Name: ホルスタイン種乳牛におけるミトコンドリア呼吸を推定する肝ミトコンドリアの酸素消費量とプロトン リーク動態測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-30T13:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: 学ぶ肝ミトコンドリアの酸素消費量とプロトンリーク動態測定法。ホルスタイン種乳牛のミトコンドリア効率と飼料効率の関係を評価し、栄養エネルギー学の研究に応用できます。

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この研究は、食品動物健康 UC デービス校獣医学校の中心を通ってアルテックと米国農務省のハッチの資金によって支えられました。

すべてのメソッド、プロトコルおよびここで説明した研究がデイビス機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) カリフォルニア大学によって承認されました。
1. ホルスタイン種の乳牛から肝生検を取得
注: 肝生検は、認可された獣医によって実行する必要があります。肝生検は、牛がある乳製品のサイトで実行できます。泌乳牛は通常搾乳を続けることができ、ミルクがプロシージャの前後に食糧供給から撤退する必要はありません。少なくとも 4 人が乳牛の肝臓の生検を実施する必要がお勧めします: 生検生検エリア、獣医、移動反応するペンの外側にラボ技術者を保護するために牛の股関節に立つ動物ハンドラーを実行する獣医師小胞体ツール、材料および生検サンプルと獣医師から、車両 (図 1) の奥に技術者が肝のサンプルを取得し、ミトコンドリアの分離を開始することができます清潔を維持します。
<ol><li>肝生検の前に 1 ヶ月与える牛クロストリジウム属の予防接種です。オートクレーブ滅菌手術用タオル、生検機器、メス ホルダー、手術用機器、手術用のパックを作成します。</li>
	<li>1 日肝生検の前に、首の皮下セフチオフル塩酸 0.044 mL/kg 体重で牛を挿入します。牛温度, 摂取量と正常な機能のベースラインとして使用する糞便のスコアを監視します。</li>
	<li>4 ° C でミトコンドリアの分離メディア (MIM) 含 220 mM マンニトール、70 mM ショ糖、20 mM HEPES、1 mM EDTA および 0.1% (w/v) 脂肪酸無料 BSA、pH 7.4 を作成します。サンプルあたり約 30 mL 必要になります。</li>
	<li>必要に応じて物理的にホールターをヘッドロックを利用した牛 (図 2) を抑制します。支柱の左側に頭を結ぶホールターを使用します。必要に応じて、化学的拘束 (キシラジン塩酸塩 100 mg/mL IV で 0.010 0.015 mg/kg 体重) 使用することができます。</li>
	<li>生検の所が右 10-11 肋 (図 3) であります。右塊茎腸骨から右肩の点に直線を描画します。生検は、この行が 10-11 肋と交差する場所です。10 cm の正方形領域 (図 4) を剃ることによって生検する牛の領域を滅菌します。円運動を使用して 10 %providone スクラブ (図 5) で領域を洗ってください。70% エタノール溶液 (図 6) と領域をスプレーします。Providone とエタノールの洗浄の繰り返し。 注: 肝臓は肉用牛と比較してホルスタイン種乳牛のわずかに異なる位置にです。</li>
	<li>皮膚と基になる筋肉と結合組織 (図 7) の麻酔を提供する区域にローカルで 2% リドカイン塩酸 (10-15 mL) を挿入します。Providone と 70% エタノール洗浄を繰り返します。 注意: 神経終末が皮膚、筋肉がない内臓、anesthestic ローカルのみが必要です。せいぜい、牛では生検の手順の中にいくつかの圧力と痛みを感じる必要がありますのみ。</li>
	<li>10-11 肋間スペース (図 8) の皮膚を 1-2 cm の鍔を作る。皮膚を通して Schackelford コートニー ウシ肝生検装置を渡すし、横隔膜と肝臓 (図 9、図 10) を継続しながらわずかな頭蓋方向に生検機器を直接します。肝臓 1 g サンプルを入手し、計測器 (図 11) を削除します。縫合の配置 (図 12) と皮膚を閉じます。</li>
	<li>サンプルでは、即時のミトコンドリアの分離のための氷の上をカバーする十分な MIM と円錐管の場所肝臓サンプル</li>
	<li>チェック切開、赤み、腫れ、熱、または生検の 24 時間以内に痛みなどの注入牛首の皮下セフチオフル塩酸 0.044 mL/kg 体重 (図 13) 次の 3 日の日に 1 回。肝生検後 1 週間毎日牛の温度、摂取量と糞便のスコアを監視します。熱を開発し、獣医師の判断で抗生物質を続けます。 注: 牛の肝生検後 1 時間以内に触れる痛み、切開部位、recumbancy、赤み、熱、または反応で蹴るなどの兆候が現れてフルニキシンの 1 mg/kg 体重の点滴が痛みや炎症を軽減するために使用できます。第 2 の注射は、必要に応じて管理できます。</li>
	<li>生検後 7 日間縫合糸を削除します。</li>
</ol>2。 乳牛の肝臓のミトコンドリアを絶縁する
<ol><li>牛から肝のサンプルを削除すると後に、できるだけ早く赤血液細胞を除去し、サンプルをはさみで細かくミンチに MIM (手順 1.3) で肝臓サンプルを洗浄します。肝臓は、組織の潤いを保つに十分な分離メディアを含む冷蔵ビーカーでみじん切りする必要があります。</li>
	<li>30 mL のバイアルに 0.16 mm クリアランス氷孵化し、MIM (1:4 w/v) を含むテフロン乳棒とみじん切り肝臓を配置します。</li>
	<li>4 ストローク/分と分のため 500 rpm でテフロン乳棒で肝臓サンプルをホモジナイズしてください。 注: 全体のプロセス中に MIM で氷満載のビーカーにその肝臓ホモジネートの保管され、4 ° C ですべての遠心分離手順の完了</li>
	<li>10 分間 500 x g でホモジネートを遠心分離機、ペレットを破棄、冷蔵遠心チューブに上清を転送およびミトコンドリアのペレットを取得する 10 分間 10,000 x g で結果上澄みを遠心分離します。</li>
	<li>再懸濁します脂肪酸無料 BSA を用いた MIM の 10 mL にペレットを洗いし、10 分破棄上清の 8100 × g で遠心分離機します。</li>
	<li>再懸濁します脂肪酸無料 BSA なし MIM の 10 mL にペレットを洗いし、10 分破棄上清の 8100 × g で遠心分離機します。</li>
	<li>分離媒体の 200 μ L でペレットを中断し、氷の酸素消費量とプロトン リーク カイネティックアッセイに使用されるまでの場所します。</li>
	<li>標準として BSA と製造元のプロトコルごとビシンコニン酸 (BCA) キットを使用してペレット懸濁液 (1/100 倍希釈液) のタンパク質濃度を決定します。すべてのタンパク質は、ミトコンドリアのタンパク質と見なされます。</li>
</ol>3. ミトコンドリアの酸素消費量 (3 および州の 4 州) の測定
<ol><li>5 mM Hepes と 1 mM グリコールエーテルジアミン四酢酸、pH 7.4 0.3% と 30 ° C で脱脂 BSA、120 mM KCl、5 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2から酸素消費メディア (OCM) を作成します。サンプルあたり約 3 mL 必要になります。またエタノール 8 μ g/mL オリゴマイシンのソリューションを準備します。</li>
	<li>OCM を 30 ° c. で孵化させなさい(Oxygraph システム) の製造元の指示に従って呼吸室、ポンプと酸素電極を設定します。Oxygraph ソフトウェアは、コンピューターに既にインストールされている必要があります。</li>
	<li>OCM の 1 mL を呼吸室に置き、積極的にかき混ぜます。ソリューションが空気と飽和することを保証するために役立ちます。</li>
	<li>呼吸室にミトコンドリア蛋白質の 0.35 mg タンパク質を加えるし、30 ° C に温度を維持</li>
	<li>約 5 分間の酸素消費量を記録します。Oxygraph システム レコード酸素濃度は酸素呼吸につれて、減少します。酸素消費に変わったら定数 (減少ストレート ライン) レコードの酸素消費量 (直線の傾き/時刻の酸素の濃度を =)。これがベースライン酸素消費量です。</li>
	<li>複合体を阻害する 4 mM ロテノン ソリューションの 1.25 の μ L を追加私、5 mM コハク酸呼吸部屋の最終濃度に到達する 1 M コハク酸溶液 5 μ L を追加。これは、呼吸です。</li>
	<li>100 μ M の呼吸室に最終濃度に到達する 100 mM ADP ソリューションの 1 μ L を追加します。酸素濃度が (高められた呼吸) が減少し、直線となる約 5 分後。酸素消費量を記録 (直線の傾き/時刻の酸素の濃度を =)。これは、状態 3 呼吸です。</li>
	<li>オプション: 実行の最後に、最大の呼吸を誘発する FCCP (0.2 μ M 総巻) を追加します。(約) 約 5 分間呼吸を記録します。時の酸素消費量一定、レコードの酸素消費量になります。これは、最大酸素摂取量です。</li>
	<li>呼吸制御比率 (RCR) 状態 3 酸素消費量の方程式を使って計算/4 酸素消費量の状態します。</li>
	<li>すべての呼吸室からソリューションを吸い出しなさい。ダブルの脱イオン水で数回チャンバーをすすいでください。</li>
</ol>4. ミトコンドリア膜電位 (MMP) とプロトン動機力 (PMF) の測定
<ol><li>エタノール 80 ng/mL nigericin のソリューションを準備します。 注: これらの化学物質は、エタノールに溶解し、エタノールできます電子輸送システムを切り離すし、ミトコンドリアの機能不全を引き起こすので、未満 1 μ L に追加されるエタノールの量を制限するためにあらゆる努力をすべきであります。</li>
	<li>チャンバー内に二重の脱イオン水を徹底的に洗浄後呼吸室に、OCM の 1 mL を置き、電磁攪拌棒で積極的にかき混ぜます。ソリューションが空気と飽和することを保証するために役立ちます。セットアップを商工会議所にメチル トリフェニル ホスホニウム (TPMP +) 敏感な電極を追加します。TPMP + 電極を pH メーターに接続する必要があります、値が pH メーターから読み取られます。</li>
	<li>呼吸室にミトコンドリア蛋白質の 0.35 mg を追加します。</li>
	<li>1.25 μ L (約) 2-5 分のための複雑な I. レコード呼吸を阻害する 4 mM ロテノン ソリューションを追加します。時の酸素消費量一定、レコードの酸素消費量になります。</li>
	<li>8 μ g/mL のオリゴマイシン向け 2.8 μ g オリゴマイシン ADP 使用率を抑制するミトコンドリア蛋白質の 0.35 mg の最終的な集中の 0.56 μ L を追加します。(約) 2-5 分の呼吸を記録します。時の酸素消費量一定、レコードの酸素消費量になります。</li>
	<li>ミトコンドリア内膜の間で pH 勾配を廃止する 0.112 μ L 80 ng/mL nigericin ソリューションを追加します。(約) 2-5 分の呼吸を記録します。時の酸素消費量一定、レコードの酸素消費量になります。 注: ロテノンとオリゴマイシンを使用してブロックする電子輸送鎖複合体私は、ATP 合成酵素、それぞれ。Nigericin は、電極で測定することができます K + グラデーションに貫通型 H + 勾配を変換するのに追加されます。</li>
	<li>TPMP + 標準曲線を準備するには、ミトコンドリアのインキュベーションに 10 mM TPMP + ソリューションの 5 μ L を追加します。2.5 μ M TPMP + の合計濃度が追加されるまでに、このステップ 4 回を繰り返します。</li>
	<li>商工会議所に 1 M コハク酸の 5 μ L を追加することによって呼吸を開始します。</li>
	<li>安定したトレースを達成するまで呼吸を記録し、その後、マロン酸を追加することによってシステムを滴定しなさい。マロン酸の追加は、0.5 μ、1 μ L、1.5 μ L、3.0 μ L、6.0 μ L、9.0 μ L、0.1 mM 0.1、0.2、0.3、0.6、1.2、1.8、培養室でマロン酸濃度の連続する追加を実現するマロン酸のソリューションの 2.5 mM、12.5 μ L にする必要があります。</li>
	<li>2 つの電極 (酸素と TPMP+) からデータを収集します。ミトコンドリアの酸素消費量とミトコンドリア膜電位の同時測定を収集し、リアルタイムでの酸素消費量の変化を観察する oxygraph システムからのデータ集録ソフトウェアを使用できます。図 14は、oxygraph システムが実験が進むにつれて酸素消費量を記録する方法を示しています。</li>
	<li>ネルンストの同等化に基づく mV で MMP を計算します。 MMP = 61.5 ログ ([TPMP +] 追加-外部 [TPMP +]) x TPMP+ 結合補正/(x 0.001 mg タンパク質/mL の x [TPMP +]) ミトコンドリアのタンパク質-1の 0.4 μ L/mg の TPMP + バインド補正が使用されます。 プロトコルの濃度に基づく計算の例: MMP = 0.4 x 61.5 x ログ (5 μ M-2 μ M)/(0.001 × 0.35 mg ミトコンドリア蛋白質/mL x 2 μ M) MMP = 198.9 mV</li>
	<li>見積もり PMF MMPと酸素消費量 (図 15) のグラフをプロットすることによってです。PMF が 165 の膜電位における酸素消費量として報告された mV。 注: マロン酸 (0.1 から 2.5 mM) と電子輸送鎖を滴定 MMP にプロトン リークの動力学的挙動を示しています。その後、酸素消費量に対して MMP をプロット陽子リーク速度を決定します。PMF は一般的な膜電位における酸素消費量を計算することによって決定されます (165 mV)。</li>
	<li>サンプルの最後の実行の最後に、最大の呼吸を誘発し、基線補正用 TPMP + リリース FCCP (0.2 μ M 総巻) を追加します。</li>
	<li>すべての呼吸室からソリューションを吸い出しなさい。ダブルの脱イオン水で数回チャンバーをすすいでください。一日の終わりには、商工会議所も洗い流してください数回エタノール。</li>
</ol>

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</ol>

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プロトコルの最も重要な点は代表的な肝組織サンプルを取得し、生検後できるだけ早くミトコンドリアの分離を開始します。呼吸測定の変化は低所に牛から短い輸送時間のため (表 1)。輸送時間を減らすためには、小さな実験室を設置、酪農場の事務所で、ミトコンドリアが生検の 10 分内に分離されるので、各収集された、肝臓サンプルが事務所に追い込まれました。セットアップと呼吸室と電極 (酸素、TPMP +) プロトンの勾配の記録の違いに前日の収集と処理のサンプルはプロトン リークの初期測定値の欠落などの不具合を避けることができます使用される pH メーターとテストキネティクス (図 16)。
新鮮な肝のサンプルとミトコンドリアの急速な隔離の必要性のためのサンプルを収集し、一日に処理できる数は制限されます。各サンプルの完了に約 5-6 時間したがって、一日あたりのみ約 5 つのサンプルの収集し、呼吸室あたり解析することができます。高スループット方法; ではありません。トリートメントのサンプル ・ サイズが限ら...

ミトコンドリアはストレスに非常に敏感、彼らの携帯電話の環境は様々 な代謝疾患に貢献できます。酸素消費量とミトコンドリアのプロトン リークがミトコンドリア健康の指標です。RCR を使用してこの用紙見積もりのミトコンドリアのエネルギー効率で説明する方法は、酸素消費量とプロトン リークせずに基づいています。これらの結果は、栄養使用率1で失われたエネルギーの 30% は考慮できます。酸素消費量とプロトン リークの変化はミトコンドリア代謝性疾患に貢献し、減らされたエネルギー効率の結果を識別できます。これらのメソッドは、ミトコンドリア呼吸にさまざまな治療法の効果を検討するも使用できます。ミトコンドリアの酸素消費量とプロトン リーク カイネティクス測定の全体的な目標は、ミトコンドリアの機能とエネルギー効率を評価するためには。
肝ミトコンドリア機能不全は、乳牛のいくつかの疾患に関連付けられています。泌乳初期にエネルギー収支の赤字に直面して炭水化物や脂質の燃料を切り替えるに細胞の代謝能力は、数と2細胞内のミトコンドリアの機能によって影響されます。ミトコンドリアのエネルギーと増加する β-酸化の需要の増加に適応能力の欠陥はインスリン抵抗性に関連する細胞内の脂質の蓄積につながることができ、泌乳牛の泌乳初期の脂肪肝の形成につながる可能性があります。ミトコンドリア、ケトン体の生産と利用、サイトとして、乳牛3でケトーシスで重要な役割を再生できます。ミトコンドリアやミトコンドリア機能障害の欠如は周囲に燃料の可用性に影響を与えるし、酸素消費量または RCR の変更に反映されます。
炎症応答のミトコンドリアの酸素消費変化。7 日齢のブロイラーは、アイメリア ・ マキシマとコントロール グループ4感染グループにランダムに割り当てられました。コクシジウム症の挑戦を受けていないブロイラーは、プロトン リークと肝ミトコンドリアが増加陽子リークによって免疫チャレンジに応答を示す高い RCR のため低酸素消費を持っていた。プロトン リークしながら反応酸素種の生産は一度ミトコンドリア膜機能不全の兆候とエネルギー効率に支障をきたす、今知られているミトコンドリア5にタンパク質とカルシウムのインポートすることが重要です。、および熱1の生成のため。
呼吸鎖の電子漏れはミトコンドリアの膜蛋白質、脂質およびミトコンドリア DNA ミトコンドリアが活性酸素種の生産と酸化的損傷を受けやすいになります。ミトコンドリアの年齢としてダメージが蓄積されミトコンドリア ミトコンドリア代謝6や牛の病気への感受性を増加でさらに機能不全を引き起こしている、特に。実際には、多くの家畜動物は、高レベルの抗酸化機能を高めるため Cu, Zn, Mn などのサプリメントを供給されています。ただし、Cu の高レベルを供給、Zn, Mn 牛乳生産の減少、プロトン リーク (状態 4 呼吸)7のための酸素消費量を増加します。
牛のエネルギー効率におけるミトコンドリア機能の役割に関する先行研究は、ミトコンドリアの酸素消費量とプロトン リークの変化を重視しています。非常にいくつかの研究は、乳牛で公開されているし、ほとんどの論文は肉用牛におけるミトコンドリア機能に残留飼料摂取量 (RFI) の形で生産効率を比較します。ホルスタイン雌牛から授乳中の牛の肝臓状態 3、4 および RCR を測定することによって料金を調べたミトコンドリア呼吸の変動は牛 (アンガス、ヘレフォード Brangus)8.研究者は、ミトコンドリア呼吸成長や搾乳のための肉用牛の特徴の相関関係を見つけなかったが、ミトコンドリア呼吸と搾乳ホルスタインの特徴間の相関関係を報告でした。2 つの研究の RFI がミトコンドリア呼吸速度 (3、4 の状態と RCR の状態) に肉用牛筋ミトコンドリア9,10で比較されました。ミトコンドリア呼吸速度変更 dmi 対応と低料金が少ない効率的な肥育に関連付けられていた。別の研究で高または低の RFI ブルズから去勢牛の RFI はミトコンドリア呼吸速度とプロトン リーク カイネティクス子孫11の 2 つのグループ間で比較しました。違いは、利得を得る結論は肉用牛では、ミトコンドリア呼吸を影響を確認するためだった。
本稿で RCR 泌乳牛に 3 の抗酸化ミネラルを餌に応答を測定する方法の使用に示します肝臓を調べる実験中に酸素消費量 4 の状態し、3 の呼吸と PMF の状態します。

<table><tbody><tr><td>肝生検</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>機器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schackelford-Courtney牛肝生検機器</td><td>Sontec Instruments イングルウッド CO</td><td>1103-904</td><td></td></tr><tr><td>縫合</td><td>糸 フィッシャーサイエンティフィック</td><td>19-037-516</td><td></td></tr><tr><td>縫合針</td><td>NA</td><td>NA</td><td>含まれる縫合</td></tr>メス付き <tr><td></td><td>シグマ - ハンドル</td><td>とブレード用</td>Aldrich <td>S2896 / S2646</td>#</tr><tr><td>手術用タオル</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>50-129-6667</td><td></td></tr><tr><td>ファルコンチューブ 50 mL</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>ピンセット</td><td>シグマ - アルドリッチ</td><td>Z168750</td><td></td></tr><tr><td>50 mL シリンジ</td> フィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>22-314387</td><td></td></tr><tr><td>注射針 (22, 2 1/2)</td><td>VWR</td><td>MJ8881-200342</td><td></td></tr><tr><td>Cow halter</td><td>Tractor Supply Co.</td><td></td><td></td>101966599</tr><tr><td>綿棒</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-959-102</td><td></td></tr><tr><td>綿ガーゼスクエア (4x4)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>22-246069</td><td></td></tr><tr><td>医療用はさみ</td><td>シグマ - アルドリッチ</td><td>Z265969</td><td></td></tr><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>コクシジウム症ワクチン 0.75 ボトル/牛</td><td></td><td></td><td>提供元獣医師</td></tr>クロス<tr><td>トリジウムワクチン</td><td></td><td></td><td>獣医師提供</td></tr><tr><td>肝生検抗生物質エクセネル 2 cc/100 ポンド 3 日間</td><td></td><td></td><td>獣医師</td></tr><tr><td>Providone スクラブ</td><td>アスペン獣医師リソース</td><td>21260221</td><td></td></tr><tr><td>エタノール 70%</td><td>シグマ - アルドリッチ</td><td>793213</td><td></td></tr><tr><td>塩酸キシラジン 100 mg/mL IV 0.010-0.015 mg/kg</td><td></td><td></td>体重 <td>獣医師提供</td></tr><tr><td>2% リドカイン HCl (10-15 mL)</td><td></td><td></td><td>獣医師提供</td></tr><tr><td>フルニキシン メグルミン</td><td></td><td></td>の 1 mg/kg IV 注射 <td>獣医師提供</td></tr><tr><td>ミトコンドリア (肝臓) の分離</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>機器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ウィートンバイアル30mL、0.16mmクリアランスのテフロン乳棒付き</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>02-911-527</td><td></td></tr><tr><td>ホモジナイザーモーター</td><td>コールパー</td><td>マーEW-04369-10</td><td></td></tr><tr><td>ホモジナイザープローブ</td><td>コールパー</td><td>マーEW-04468-22</td><td></td></tr><tr><td>オートピペット(10mL)</td><td>コールパー</td><td>マーSK-21600-74</td><td></td></tr><tr><td>ビーカー(500mL)、氷付き</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>FB100600</td><td></td></tr><tr><td>冷蔵マイクロフュージ</td><td>Fisher Scientific</td><td>75-002-441EW3</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge tubes (1.5 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM12400</td><td></td></tr><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit (microplates for plate reader)</td><td>abcam</td><td>ab102536</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>S7903-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Σ - Aldrich</td><td>T1503-1KG</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Σ - Aldrich</td><td>EDS-1KG</td><td></td></tr><tr><td>BSA (脂肪酸フリー)</td> <td>Σ - Aldrich</td><td>A7030-50G</td><td></td></tr><tr><td>マンニトール</td><td>シグマ - Aldrich</td><td>M4125-1KG</td><td></td></tr><tr><td>脱イオン水</td><td>シグマ - Aldrich</td><td>38796</td><td></td></tr><tr><td>Hepes Σ</td><td>- Aldrich</td><td>H3375-500G</td><td></td></tr><tr><td>ミトコンドリア分離培地の作成に使用: 220 mM マンニトール、70 mM スクロース、20 mM HEPES、20 mM Tris-HCl、1 mM EDTA、および 0.1% (w/v) 脂肪酸を含まない BSA、&nbsp; pH 7.4 at 4 &deg;C、冷蔵庫</td><td></td><td></td><td></td>で2日間持続</tr>します<tr><td>Mitochondrial Oxygen Comsuption</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oxygraphセットアップ+クラーク型酸素電極</td><td>Hansatech(PPシステム)</td><td>OXY1</td><td></td></tr><tr><td>サーモレジェントウォーターポンプ</td><td>ADInstruments</td><td>MLE2001</td><td></td></tr><tr><td>クラーク型酸素電極</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>オートピペット(1mL)</td><td>コールパー</td><td>マーSK-21600-70</td><td>Oxy1</td></tr>付属 <tr><td>小型磁気攪拌子</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-513-95</td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペット(10 &mu;L)</td><td>コールパー</td><td>マーSK-21600-60</td><td></td></tr><tr><td>pH</td><td>メーターVWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>シグマ-Aldrich</td><td>P9333-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>シグマ-Aldrich</td><td>H3375-500G</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td>シ<td>グマ-Aldrich</td><td>P5655-1KG</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td>シ<td>グマ-Aldrich</td><td>M1028-100ML</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>シグマ - Aldrich</td><td>E3889-100G</td><td></td></tr><tr><td>ミトコンドリア酸素消費培地を作るために使用:120 mM KCL、5 mM KH2PO4、5 mM MgCl2、5 mM Hepesおよび1 mM EGTA、&nbsp; 30 &degでpH 7.4;0.3% 脱脂 BSA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ロテノン (4 mM 溶液)</td> を含む C シ<td>グマ - Aldrich</td><td>R8875-5G</td><td></td></tr><tr><td>コハク酸 (1 M 溶液)</td><td>シグマ - Aldrich</td><td>S3674-250G</td><td></td></tr><tr><td>ADP (100 mM 溶液)</td><td>シグマ - Aldrich</td><td>A5285-1G</td><td></td></tr><tr><td>オリゴマイシン (8 μ;エタノール中のg / mL)</td><td>シグマ-Aldrich</td><td>75351</td><td></td></tr><tr><td>FCCP</td><td>シグマ-Aldrich</td><td>C2920</td><td></td></tr><tr><td>Mitochondrial Membrane Potential and Proton Motive Force</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TPMP電極</td><td>World Precision Instruments.</td><td>DRIREF-2</td><td></td></tr><tr><td>Chemicals-solutionsは新鮮である必要はありませんが、ランの間に冷凍庫に保管する必要があります</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Malonate(0.1 mM溶液)</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>M1296</td><td></td></tr>オリ<tr><td>ゴマイシン(8 &mu;g/mL エタノール中)、冷凍庫</td><td>で保存 Sigma - Aldrich</td><td>75351</td><td></td></tr><tr><td>ニゲリシン (エタノール中 80 ng/mL)、冷凍庫</td><td>で保存 Sigma - Aldrich</td><td>N7143</td><td></td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>C3920</td><td></td></tr><tr><td>TPMP</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>T200</td><td></td></tr><tr><td>TPMP 溶液: 10 mM TPMP、120 mM KCL、5 mM Hepes および 1 mM EGTA、&nbsp; pH 7.4 at 30 &deg;0.3%脱脂BSA</td><td></td><td></td><td></td>を含むC</tr></tbody></table>

ホルスタイン種乳牛におけるミトコンドリア呼吸を推定する肝ミトコンドリアの酸素消費量とプロトン リーク動態測定

Measuring Liver Mitochondrial Oxygen Consumption and Proton Leak Kinetics to Estimate Mitochondrial Respiration in Holstein Dairy Cattle

酸素消費量、プロトン動機力 (PMF)、プロトン リークはミトコンドリア呼吸やミトコンドリアが NADH や FADH を ATP に変換することができるどれだけの測定です。どのように効率的に彼らは酸素を使用し、直接 ATP を生成を栄養代謝の効率に関連しているミトコンドリアは酸素使用と二酸化炭素と水に栄養素の酸化のためのプライマリ サイトではまたので、動物の栄養要求と動物の健康。このメソッドの目的は、さまざまな薬物、食事や環境に及ぼすミトコンドリア代謝の効果を検討するためミトコンドリアの呼吸を調べることです。結果には、プロトン依存呼吸 (状態 3) とプロトン リーク依存呼吸 (状態 4) 測定酸素消費が含まれます。状態 3/状態 4 呼吸の比率は呼吸調節比 (RCR) として定義され、ミトコンドリアのエネルギー効率を表すことができます。ミトコンドリアのプロトン リークは、ADP を ATP 合成の効率が下がりますから酸化リン酸化の脱共役のミトコンドリア膜電位 (MMP) の損失をできるようにするプロセスです。状態 3 状態 4 呼吸、ミトコンドリア膜 PMF や ATP を作り出す潜在性) を測定する使用されるミトコンドリアの基板と電子輸送鎖阻害剤酸素と TRMP + 敏感電極とプロトンのリーク。このメソッドの制限、肝組織は可能な限り新鮮なする必要があります、すべての生検とアッセイは、10 h 未満で行う必要があります。これは、サンプルを収集し、約 5 日で一人で処理できる数を制限します。ただし、乳用牛などの大型動物に必要なサンプル量は肝臓の大きさに比べて小さい、少しの回復時間が必要なので、肝組織の 1 g だけが必要です。

RCR とプロトンのリーク動態を示す肯定的な結果が表 1と図 15にそれぞれ表示されます。この研究7、RCR および蛋白質のリークで動態ミルクに 70 日間でホルスタイン種乳牛で測定した後、Cu, Zn, Mn の 5 つの異なるレベルの 1 で 28 日間飼育した牛.状態 4、最大陽子リーク依存型呼吸、Cu, Mn, Zn (p &lt; 0.1) のミネラル摂取量によって影響を受ける傾向があった。状態 3 呼吸 (最大 ATP は、呼吸を刺激される)、RCR = 状態 3/4 状態 (呼吸調節比) はミネラルの摂取量の影響を受けません。4 呼吸が LowMn で最高, Mn プロトン リーク依存呼吸を最小限に抑える重要な役割を果たしていることを示す、コントロールの最低の状態します。マンガン Mn スーパーオキシド ・ ジスムターゼ酵素によって、ミトコンドリアにおける活性酸素種とプロトン リーク<sup clas...

ここで、ミトコンドリアの酸素消費量、栄養エネルギー論とプロトンのリーク、ミトコンドリア ATP 生成の非効率性の主な原因の定義する概念を測定するための方法を共有します。これらの結果は、ミトコンドリアの機能を評価するのに役立つ栄養の使用率で失われるエネルギーの 30% は考慮できます。

Oxygen consumption, proton motive force (PMF) and proton leak are measurements of mitochondrial respiration, or how well mitochondria are able to convert ...

この方法は、ミトコンドリアの健康、エネルギー効率、エネルギー使用量など、エネルギー分野の重要な質問に答えることができます。この技術の主な利点は、単離ミトコンドリアの酸素消費量が直接測定されるということです。結果は、他の細胞内代謝プロセスのために修正する必要はありません。.まず、ミトコンドリア効率が飼料効率にどのような影響を与えるかを調べたいとき、私たちは乳牛でこの方法を追求することにしました。ミトコンドリア分離の手順は一貫性があり、正確である必要があるため、習得が困難であるため、この方法のビデオデモンストレーションは重要です。肝臓サンプルを取り除いた後できるだけ早く、赤血球を除去するためにミトコンドリアの分離培地で試料を洗浄する。はさみを使用して、組織を湿らせた状態に保つために十分な分離培地を含む冷たいビーカーに組織を細かくミンチします。ひき肉をミトコンドリア分離培地を含む30ミリリットルガラスバイアルに移します。0.16ミリメートルのクリアランスを有し、氷でインキュベートされたテフロン害虫を加え、1分間4ストロークで1分間500 RPMで肝臓サンプルを均質化します。この後、ホモジネートをミトコンドリア分離培地を含むチューブに移し、これを氷パックビーカーに入れる。遠心分離機はGの500倍、摂氏4度で10分間ホモジュートする。ペレットを捨てて、上清を冷やした遠心分離管に移します。得られた上清を10,000倍Gで4度摂氏10分間遠心し、ミトコンドリアペレットを得た。ペレットを再中断し、10 ミリリットルのミトコンドリア分離培地に脂肪酸を含まない BSA で洗浄します。その後、8、100倍G、摂氏4度で10分間遠心分離機を使用します。上清を捨て、200マイクロリットルの分離媒体でペレットを再懸濁します。酸素消費と陽子漏れ運動アッセイに使用する準備ができるまで氷の上に置きます。BSAを標準として使用するメーカーの指示に従ってビチオニン酸キットを使用して、ペレット懸濁液のタンパク質濃度を決定します。まず、テキストプロトコルで概説されているように、酸素消費媒体を作成します。酸素消費媒体を摂氏30度でインキュベートする。次に、製造業者の指示に従って、オキシグラフシステム用の呼吸室、ポンプおよび酸素電極を設置する。その後、酸素消費媒体の1ミリリットルを呼吸室に入れます。その後、ミトコンドリアタンパク質の0.35ミリグラムをチャンバーに加えます。溶液が空気で飽和し、摂氏30度の温度を維持するために激しくかき混ぜます。約5分間の酸素消費量を記録します。酸素消費量が一定になると、一定の直線が表され、これをベースライン酸素消費量として記録します。複雑な1つを阻害するために4ミリモルロテノーン溶液の1.25マイクロリットルを追加し、その後、呼吸器室でコハク酸5ミリモルの最終的な濃度に達するために1モルコハク酸溶液の5マイクロリットルを追加します。これは、状態IV酸素消費です。この後、100ミリモルADP溶液の1マイクロリットルを加えて、呼吸室に100マイクロモルの最終濃度に達する。酸素消費量は約5分間減少し、その後、直線になります。この酸素消費量を状態III呼吸として記録します。テキストプロトコルで概説されているように、呼吸制御比を計算します。その後、呼吸室からすべての溶液を吸引します。二重脱イオン水でチャンバーを数回リンスします。まず、エタノール中のニジェリシン1ミリリットル当たり80ナノグラムの溶液を調製し、エタノールの添加量を1マイクロリットル未満に制限する。また、エタノール中に1ミリリットルオリゴマイシン当たり8マイクログラムの溶液を調製する。チャンバーを二重脱イオン水で十分に洗い流した後、酸素消費媒体の1ミリリットルを呼吸室に入れ、磁気攪拌棒で激しくかき混ぜます。呼吸室に0.35ミリグラムのミトコンドリアタンパク質を加える。メチルトリフェニルホスホニウム感受性電極をチャンバ設定に追加して、もう一方の端がpHメーターに正しく接続されていることを確認します。4ミリモルロテノーネ溶液の1.25マイクロリットルを加え、コンプレックスI.2〜5分間呼吸を記録します。酸素消費量が一定になったときに、酸素消費量の値を記録します。次に、0.56マイクロリットルのオリゴマイシン溶液を加えて、ADPの利用を阻害する。呼吸を約2~5分間記録します。酸素消費量が一定になったときに、酸素消費量の値を記録します。その後、ミトコンドリア内膜全体のpH勾配を廃止するために、ミリリットルニジェリシン溶液あたり80ナノグラムの0.112マイクロリットルを追加します。呼吸を2~5分間記録し、一定になったときに酸素消費量の値を記録します。ミトコンドリアインキュベーションに10ミリモルメチルトリフェニルホスホニウム溶液を5マイクロリットル加えて、標準曲線の調製を開始します。合計濃度が 2.5 になるまで、この追加を 4 回繰り返します。マイクロモルが追加されました。この後、1つの大臼歯コハク酸溶液を5マイクロリットル加えて呼吸を開始します。安定したトレースが達成されるまで呼吸を記録します。次に、テキストプロトコルで概説されているように、システムを調整するためにmalonateを追加します。本研究では、乳牛に28日間異なるレベルの銅、亜鉛、マンガンを供給してから70日後に、ホルスタイン乳牛の乳中でRCRおよびプロトンリークキネティックスが測定される。状態IV呼吸は、マンガンの低レベルを与えられた牛の中で最も高いと見られるが、対照牛では最も低く、マンガンがプロトン漏れ依存性呼吸を最小限に抑える上で重要な役割を果たしていることを示している。肝プロトンリーク依存呼吸の分析は、この呼吸が低いマンガンで治療された牛で最も大きく、対照牛で最も低いことを明らかにした。これらの結果は、低マンガン群が最も高い状態IV呼吸を有し、対照群が最も低い状態であることを確認した。高RFI雄牛よりも低RFIブルから生まれたアンガスステアでは供給効率が高いが、これはミトコンドリアRCRまたはプロトンリークキネティクスには反映されなかった。この手順を実行している間、ミトコンドリアを処理しながら、氷の上にすべてのバイアルとビーカーを維持することが重要です。その開発後、この技術は、肝臓の飼料効率とミトコンドリア機能におけるミトコンドリア効率の役割を探求するために、乳製品栄養の分野の研究者のための道を開きました.ロテノーネで作業することは危険であり、手袋、目の保護、適切なPPEの着用などの予防措置は、常にこの手順を実行している間に取られるべきであることを忘れないでください。

measuring-liver-mitochondrial-oxygen-consumption-proton-leak-kinetics

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

源：エレトラ・レオ1、ルイザ・H.D.カルドーゾ1、サビーヌ・シュミット1、エーリッヒ・グナイガー11オロボロス機器このビデオでは、酸素フラックスを使用して、生きているおよび透過処理された哺乳類細胞のミトコンドリア呼吸を評価する方法について説明します。これは、さまざまな呼吸状態を特徴付けるために、ジギトニン、代謝基質、ADP、アンカプラー、および阻害剤を順次使用することを実証しています。得られた酸素フラックスプロファイルは、定義された条件下でのミトコンドリア機能とエネルギー結合効率を明らかにします。...

生細胞および透過処理細胞におけるミトコンドリア呼吸を評価するための酸素フラックス測定

提示された方法は、マウス骨格筋の最小量から単離されたミトコンドリアを使用したマイクロプレートベースの呼吸測定アッセイのコレクションの性能について、段階的な指示を提供します。これらのアッセイは、一般的に使用される動物モデルにおけるミトコンドリア酸素消費量の機構的変化/適応を測定することができます。...

ハイスループットマイクロプレート呼吸測定のためのマウス骨格筋の最小量から単離されたミトコンドリアを使用して

高解像度の呼吸計測は、ミトコンドリアの酸素消費量を決定するために使用されます。これは、ミトコンドリア呼吸鎖複合体」（I-IV）呼吸数、最大のミトコンドリアの電子伝達系の能力、およびミトコンドリア外膜の完全性を決定するための簡単な技術です。...

透過処理と無傷の細胞でミトコンドリア機能を評価するために高解像度呼吸計測

本稿で、ショウジョウバエのグリセリン thoraxes...

ショウジョウバエのティッシュの最小限の量を使用してのグリセリンの繊維でミトコンドリアの酸素消費量の測定

野外で捕獲した野生動物の単離ミトコンドリアの呼吸数を測定する移動実験室を設計・建設しました。ここでは、移動式ミトコンドリアラボの設計と装備、および関連するラボプロトコルについて説明します。...

ミトコンドリアのエネルギーを野外で測定するための移動式ミトコンドリア生理学研究室の開発

蛍光センサーと組み合わせた高解像度の呼吸法は、ミトコンドリアの酸素消費量と活性酸素種(ROS)の生成を決定します。本プロトコールは、透過処理された坐骨神経におけるミトコンドリア呼吸数およびROS産生を評価する技術を記載する。...

高解像度呼吸法による坐骨神経のミトコンドリア機能の評価

代謝細胞外フラックス分析装置を用いてマウスおよびヒト好中球およびHL60細胞のミトコンドリア呼吸を測定する段階的プロトコルについて説明する。...

好中球のミトコンドリア生体エネルギープロファイルのリアルタイム測定

馬は並外れた有酸素運動能力を持っているため、馬の骨格筋は、馬の運動生理学と哺乳類のミトコンドリア生理学の両方の研究にとって重要な組織となっています。この記事では、馬の骨格筋におけるミトコンドリア機能の包括的な評価のための技術について説明します。...

ウマ骨格筋の高分解能蛍光呼吸測定

ここでは、分子状酸素を消費する能力とは無関係に、哺乳類細胞のミトコンドリア機能を直接測定するためのアッセイをまとめたものです。...

哺乳類のミトコンドリア機能を測定するための酸素非依存性アッセイ(英語)

ここでは、ヒトまたはマウスの筋肉から採取した新鮮な透過性骨格筋線維におけるミトコンドリアの酸化的リン酸化を測定するための包括的な方法について説明します。この方法により、ミトコンドリア呼吸のリアルタイム定量化と、既存のミトコンドリアネットワークと膜の完全性を維持しながら、燃料の好みと代謝の柔軟性の評価が可能になります。...

高解像度呼吸測定法によるヒトおよびマウス骨格筋線維のミトコンドリア呼吸の測定

学ぶ肝ミトコンドリアの酸素消費量とプロトンリーク動態測定法。ホルスタイン種乳牛のミトコンドリア効率と飼料効率の関係を評価し、栄養エネルギー学の研究に応用できます。

ホルスタイン種乳牛におけるミトコンドリア呼吸を推定する肝ミトコンドリアの酸素消費量とプロトンリーク動態測定

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