャルなポビドネヨウ素および70%のエチノールスクラブを外科領域に投与する。次に、首の近くの皮膚を通して5ミリメートルの切開を行います。そして、10ゲージのトロカールを使用して、ロストラル方向に15ミリメートルのトンネルを作ります。トロカールを使用してペレットをトンネルにドーサリーに挿入し、外科用接着剤で切開を密封します。手動で鉗子で創傷の端を近似し、穏やかなブラッシングストロークを使用して、液体接着剤の3つの薄膜層を対向した創傷エッジの両側から1センチメートルに塗布する。その後、完全な再実行まで監視とヒートパッド上のケージに一人でマウスを置きます。アンドロゲン暴露の一定レベルを維持するために4週間ごとにペレットを交換します。ペレット挿入の3日後、p10ピペットを使用して10マイクロリットルの無菌生理食塩水を膣腔に噴出し、ピペットチップを使用して生理食塩水をすぐに回収します。膣細胞生理食糸サンプルをラベル付きスライドに広げる。そして、生理食糸を室温で乾燥させます。乾燥したスライドを100%エチノールの容器に少なくとも5分間固定します。次に、スライドをバッファーBにそれぞれ1分間染色し、dif-quick染色キットからCをバッファーします。バッファーの終わりにCインキュベーションは、3秒間水道水でスライドを洗浄し、室温でそれらを乾燥させます。エストルース環状性を決定するために、光顕微鏡の10倍の目的の下でスライドを見る。各ステージの日数をカウントし、各ステージでの時間のパーセントを計算する合計日数で除算します。グルコース耐性を試験するために、DHT挿入を20日間、マウスを一晩速くする。翌朝マウスの体重を量り、グルコメーターとテストストリップを使用して、尾静脈血のバジルグルコースレベルを測定する。20%デキストロースの体重1キログラムあたり2グラムでマウスを注入します。次に、デキストロース投与後15、30、60、90、120分で尾静脈血液サンプルのグルコースレベルを測定する。DHT挿入ダムから雌の子孫を取得するには、ペレット挿入に続いて、15日目に証明された肥沃な男性とケージでテストされた女性のマウスを移動します。毎週ダムの体重を文書化して、マウスが妊娠しているかどうかを判断します。出生後7日目に、ランセットの先端をタトゥーペーストに浸し、つま先に入れ墨を付けます。マークされたマウスの体重は、70日齢まで7日ごとに測定されます。出生後12日から16日の間に、図に示すように、マウスを耳に打ち込み、システムに従って番号を付ける。性別を区別するには、タグ付けされた各マウスの腹側を調べる。メスは目に見える乳首を持つことになります。様々な下流分析のための血液サンプルを収集するには、ランセットを使用して、顎下静脈出血によって9時から10時の間の血液のおよその実験量を収集する。そして、血清採取を可能にするためにサンプルを遠心分離する。その後、分析までマイナス80°Cで1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに血清サンプルを保存します。DHT女性の子孫の思春期を評価するには、出生後21日目に離離した後、毎日、目視検査によって膣の開口部をチェックする。そして、アノ生殖器の距離を測定するためにキャリバーを使用してください。血清DHTの絶対値は質量分析とエリサ分析では異なりますが、DHTと非DHT挿入の相対的な民俗変化はアッセイと実験の両方から似ています。DHTレベルは、DHTおよびDHTマウスなしの両方で妊娠を通じて受胎前から有意に増加する。しかし、DHTマウスでは、DHTマウスでは受胎前および妊娠時の両方の時点でDHTマウスがないのに比べてDHTレベルが2倍高い。成人のDHTの娘は生殖機能の違いを示す。例えば、メステス・ダイスで有意に長い時間を経験し、前エステルおよびエステル系で有意に長い時間を経験する成人のDHT娘と比較して、破壊されたエーテルの周期性。この手順を試みている間、彼らはホルモンの均一な放出に使用される前に24時間のペレットをインキュベートすることを覚えておくことが重要です.この手順に従って、DHT曝露の生殖および代謝の結果も調べることができる。開発後、この技術は、エンドロクロノロジーと母体胎児の相互作用の分野の研究者がPCOSと女性マウスにおける低レベルの高アンドロゲン症の影響を研究する道を開きました。DHTでの作業は非常に危険であり、手袋やマスク、ゴーグルの着用、バイオセーフティフードでの作業などの予防措置は、常にこの手順を実行しながら取るべきであることを忘れないでください。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

この記事では、マウスの多嚢胞性卵巣症候群(PCOS)をモデル化するためのジヒドロテストステロン(DHT)ペレットを準備して挿入する方法について説明します。この例のプロトコルは、生殖および代謝研究に使用されるマウスでの手順を示しています。...

皮下ジヒドロテストステロン(DHT)治療:多嚢胞性卵巣症候群(PCOS)のマウスモデル

子宮内膜症の多くのげっ歯類モデルは、技術的な複雑さ、再現性、および/または免疫不全動物または特別なレポーターマウスの必要性によって制限されています。我々は、独立して検証可能な客観的なスコアリングシステムを有し、卵巣切り出しまたは生存手術の要件を持たない任意の実験マウスを使用して、病変誘導の簡略化されたシステムを提示する。...

自然サイクリングマウスを用いた子宮内膜症のシンジニアスマウスモデル

本研究では、多嚢胞性卵巣症候群マウスモデルにおける肝グルコース産生の直接測定を、タンデムにおける空腹時およびグルコースが豊富な状態の両方で尾静脈 を介して...

多嚢胞性卵巣症候群マウスモデルにおける肝グルコース産生の評価

さまざまな性腺外組織および臓器における卵胞刺激ホルモン(FSH)は、複数の疾患の病因と関連しています。卵巣摘出術およびFSH処理マウスモデル(OVF)を使用して、FSHの性腺外作用を調べることができます。...

マウスモデルにおける卵胞刺激ホルモンの in vivo での独立効果の探索

この研究では、臨床的に重要な子宮内膜症のサブタイプである子宮内膜腫をシミュレートするために特別に設計された新しいマウスモデルを紹介します。C57BL/6Jマウスを用いることで、子宮内膜腫関連不妊症の病態生理学的メカニズムを解明し、現在の生殖医療の知見ギャップを埋める精緻なツールを提供することを目指します。...

子宮内膜腫に関連する不妊症を研究するための実験的モデルマウスの確立

このプロトコルでは、ミニポンプを使用して制御されたレトロゾール放出を通じて、マウスに多嚢胞性卵巣症候群 (PCOS)...

マウスにおける多嚢胞性卵巣症候群の誘導のための改良技術

エンハンサー活性の実験的検証は、機能喪失分析によって最もよくアプローチされます。ここで紹介するのは、CRISPR/Cas9を介した欠失を使用して、ハイブリッドゲノム(Mus musculus129 x Mus castaneus)を含むF1...

生成CRISPR / Cas9媒介1アレル欠失マウス胚性幹細胞でエンハンサー機能を研究するために、

このプロトコルは、マウス着床前胚において系統の仕様を研究するために、タンパク質発現のin situ分析 、定量的、単一のセルを実行するための方法を提示します。胚盤胞のコレクションのために必要な手順、全マウント免疫蛍光タンパク質の検出、共焦点顕微鏡での試料の画像化、および核分割及び画像解析について説明します。...

マウス着床前胚でリネージュの仕様を研究するためのタンパク質発現の定量分析

このプロトコルでは、分離、カルチャ、および石灰化弁のラット由来間質細胞の石灰性大動脈弁疾患 (CAVD) の高い生理生体外モデルをについて説明します。このモデルラットの搾取は、CAVD...

初代ラットの分離と性状バルブ間質細胞: 大動脈弁石灰化を研究するための新しいモデル

ここでは、分岐の形態形成および末梢神経、血管、免疫細胞分布のパターンを視覚化することを可能にする全体の大人マウス耳介皮膚に高解像度全体マウント画像処理手法について述べる。...

大人の耳の皮膚の共焦点顕微鏡を全取り付ける: 神経血管分岐の形態形成と免疫細胞の分布を検討するモデル システム

学ぶ多嚢胞性卵巣症候群のマウスモデル構築法。ジヒドロテストステロンペレットを用いてハイパーアンドロゲン状態を再現し、生殖内分泌学と子孫への影響を研究する。一貫したホルモン放出と費用対効果の高い手法です。

多嚢胞性卵巣症候群を研究するハイパーアンドロゲンマウスモデル

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