Name: ホルマリン固定癌組織標本の腫瘍免疫研究の自動多重蛍光パネル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: 学ぶ ホルマリン固定癌組織標本の自動多重蛍光パネルによる腫瘍免疫研究法。6マーカー同時検出で免疫細胞の位置と表現型を評価し、免疫腫瘍学の研究に有用な標準化プロトコルを提供します。

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<ol><li>Bethmann, D., Feng, Z., Fox, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoprofiling+as+a+predictor+of+patient%27s+response+to+cancer+therapy-promises+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunoprofiling as a predictor of patient's response to cancer therapy-promises and challenges.</a> Current Opinion in Immunology. 45, 60-72 (2017).</li>
<li>Taube, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implications+of+the+tumor+immune+microenvironment+for+staging+and+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Modern+Pathology%22%5BJournal%5D)">Implications of the tumor immune microenvironment for staging and therapeutics.</a> Modern Pathology. 31 (2), 214-234 (2018).</li>
<li>Idikio, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemistry+in+diagnostic+surgical+pathology%3A+contributions+of+protein+life-cycle%2C+use+of+evidence-based+methods+and+data+normalization+on+interpretation+of+immunohistochemical+stains%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Clinical+and+Experimental+Pathology%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemistry in diagnostic surgical pathology: contributions of protein life-cycle, use of evidence-based methods and data normalization on interpretation of immunohistochemical stains.</a> International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 3 (2), 169-176 (2009).</li>
<li>Rebelatto, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+programmed+cell+death+ligand-1+immunohistochemical+assay+validated+for+analysis+of+non-small+cell+lung+cancer+and+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Development of a programmed cell death ligand-1 immunohistochemical assay validated for analysis of non-small cell lung cancer and head and neck squamous cell carcinoma.</a> Diagnostic Pathology. 11 (1), 95(2016).</li>
<li>Parra, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+and+image+analysis-based+study+shows+that+several+immune+checkpoints+are+co-expressed+in+non-small+cell+lung+carcinoma+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thoracic+Oncology%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical and image analysis-based study shows that several immune checkpoints are co-expressed in non-small cell lung carcinoma tumors.</a> Journal of Thoracic Oncology. 13 (6), 779-791 (2018).</li>
<li>Rehman, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+pathologist-read+comparison+of+the+heterogeneity+of+programmed+death-ligand+1+%28PD-L1%29+expression+in+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Modern+Pathology%22%5BJournal%5D)">Quantitative and pathologist-read comparison of the heterogeneity of programmed death-ligand 1 (PD-L1) expression in non-small cell lung cancer.</a> Modern Pathology. 30 (3), 340-349 (2017).</li>
<li>Dixon, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+developments+in+multiplexing+techniques+for+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Recent developments in multiplexing techniques for immunohistochemistry.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (9), 1171-1186 (2015).</li>
<li>Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+immunohistochemistry%2C+imaging%2C+and+quantitation%3A+a+review%2C+with+an+assessment+of+Tyramide+signal+amplification%2C+multispectral+imaging+and+multiplex+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis.</a> Methods. 70 (1), 46-58 (2014).</li>
<li>Feng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparametric+immune+profiling+in+HPV-+oral+squamous+cell+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Multiparametric immune profiling in HPV- oral squamous cell cancer.</a> JCI Insight. 2 (14), (2017).</li>
<li>Feng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multispectral+imaging+of+formalin-fixed+tissue+predicts+ability+to+generate+tumor-infiltrating+lymphocytes+from+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+ImmunoTherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma.</a> Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 3, 47(2015).</li>
<li>Granier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+immunofluorescence+analysis+and+quantification+of+intratumoral+PD-1%2B+Tim-3%2B+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Multiplexed immunofluorescence analysis and quantification of intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), e56606(2018).</li>
<li>Parra, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+multiplex+immunofluorescence+panels+using+multispectral+microscopy+for+immune-profiling+of+formalin-fixed+and+paraffin-embedded+human+tumor+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues.</a> Scientific Reports. 7 (1), 13380(2017).</li>
<li>Ribas, A., Wolchok, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+immunotherapy+using+checkpoint+blockade%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cancer immunotherapy using checkpoint blockade.</a> Science. 359 (6382), 1350-1355 (2018).</li>
<li>Gorris, M. A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eight-color+multiplex+immunohistochemistry+for+simultaneous+detection+of+multiple+immune+checkpoint+molecules+within+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Eight-color multiplex immunohistochemistry for simultaneous detection of multiple immune checkpoint molecules within the tumor microenvironment.</a> Journal of Immunology. 200 (1), 347-354 (2018).</li>
<li>Parra, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+neoadjuvant+chemotherapy+on+the+immune+microenvironment+in+non-small+cell+lung+carcinomas+as+determined+by+multiplex+immunofluorescence+and+image+analysis+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+ImmunoTherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Effect of neoadjuvant chemotherapy on the immune microenvironment in non-small cell lung carcinomas as determined by multiplex immunofluorescence and image analysis approaches.</a> Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 6 (1), 48(2018).</li>
<li>Rimm, D., Schalper, K., Pusztai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unvalidated+antibodies+and+misleading+results%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research+and+Treatment%22%5BJournal%5D)">Unvalidated antibodies and misleading results.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 147 (2), 457-458 (2014).</li>
<li>Baskin, D. G., Hewitt, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+state+of+the+science+of+immunohistochemistry%3A+the+Histochemical+Society%27s+standards+of+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Improving the state of the science of immunohistochemistry: the Histochemical Society's standards of practice.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 62 (10), 691-692 (2014).</li>
<li>Freedman, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+need+for+improved+education+and+training+in+research+antibody+usage+and+validation+practices%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">The need for improved education and training in research antibody usage and validation practices.</a> Biotechniques. 61 (1), Letter to the Editor 16-18 (2016).</li>
<li>Hewitt, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducibility%3A+it+is+just+good+science%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Reproducibility: it is just good science.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 64 (4), 223(2016).</li>
<li>Uhlen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proposal+for+validation+of+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A proposal for validation of antibodies.</a> Nature Methods. 13 (10), 823-827 (2016).</li>
</ol>

この作品は、MedImmune、グローバル バイオ医薬品 R & D アストラゼネカの腕によって支えられました。プレゼントをもらった、韓、c. w. パーキン エルマー試薬 (TSA キット) を生成してこの作品で使用されたマルチ スペクトルのスキャナーの従業員であります。修士課程修了、中啓、a. h. w. Z. C. バグナル、C ・ ブラウン、j. c.、アダムローリー、k. s.、原産地、J.R.C.、MedImmune の従業員持ち株会やストック利益またはアストラゼネカのオプション。

継続的な癌免疫療法革命は開口部小説と有望な治療方法がん患者13。免疫腫瘍学の分野の進歩の炎症性の腫瘍微小環境、発癌に関与する免疫学的メカニズムの生物学を理解するだけでなく、新しい予測バイオ マーカーを見つけることも増加の知識が必要になります免疫療法を用いた治療法1,2。がん免疫の複雑な生物学による腫瘍組織サンプルの尋問は通常互いに相互作用し、1 体内の多様な細胞集団でよく行ったが、免疫マーカーの成長のリストを開発する必要 ,2,5。臨床試験は、通常コア針などを評価し、患者の応答を監視する療法のさまざまなポイントで収集された内視鏡下生検の結果、小さな生検を採用しています。このような生検組織数がん immunoprofiling を用いることができるティッシュ セクションの数が制限の限られた量...

免疫腫瘍学研究、特に発見と臨床試験1 のコンテキストでの癌免疫療法の新規予測バイオ マーカーの検証のために不可欠なコンポーネントとなっている FFPE 腫瘍組織サンプルの Immunoprofiling 分析 ,2。ジアミノベンジジンなど化学色原体を使用して、発色の IHC 病理生検組織3の反応の標準的な手法のままです。標準 IHC はがん組織 immunoprofiling、腫瘍関連リンパ球のサブポピュレーションとプログラムされた細胞死配位子 1 など免疫チェックポイントの発現レベルの評価 (PD L1)4 の定量などにも使用できます。 ,5。標準 IHC は限られた、しかし、ティッシュ セクションごとに 1 つだけ抗原のラベル付けできます。Immunoprofiling 研究は、通常いくつかのマーカーの組み合わせの式の解析を必要とするため複数の組織切片の染色標準 IHC の使用が必要になります, 各単一のマーカーの染色し、したがって、コア針生検など小さい組織サンプルの解析に大幅に制限されます。標準 IHC 法または PD L1、腫瘍関連マクロファージおよび癌細胞によって表現されるなど免疫チェックポイント マーカーよくの多様な細胞集団で行ったマーカーの評価のために制限されます。この制限は、標準 monoplex IHC の使用などのさまざまな細胞タイプ6によって表される IHC マーカーの定量分析のための病理学者によって報告されています。ちょうど少数の反応によって制限されているものの、標準 IHC monoplex 方法、7以上同じティッシュ セクションを表すの多様な塗装色原体の進歩を用いた多重発色 IHC 技術の開発マーカーも同じ細胞集団の同じ細胞内コンパートメントに発現するタンパク質の適切な評価のための重要な技術的な課題を提示。
多重の発色 IHC 法の制限と同様、臨床サンプルから組織の可用性に関する上記の注意事項は、腫瘍免疫研究に基づく多重化法の改良を開発する必要性に上昇を与えています。蛍光標識は、同じスライドから複数の同時の信号を分離することができます効果的にシステムをイメージングと組み合わせます。このような手法の 1 つは、効率的な色分離8のマルチ スペクトル顕微鏡イメージングと組み合わせるパスチラミドシグナル信号増幅 (TSA) に基づいています。市販の TSA ベース キット採用 fluorophores マルチ スペクトル イメージング8用に最適化 (材料の表を参照してください)。このシステムの重要な利点は、検証および標準的な発色 IHC9,10,11用に最適化された同じ非標識一次抗体との互換性です。これは、新しいターゲットを組み込む最適化とパネルの変更で高速化だけでなく、柔軟性をことができます。Monoplex からの簡単な転送を可能にする、自動化された市販の IHC 着色システムのための多重蛍光 (mIF) TSA メソッドの最適化さらに、mIF に発色 IHC。
ここで腫瘍免疫研究に基づいている mIF パネル自動 mIF TSA 染色とイメージングのための多重分光スキャナーを使用してプロトコルを提案します。このプロトコルは、適応および記述されている計測・試薬へのアクセスを持つ研究室ユーザで変更できます。プロトコルには、癌の immunoprofiling の六つの一次抗体のパネルが含まれています: PD-L1、PD 1、CD68 (パン ・ マクロファージ マーカー) として、CD8 (T 細胞傷害性細胞)、キ-67 と AE1/AE3 の同定に上皮性マーカーとして使用 (汎サイトケラチン、癌細胞)。最近の研究では、染色12多重化を検証するための標準の参照として発色 IHC を使用して手動 TSA mIF プロトコルの最適化について説明します。自動着色剤、また染色の一貫性を向上させながら 14 時間 3-5 日から染色時間を飛躍的に短縮で最適化された市販の七色の TSA キットを使用して更新されたメソッドここで紹介をしました。ここで示した詳細な主なプロトコル、に加えて補足資料セクションには「ドロップ コントロール」法、最適化ためのテクニカル ノートと同様、新しい mIF パネルを評価する追加の品質管理プロセスが含まれていますトラブルシューティング、およびセットアップおよびカスタマイズされた mIF パネルの mIF TSA メソッドを最適化する研究所ユーザーを支援する新しい多重パネルの開発。

<table><tbody><tr><td>「InForm 2.4.2」スペクトルアンミキシングおよび画像解析用ソフトウェア</td><td>PerkinElmer</td><td>CLS151066</td><td>本文中「スペクトルアンミキシングソフトウェア」</td></tr> 「<tr><td>Phenochart 1.0.9」 MSIの選択およびスライドスキャン全体の表示用QPTIFFソフトウェア</td><td>PerkinElmer</td><td>CLS151067</td><td>テキスト#</td></tr><tr><td>1.5 Coverslips</td><td>Sigma Aldrich</td><td>2975246</td><td></td></tr><tr><td>200プルーフエタノール</td><td>Koptec</td><td>V1001</td><td></td></tr><tr><td>20xトリスバッファー生理食塩水</td><td>VWR</td><td>J640-4L</td><td></td></tr><tr><td>抗体希釈剤</td><td>DAKO</td><td>S2203</td><td></td></tr><tr><td>抗CD68マウスモノクローナルDAKO</td><td></td><td>M087601-2</td>クローン<td>PG-M1</td></tr>抗<tr><td>CD8ウサギモノクローナル</td>ベン<td>タナ</td><td>M5392</td><td>クローンSP239</td></tr>抗<tr><td>CKマウスモノクローナル</td><td>DAKO</td><td>M351501-2</td><td>クローン AE1/AE3</td></tr><tr><td>抗ki67 マウスモノクローナル</td><td>DAKO</td><td>M724001-2</td><td>クローン MIB-1</td></tr><tr><td>抗PD-1 ウサギモノクローナル</td><td>細胞シグナル#</td><td>86163</td><td>クローン D4W2J</td></tr><tr><td>抗PD-L1ウサギモノクローナル</td><td>ベンタナ</td><td>790-4905</td><td>クローン SP263</td></tr><tr><td>ボンド脱ロウ溶液</td><td>ライカ</td><td>AR9222</td><td>本文中では「脱ロウ溶液」と呼ばれ</td></tr>ています<tr><td>ボンドエピトープリトリーバルソリューション1</td><td>ライカ</td><td>AR9961</td><td>本文中では「ER1」</td></tr>と呼ばれています <tr><td>ボンドエピトープリトリーブソリューション2</td><td>ライカ</td><td>AR9640</td> テキスト<td>では「ER2」と呼ばれ</td></tr><tr><td>、30mL</td>ライ<td>カ</td><td>OP309700</td><td>テキストでは「30mLオープンコンテナ」と呼ばれ</td></tr><tr><td>、7mL</td>ライ<td>カ</td><td>OP79193</td><td>「7mLオープンコンテナ」と呼ばれていますテキストの「</td></tr><tr><td>」 ボンドポリマーリファイン検出</td><td>ライカ</td><td>DS9800</td><td>テキストでは「発色検出キット」と呼ばれ</td></tr>ています <tr><td>ボンド研究検出キット</td><td>ライカ</td><td>DS9455</td><td>テキストでは「研究検出キット」と呼ばれ</td></tr>ています <tr><td>ボンド滴定キット</td><td>ライカ</td><td>OPT9049</td><td>テキストでは「滴定キット」と呼ばれ</td></tr>ています <tr><td>ボンドユニバーサルカバータイルノボカストラライ</td><td>カ</td><td>S21.2001</td><td>本文では「covertiles」と呼ばれ</td></tr>ています <tr><td>Bond Wash Solution 10X Concentrate</td><td>Leica</td><td>AR9590</td><td>本文では「10x wash solution」と呼ばれ</td></tr>ています <tr><td>BondRX Autostainer</td><td>Leica</td><td></td><td>本文では「automated stainer」と呼ばれ</td></tr>ています <tr><td>BondRX Software Version 5.2.1.204</td><td>Leica</td><td></td> テキスト<td>では「automated stainer software」と呼ばれ</td></tr>ています <tr><td>Opal 7-Color AutomationIHC キット</td><td>PerkinElmer</td><td>NEL801001KT</td><td></td></tr><tr><td>ペルオキシダーゼ ブロック</td><td>ライカ</td><td>RE7101</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Diamond 退色防止マウンタント</td><td>サーモ</td><td>P36965</td><td>テキストで「スライド マウンタント」と呼ばれる</td></tr><tr><td>Starfrost Slides</td><td>Fisher</td><td>15-183-51</td><td></td></tr><tr><td>Vectra Polaris マルチスペクトル顕微鏡 「Vectra 3.0.5」マルチスペクトル顕微鏡制御用ソフトウェア</td><td>PerkinElmer</td><td>CLS143455</td><td>本文中では「顕微鏡制御ソフトウェア」と呼ばれ</td></tr></tbody></table>ています

ホルマリン固定癌組織標本の腫瘍免疫研究の自動多重蛍光パネル

Automated Multiplex Immunofluorescence Panel for Immuno-oncology Studies on Formalin-fixed Carcinoma Tissue Specimens

免疫腫瘍で継続的な発展には、癌免疫学のメカニズムの理解は深まるが必要があります。ホルマリン固定のパラフィン埋め込まれた (FFPE) 生検から組織サンプルの immunoprofiling 解析は、腫瘍免疫の複雑さを理解し、がん免疫療法の新規予測バイオ マーカーの発見のための重要なツールになりました。組織の Immunoprofiling 解析では、腫瘍微小環境における炎症性細胞の亜集団と免疫チェックポイントを含む結合のマーカーの評価が必要です。新規多重免疫組織化学的手法の出現 1 つティッシュ セクションのより効率的な役立つ multiparametric 分析標準 monoplex 免疫染色 (IHC) よりもできます。1 市販多重蛍光抗体法 (IF) 法はパスチラミドシグナル信号増幅に基づくし、マルチ スペクトル顕微鏡による分析と組み合わせる組織における多様なマーカーの良い信号分離できます。この方法は、標準の IHC FFPE 組織サンプルでの最適化された非標識一次抗体の使用と互換性があります。ここ述べる多重ができる自動プロトコル PD L1 で構成される 6 マーカー多重抗体パネルと癌組織サンプルのラベルする場合 PD 1、CD68、CD8、Ki 67、および 4 ' と AE1/AE3 サイトケラチン 6-diamidino-2-phenylindoleとして細胞核対比染色。多重パネル プロトコルは染色時間が手動の議定書のより短いと直接適用でき、人間 FFPE 組織サンプルでの腫瘍免疫研究のすべての研究室捜査官適応自動 IHC 着色に最適です。いくつかのコントロールと最適化と手法の検証に役立つ新しい多重の場合パネルの細かい品質制御ドロップ コントロール メソッドを含むツールがまた説明されます。

ここで説明されているプロトコルは、図 2に示すような結果になります。表面扁平上皮で始まるへんとう腺コントロールの染色性を評価を開始します。扁桃サンプルの組織は、H &amp; E のスライドを参考にして、病理医に確認できます。同じ組織ブロックの同じマーカーで発色 IHC セクションを実行すると場合、これらは密度と mIF のスライドの各マーカーの分布を確認する使用できます。扁桃組織が明確に定義された AE1/AE3 サイトケラチン染色扁桃表面扁平上皮を提供する必要があります図 2Aのように、(図 2A; 赤擬似カラーとしてラベル付け)、リンパで背景なし組織。染色すべき膜のアクセントと時折、細胞質と核を負の値にする必要があります。陰窩に単層上皮はサイトケラチン (赤) の PD L1 (<strong class=...

詳細なプロトコル 6 マーカー多重蛍光パネルの最適化し、実行より一貫した結果と手続き時間の短縮のため自動着色剤を使用しています。このアプローチは、腫瘍免疫研究のあらゆる研究室で直接対応できます。

Continued developments in immuno-oncology require an increased understanding of the mechanisms of cancer immunology. The immunoprofiling analysis of ...

多重免疫蛍光プロトコルの開発最適化と転送は複雑で困難であるため、このプロトコルは重要です。多くのラボでは、最適化されたプロトコルのつま先ホールドは非常に貴重です。マルチスペクトル免疫蛍光は、腫瘍内および腫瘍の周囲の複数の細胞タイプの位置と同一性の両方を評価することを可能にする。これは免疫腫瘍学研究における情報の強力な組み合わせです。多重免疫蛍光の最も魅力的な使用は、免疫腫瘍学です。しかし、setuで複数の免疫細胞タイプを調査する能力は、すべての自己免疫療法および炎症性療法で活用することができます。固形細胞とその周辺の免疫細胞の位置と表現型を知ることは、腫瘍特異的免疫療法に対する予後および予測可能な応答の両方である。プロトコルの最適化と検証は、急ぐべきの重要なステップです。新しい開発者は、マルチスペクトルイメージングに関連する新しい種類のアーティファクトに慣れる必要があります。基本マルチプレックスプロトコルを見つけるには、それを自動染色器にプリロードします。プロトコル画面で優先されるのではなく、すべてでフィルタリングします。変更を加える前に、元のプロトコルを保存し、プロトコルタブをクリックし、コピーを選択するOpal 6多重を右クリックします。新しいウィンドウで名前を7多重プロトコル1'に変更し、正しいデバイスに関連付けられているタブを選択します。補足テーブルS1'にプロトコルを一致させ、試薬を追加して10分間のパロキシディス阻害ステップを加え、ペルオキシダーゼ阻害剤を試薬として選択する。ブロッキングステップがプロテインキナーゼ阻害剤遮断緩衝液を利用していること、各初代抗体が適切な試薬を指していること、二次抗ボディステップが西洋ワサビペルオキシダーゼポリマーを利用していること、およびマルチスペクトル自動化キットを備えたスペクトルダピが利用されていることを確認する。プロトコルにペルオキシダーゼ阻害剤が含まれていることを確認し、続いてタンパク質遮断ステップ、一次抗体、二次抗体、チラミド床、抗原検索を含む6つの逐次染色が続いて、抗体を除去する。ドロップコントロールを追加するには、7多重プロトコル1'nameをコピーし、7多重プロトコル1 CD68ドロップに変更します。CD68抗体試薬をマウスIgGに変更し、プロトコルを保存します。次に、ドロップコントロールごとに 1 つずつ、完全な iso 型制御用に、同じ方法で 6 つの新しいプロトコルを作成します。ここで示したのと同じ方法で、各ターゲットのドロップ制御プロトコルを作成します。研究検出キットを作成するには、1X トリスバッファー塩水用にマークされた 30 ミリリットルのオープンコンテナに 1X トリスバッファ付生理食塩水を充填し、マルチプレックス リサーチ キット 1 のハンドルから最も遠い位置にコンテナを配置します。2つの30ミリリットル開いた容器muli-spectralブロック'とマルチスペクトル二次にラベルを付け、マルチスペクトル染色キットから30ミリリットルのブロッキング緩衝液抗体希釈剤をムトリスペクトルブロック容器に充填する。マルチスペクトル染色キットから抗マウス抗狂犬病二次抗体ポリマーを30ミリリットルのマルチスペクトル二次容器に充填し、600マイクロリットルの抗体希釈液を10個の7ミリリットルの開いた容器のそれぞれに加えます。次に、濃縮された一次抗体を表に示されたボリュームの適切なチューブに加え、穏やかなピペットで混合します。3ミリリットルの二重蒸留水に加え、スペクトルダピ12滴を1つの7ミリリットルのオープンコンテナに加え、3ミリリットルのペルオキシダーゼブロックを2番目の7ミリリットルのオープンコンテナに加えます。75マイクロリットルのジメチルスルホキシドで各リアタール化床を再中断し、ピペットで混合します。その後、タイラミド信号増幅床の在庫を摂氏4度で準備完了まで保管します。個々のTSA床希釈液を準備しながら。すべての試薬をオート染色器に登録し、各容器を試薬ラックに入れ、すべての試薬を自動染色器に積み込みます。染色剤は、存在を検出し、各試薬の体積を確認します。すべての試薬がロードされたら、プロトコルを起動して一晩実行します。染色手順の最後に、カバースリップでサンプルを取り付け、スキャン用にマルチスペクトルイメージングプラットフォームスキャナにサンプルをロードします。すべてのサンプルがスキャンされると、画像は qptiff ファイルとしてフォーマットされます。適切な qptiff 分析ソフトウェア プログラムを開き、[Load Slide] をクリックして、目的のスライドの 5 つのフィルター全体のスライド スキャンを開きます。ログインしてスタンプツールを使用して、マルチスペクトルイメージング用の5つの領域を選択します。[選択対象:フィールドのサイズで取得]を選択:1x1を選択し、フィールド解像度の下で0.5マイクロメートル20xを選択します。このサイトケラチン染色に基づいて、細胞ケラチン陽性腫瘍組織の両方を有するいくつかの領域を選択し、かつ全体的なスキャンから画像化されるサイトケラチン陰性間質組織を選択する。すべてのマルチスペクトル画像が選択されたら、Vectraソフトウェアに切り替え、各スライドのスキャンからマルチスペクトルイメージングにタスクを変更します。次に、スキャンをクリックして、マルチスペクトルイメージング収集を実行します。マルチスペクトル画像の取得が完了したら、スペクトルを混合解除するソフトウェアを使用して、マルチスペクトル画像フォルダ内のファイルを開きます。[イメージ形式] で[マルチスペクトル'アンダーサンプルフォーマット'選択蛍光'とスペクトルライブラリソース'選択するinForm'床を選択するには、6つのフロアすべてを選択してロードし、サンプルライブラリスライドからdapiを選択し、すべてを準備をクリックします。スペクトル非混合ソフトウェアは、提供されたスペクトルプロファイルを使用して、すべてのオープン画像でスペクトルアンミックスを実行します。自動蛍光スペクトルプロファイルを識別し、そのプロファイルにアソインストレーターを付けます。自動蛍光機能を確認して、混合解除後にオート蛍光チャネルに完全にキャプチャされていることを確認し、許容可能に除去されるまで異なるサンプリングをテストしてください。次に、同じ標的の染色パターンを、同じ組織の順次スライドで病理医と評価する。各チャンネルの蛍光強度を評価するには、カウントツールを使用して、開いている画像を調査します。次に、染色プロトコルに戻り、TSA濃度を調整して、許容範囲を超えたか、または許容範囲に達しない正規化されたカウントに対処します。この代表的な分析では、扁桃組織は扁桃表面内で明確に定義されたサイトケラチン染色を実証し、陰窩骨の網状上皮において明らかなサイトケラチンおよびPDL-1染色を有するリンパ球組織の背景を持たない扁平上皮を示した。濾胞性胚葉センターは容易に認識でき、Ki-67陽性リンパ球が豊富であった。胚中心内に存在するマクロファージは、生殖中心の外側にも観察されたいくつかのマクロファージを用いてCD-68発現によって同定された。T細胞分布とPD-1発現を有するCD-8染色リンパ球は、生殖中心の周辺に集結した小リンパ球を強く染色し、ならびに濾胞領域全体に散在した。扁桃組織制御で期待される染色パターンが確認された後、同じ染色を肺癌サンプルで評価することができた。アイソタイプの陰性コントロールとドロップコントロールも評価する必要があります;背景や自動蛍光の検出だけでなく、傘の効果やスペクトルブリードについても評価する必要があります。ドロップコントロールは、新しいマルチプレックスパネルの最適化中にマルチプレックス免疫蛍光法による染色における潜在的なアーチファクトを評価するために重要です。各ドロップコントロールは、各特定のコントロールで除去されるべき単一の一次抗体を除いて、完全なマルチプレックスパネルと同じ染色パターンを示す必要があります。マルチスペクトル免疫蛍光による免疫プロファイリングは、免疫基準による腫瘍および領域の階層化を可能にし、ゲノム、トランスクリプトーミック、プロテオミクスの研究によって解析することができます。私は、多プレックス免疫蛍光を使用して、がん学や自己免疫疾患の作用機序を調べ、セトゥの単一のセクションで免疫細胞と病原性細胞の同定と特性評価を可能にしました。ヒトタンパク質、チラミド、ダピに対する抗体を扱う場合は一般的な予防措置を講じる必要がありますが、このプロトコルの試薬や材料は特に危険であることが知られていません。

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パラフィン包埋肺癌組織のマルチプレックス免疫組織化学染色

マルチプレックスサイクリック免疫組織化学は、抗原抗体のインキュベーション、画像スキャン、画像のアライメントと統合を繰り返すことで、複数のマーカーを同時にin situ...

マルチプレックスサイクリック蛍光免疫組織化学

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トランスレーショナルリサーチのためのハイスループット自動マルチプレックス免疫蛍光アッセイ(英語)

このプロトコールは、マウスFFPE黒色腫組織のDNAバーコードベースのイメージングのためのマルチプレックス免疫蛍光抗体パネルを設計するためのステップバイステップガイドを提供します。また、マウスの黒色腫腫瘍免疫微小環境に対する空間的プロテオミクスの洞察を生成するためのオープンソースツールを使用した画像解析パイプラインについても説明します。...

DNAバーコードを用いたマルチプレックス免疫蛍光イメージングによる、遺伝的に再プログラムされたマウス黒色腫のFFPE検体を解析

多重免疫蛍光は、単一の組織切片内で複数の抗体マーカーを逐次標識し、組織構造や細胞集団の空間解析を支援します。ここでは、老化に関連する構造的および免疫マーカーの多重検出のためのワークフローを紹介し、手動および自動スライド準備、反復画像診断、デジタル病理ソフトウェアを用いた単細胞解析を含みます。...

生体内での老化マーカーの空間評価のための多重免疫蛍光アッセイ

学ぶ ホルマリン固定癌組織標本の自動多重蛍光パネルによる腫瘍免疫研究法。6マーカー同時検出で免疫細胞の位置と表現型を評価し、免疫腫瘍学の研究に有用な標準化プロトコルを提供します。

ホルマリン固定癌組織標本の腫瘍免疫研究の自動多重蛍光パネル

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