Name: 並列の単核 RNA 配列のため大人の脊髄核の分離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: 学ぶ単一核RNAシーケンスのためのマウス脊髄核分離法。洗剤機械的溶解と低張機械的溶解を用いて、困難な組織から高品質な核を迅速に単離し、単一細胞レベルの遺伝子発現プロファイルを解析する。

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この作品は、NINDS イントラミュラル プログラムによって支えられた (1 ZIA NS003153 02) と NIDCD (1 ZIA DC000059 18)。C. ケーテ原稿を確認して、テクニカル サポートと有用な議論の c. i. Dobrott L. 李を感謝いたします。

国立神経疾患と脳卒中動物ケアおよび使用委員会によって承認されたプロトコールに従ったすべての動物の仕事を行った。8 の間、男性と女性の ICR/CD-1 野生型マウスのサンプルを分散し、12 週古い、すべての実験に使用されました。マウスは、地域機関動物ケアおよび使用委員会ガイドラインに沿った処理必要があります。
1. 材料とバッファーの準備
<ol><li>すべてのバッファー使用の日の準備し、事前氷で冷やします (表 1参照)。<ol>
<li>洗剤機械換散を使用している場合は、洗剤の換散バッファー (> 500 μ L サンプルごと)、低糖バッファー (サンプルごとの > 6 mL)、ショ糖密度バッファー (> サンプルあたり 12.5 mL)、および再懸濁液 (> 1 mL) を準備します。</li>
		<li>低張性機械換散を使用すると、低張性換散バッファー (サンプルごとの > 5 mL)、なして中 (サンプルごとの > 5 mL)、低糖バッファー (サンプルごとの > 3 mL)、ショ糖濃度バッファーを準備 (> サンプルあたり 12.5 mL)、および再懸濁液 (> 1 mL)。</li>
		<li>プロトコルを開始する直前に 25 mL の低糖バッファーと 25 mL のショ糖密度勾配バッファーに DTT の別の 25 μ L ジチオトレイトール (DTT) の 25 μ L を追加します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>繊維紙タオルまたはベンチ プロテクターは、単一核のキャプチャに使用するマイクロ流路を詰まらせることができますからのサンプルの汚染を最小限に抑えるためにアルミ箔で解離性の表面を覆います。</li>
	<li>RNase 除去ソリューションを解離性ツールとベンチをスプレーします。また、RNase 除去ソリューション Dounce ホモジナイザー管 (洗剤機械セル換散の場合)、オークリッジ管の内側をスプレーします。超純水、RNase フリー水で Dounce とオークリッジ管を洗います。</li>
	<li>あらかじめすべてのコレクション チューブ (50 mL の円錐形、オーク リッジ) および氷の上 Dounce ホモジナイザー チューブを冷やします。</li>
	<li>(低張性機械セル換散の場合)、火はパスツール ピペットのシリーズを磨きます。</li>
</ol>2. 脊髄の準備
<ol><li>新鮮な組織を使用する場合は、CO2吸入によるマウスを安楽死させます。次の安楽死、髪サンプルの汚染を最小限に抑えるための 70% のエタノールとマウスのコートをスプレーします。</li>
	<li>シャープ、RNase フリー手術用はさみでマウスの首をはねます。次に、腹部を優しく持ち上げる鉗子で皮膚し、内部の器官を公開する本体の長さに沿って切開を行います。</li>
	<li>マウスを骨抜きには鉗子を用いた体腔から内臓を引っ張るします。領域をクリーンアップする場合や汚染物質を導入することができるため、臓器を削除するは、ペーパー タオルを使用しないでください。はさみを使用して、L2 および L3 脊椎の脊柱をカットします。 注: 練習では、この手順は 30 秒未満で実現できます。<ol>
<li>脊髄を取り出し、氷冷 PBS の入った 25 G 1/4 インチ針付き 3 mL の注射器に入ります。脊柱の仙骨の端に針の先端を配置します。2 本の指を使用して、針の先端の周りタイトなシールを作成し、吻方脊髄を取り出し、プランジャーを押し下げて椎骨をピンチします。氷冷 PBS でシャーレに脊髄を配置します。</li>
		<li>この時点で、組織を凍結、-80 ° C で保存や洗剤機械 (ステップ 3) または低張性機械 (ステップ 4) 換散のいずれかをすぐに利用します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ドライアイスのティッシュの維持凍結組織を使用、場合洗剤機械 (ステップ 3) または低張性機械 (ステップ 4) 換散に進みます。</li>
</ol>3. 洗剤機械セル換散
<ol><li>中古冷蔵 Dounce ホモジナイザーで腰椎の脊髄を置き、500 mL 中古冷蔵洗剤の溶解バッファーを追加します。 注: マウスの腰椎脊髄は 325.5 mg ± 63.9 mg 平均の標準誤差 (SEM, N = 4)。50 mg – 1.5 グラムの組織を正常に使用できます。</li>
	<li>その後 5 〜 10 ストローク杵 B ('厳しい' 杵) 杵 (「緩い」杵)、5 ストロークで Dounce。ストロークの間に換散ソリューションのホモジナイザーを持ち上げることを避けるし、気泡を導入することを避けるため。</li>
	<li>あらかじめ冷やした 50 mL の円錐管と 1 ml 低糖バッファーの prewet に 40 mm のストレーナーを置きます。</li>
	<li>換散バッファーの原油の核をもつ Dounce ホモジナイザーに 1 mL の低糖バッファーを追加、2-3 回のピペッティングで軽く混ぜます。</li>
	<li>あらかじめ冷やした 50 mL の円錐管に 40 mm のストレーナーを原油核準備を通過します。</li>
	<li>40 mm のストレーナーは、3 mL 低糖バッファーと 500 mL の溶解バッファーに最終巻をもたらすことを追加の 1 mL 低糖バッファーを通過します。</li>
	<li>同じ円錐管でプールを複数のコードを組み合わせる場合、手順 3.1-3.6.</li>
	<li>4 ° C で 10 分間 3,200 x g でサンプルを遠心分離します。遠心分離が完了したら、上清をデカントします。手順 5 に進みます。</li>
</ol>4. 低張性機械セル換散
<ol><li>5 mL の培養皿に低張性溶解バッファーで腰椎の脊髄を配置します。春はさみの鈍い端を使用して、脊髄を二等分し、3-4 mm 部分にコードをカットする春のはさみを使用が、飾らないしないでください。 注: 組織の 50 mg – 1.5 グラム正常に使用されます。</li>
	<li>旋回 2-3 回、15 分間氷の上を孵化させなさい。</li>
	<li>低張性の換散バッファーを希釈する HEB 媒体の 5 mL を追加します。</li>
	<li>5 mL の血清ピペットで 10 回または組織の作品のすべてをスムーズにピペットの開口部を通って移動まで組織をカップ刻んだ。</li>
	<li>徐々 に小さく直径 3 火磨かれたパスツール ピペットのシリーズ カップ刻んだ (~ 900-600 mm)。<ol>
<li>各ピペット用カップ刻んだ 5-15 回、解決、解離核を含む上清の 1-2 mL を削除およびあらかじめ冷やした 50 mL の円錐管に 40 mm のストレーナー通過する組織を許可します。</li>
		<li>後製粉最小サイズ パスツール ピペット、ピペット チップを磨砕液がスムーズに流れることを確認します。50 mL の円錐管に 40 mm のストレーナーを残りの溶液を通過します。 注: triturations の合計数を調整することができますに応じて。マウス脊髄の髄膜が残りますが、脊髄の任意の目に見える塊をカップ刻んだことが重要です。40 m ストレーナーを残りの磨砕液を通過します。製粉中に気泡を導入することは避けてください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>4 ° C で 10 分間 1,000 x g でフィルターが適用されたサンプルを遠心分離します。遠心分離が完了、デカントし、上澄みを廃棄します。手順 5 に進みます。</li>
</ol>5. 均質化とショ糖密度勾配
<ol><li>ステップ 3 か 4 で後、は、3 mL の低糖バッファーを使用してペレットを再懸濁します。ゆっくりペレットを再懸濁のため壁から削除する旋回します。サンプルを 2 分間氷の上に座るし、懸濁液をオークリッジ管に転送ができます。</li>
	<li>ホモジナイザーを使用して 1 を設定すると、15-30 秒、氷のサンプルを維持するための低糖バッファー内核を均質化します。 注: 使用 15 s 1 腰椎脊髄または 30 を使用して場合 s を使用して場合プールのサンプルまたは脊髄全体。</li>
	<li>血清ピペット、12.5 mL の低糖バッファー ホモジネート、密度レイヤーを混乱させるバブルを作成することの世話の下に密度ショ糖バッファー層を使用しています。</li>
	<li>4 ° C で 20 分 3,200 x g でチューブを遠心分離します。</li>
	<li>遠心分離が完了したら、素早く動かす動きで上清をデカントすぐに。 注: 音量とクリーナー最終サンプルを作成必要な場合に残気量 (400 mL 未満) ショ糖バッファーが破棄できるが、この残気量、核が含まれて、核収率を最大限に維持できます。</li>
	<li>100 mL-再懸濁溶液 1 mL を使用すると、残りの壁に核再懸濁します。洗剤ベースの準備で残っているミエリン 'しかめ面' は避けてください。</li>
	<li>30-35 mm 孔径ストレーナー核をフィルターし、事前冷却管で収集します。</li>
	<li>核をもたらす対物レンズ 10 倍の下で核をカウントするため、検定を使用を決定します。 注: トリパン ブルーは青表示すべき核を視覚化する追加できます。細胞の残骸の量に注意してください。</li>
	<li>ステップ 6 または 7 のいずれかに進みます。</li>
</ol>6. 超並列 snRNA シーケンス: 学術プラットフォーム7
<ol><li>(例えば、ドロップ Seq) 並列 snRNA のシーケンス処理の実行方法前述したように以下の変更7 :4<ol>
<li>最終濃度 1 mL あたり 225 核に核を調整します。</li>
		<li>1 mL あたり 250 ビーズの濃度でバーコード ビーズを準備します。</li>
		<li>0.7 %sarkosyl の換散バッファーを準備します。</li>
		<li>ビーズ、核、毎分 35 mL、200 mL のオイルのための分あたりの毎分 35 mL に流量を調整します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. 超並列 snRNA シーケンス: 商業プラットホーム26
<ol><li>商業のプラットフォーム (例えば、クロム単一細胞遺伝子発現ソリューション) を使用して並列の snRNA シーケンス処理の実行によると、以下の変更を製造元の指示26製品。<ol>
<li>次の逆のトランスクリプション、核細胞と比較して減少した cDNA を補うために標的細胞の回復に基づく cDNA 増幅サイクル数の計算に追加の PCR のサイクルを追加します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Hrvatin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+of+experience-dependent+transcriptomic+states+in+the+mouse+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis of experience-dependent transcriptomic states in the mouse visual cortex.</a> Nature Neuroscience. 21 (1), 120-129 (2018).</li>
<li>Hu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+Cell-Type+Composition+and+Activity-Dependent+Transcriptional+State+in+Mammalian+Brains+by+Massively+Parallel+Single-Nucleus+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Dissecting Cell-Type Composition and Activity-Dependent Transcriptional State in Mammalian Brains by Massively Parallel Single-Nucleus RNA-Seq.</a> Molecular Cell. 68 (5), 1006-1015 (2017).</li>
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<li>Villani, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA-seq+reveals+new+types+of+human+blood+dendritic+cells%2C+monocytes%2C+and+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA-seq reveals new types of human blood dendritic cells, monocytes, and progenitors.</a> Science. 356 (6335), (2017).</li>
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<li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+subtypes+and+diversity+revealed+by+single-nucleus+RNA+sequencing+of+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain.</a> Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).</li>
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<li>Krishnaswami, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+single+nuclei+for+RNA-seq+to+capture+the+transcriptome+of+postmortem+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons.</a> Nature Protocols. 11 (3), 499-524 (2016).</li>
<li>Matevossian, A., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+nuclei+isolation+from+human+postmortem+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).</li>
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</ol>

我々 は明らかに利害の対立があります。

このプロトコルの究極の目標は、下流の転写解析のための高品質の RNA を含む核を分離することです。我々 は、すべての脊髄の細胞型をプロファイルするために snRNA Seq メソッドを適応しました。当初、ことが判明した典型的な細胞解離方法ない単一細胞 RNA シーケンス、効果的な脊髄神経が細胞死を特に受けやすい。さらに、細胞解離手法は 100 倍までいくつかによるさまざまな活動とストレス応答遺伝子の発現を誘発します。3,4,16は、単一のセルの準備に関連付けられている欠点を与えられた、私たちと他の人が核の代替として使用します。16,17,18,24このメソッドは、冷凍脊髄組織を含む人間の組織にも使用...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/58413/isolation-adult-spinal-cord-nuclei-for-massively-parallel-single">Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing</a>. The Protocol section was updated.
Step 3.1 was updated from:
Place the lumbar spinal cord in a pre-chilled Dounce homogenizer and add 500 mL pre-chilled detergent lysis buffer.
to:
Place the lumbar spinal cord in a pre-chilled Dounce homogenizer and add 500 &#956;L pre-chilled detergent lysis buffer.
Step 3.6 was updated from:
Pass an additional 1 mL low sucrose buffer over the 40 mm strainer, bringing the final volume to 3 mL of the low sucrose buffer and 500 mL of the lysis buffer.
to:
Pass an additional 1 mL low sucrose buffer over the 40 mm strainer, bringing the final volume to 3 mL of the low sucrose buffer and 500 &#956;L of the lysis buffer.
Step 5.5 was updated from:
Once the centrifugation is complete, immediately decant the supernatant in a flicking motion. 
NOTE: A residual volume (less than 400 mL) of sucrose buffer can be discarded if desired to produce a lower volume and cleaner final sample, but this residual volume does contain nuclei and can be preserved to maximize nuclei yield
to:
Once the centrifugation is complete, immediately decant the supernatant in a flicking motion. 
NOTE: A residual volume (less than 400 &#956;L) of sucrose buffer can be discarded if desired to produce a lower volume and cleaner final sample, but this residual volume does contain nuclei and can be preserved to maximize nuclei yield
Step 5.6 was updated from:
Using 100 mL - 1 mL of resuspension solution, resuspend the nuclei remaining on the wall. Avoid the myelin &#8216;frown&#8217; that remains with the detergent-based preparation.
to:
Using 100 &#956;L - 1 mL of resuspension solution, resuspend the nuclei remaining on the wall. Avoid the myelin &#8216;frown&#8217; that remains with the detergent-based preparation.
Steps 6.1.1 - 6.1.4 were&#160;updated from:
<ol>
	<li>Adjust nuclei to a final concentration of 225 nuclei per mL.</li>
	<li>Prepare barcoded beads at a concentration of 250 beads per mL.</li>
	<li>Prepare the lysis buffer with 0.7% sarkosyl.</li>
	<li>Adjust the flow rates to 35 mL per min for beads, 35 mL per min for nuclei, and 200 mL per min for oil.</li>
</ol>
to:
<ol>
	<li>Adjust nuclei to a final concentration of 225 nuclei per &#956;L.</li>
	<li>Prepare barcoded beads at a concentration of 250 beads per &#956;L.</li>
	<li>Prepare the lysis buffer with 0.7% sarkosyl.</li>
	<li>Adjust the flow rates to 35 &#956;L per min for beads, 35 &#956;L per min for nuclei, and 200 &#956;L per min for oil.</li>
</ol>

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/58413/isolation-adult-spinal-cord-nuclei-for-massively-parallel-single">Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing</a>. The Protocol section was updated.

Erratum: Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

神経系は、形態学的、生化学的、および電気生理学的特性の多様な配列を表示するセルの異種グループで構成されます。一括 RNA シーケンスは、異なる条件下での遺伝子発現の組織全体にわたる変更を決める際に有用されている、単一細胞レベルでの転写の変化の検出ができなくなります。単一細胞の転写解析における最近の進歩は、異種細胞の機能グループ分子をレパートリーに基づく分類を有効にし、最近活躍していたニューロンのセットを検出にも利用できます。1,2,3,4過去 10 年間単一細胞 RNA シーケンス (Seq-scRNA) の開発が有効に細胞タイプの多様にビューを提供する個々 の細胞における遺伝子発現の研究。5
超並列 scRNA-Seq などの拡張性の高いアプローチの出現は、中枢神経系の多くの地域を含むシーケンス異種組織のプラットフォームを提供しています。6,7,8,9,10,11,12,13,14,15ただし、単一セル解離メソッドは、遺伝子発現の実験的変化と同様、細胞死につながることができます。16最近の作品は、内因性転写プロファイルの保存を有効にする 1 つのセルの配列方法を適応しています。1,3,4,17,18,19これらの戦略は、前初期遺伝子 (IEG) 発現次の感覚的な刺激や動作を検出するために特に適しています。3,4将来、この戦略も使える組織病気の状態やストレスへの応答のダイナミックな変化を検討します。これらのメソッドの核 RNA シーケンス (Seq snRNA) はストレスを誘発する細胞解離を伴わない、(脊髄) などの組織を分離することは困難として冷凍で使用できる有望なアプローチ組織。4,17,18,19核分離従来から適合、20,21,22,23,25 snRNA Seq 通常利用して急速な組織の混乱とセル細胞の残骸から核を分離、遠心分離、冷たい条件の下での換散。4核は下流の次世代シーケンシング複数マイクロ液滴のカプセル化プラットフォーム上の分離できます。4,7,24,25のこの方法はセルの何千もの転写活性のスナップショットの時点でできます。
分離とそれぞれ独自の長所と短所を持つシーケンスの前に細胞から核を解放するための戦略は複数あります。ここで、説明と下流の並列 snRNA Seq の大人の脊髄からの核の隔離を有効にする 2 つのプロトコルを比較: 洗剤機械換散および低張性機械換散。洗剤機械換散では、完全な組織破壊と核の高い最終的な利回りを提供しています。低張性機械溶解には量と最終的に核収量の純度のバランスを選択する機会を提供する組織破壊度制御できるにはが含まれます。これらのアプローチは匹敵する RNA の収穫、核および細胞型プロファイルごとの遺伝子の検出数を提供しも両方使用できます正常に snRNA シーケンスの

<table><tbody><tr><td>スクロース</td><td>Invitrogen</td><td>15503-022</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES (pH = 8.0)</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1016-100G</td><td></td></tr><tr><td>MgAc</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M5661-50G</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA (pH = 8.0)</td><td>Corning</td><td>MT-46034CI</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10197777001</td><td>使用直前にDTTを追加</td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー水</td><td>Crystalgen</td><td>221-238-10</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl (pH = 7.4)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>T2194</td><td></td></tr><tr><td>5 M NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>59222C</td><td></td></tr><tr><td>1 M MgCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40</td><td>Sigma Aldrich</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Hibernate-A</td><td>Gibco</td><td>A12475-01</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax (100x)</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>B27 (50x)</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Crystalgen</td><td>221-133-10</td><td></td></tr><tr><td>0.04% BSA</td><td>New England Biolabs</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td>0.2 U/&mu;L RNAse阻害剤</td><td>Lucigen</td><td>30281-1</td><td></td></tr><tr><td>オークリッジ遠心分離管</td><td>Thermo Scientific</td><td>3118-0050</td><td></td></tr><tr><td>使い捨て綿栓ホウケイ酸ガラスパスツールピペット</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>13-678-8B</td><td></td></tr><tr><td>ガラスティッシュドンス (2 mL)</td><td>Kimble</td><td>885303-002</td><td></td></tr><tr><td>ガラス大クリアランス乳棒</td><td>Kimble</td><td>885301-0002</td><td></td></tr><tr><td>ガラス スモール クリアランス 乳棒</td><td>Kimble</td><td>885302-002</td><td></td></tr><tr><td>T 10 Basic Ultra Turrax Homogenizer</td><td>IKA</td><td>3737001</td><td></td></tr><tr><td>分散ツール (S 10 N &ndash; 5G)</td><td>IKA</td><td>3304000</td><td></td></tr><tr><td>トリパン ブルーステイン (0.4%)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu;m細胞ス</td><td>トレーナーFalcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>MACS SmartStrainers、30 &mu;m</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-458</td><td></td></tr><tr><td>コニカルチューブ</td><td>Denville Scientific</td><td>1000799</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend XTR 遠心分離機</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック サイエンティフィ</td>ック <td>サイエン</td>ティフィック 75004505 <td></td></tr><tr><td>ファイバーライト F15-6 x 100y 固定角ローター</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>75003698</td><td></td></tr><tr><td>ステロジカルピペット: 5 mL、10 mL</td><td>デンビルサイエンティフィック</td><td>P7127</td><td></td></tr><tr><td>血球計算盤</td><td>Daigger Scientific</td><td>EF16034F</td><td></td></tr><tr><td>Chemgenes バーコード</td>ビーズ <td>Chemgenes</td><td>Macosko-2011-10</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap RNase 除染ソリューション</td><td>Invitrogen</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 試験管 セルストレーナーキャップ付き (35 &mu;m)</td><td>Corning</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>MoFlo Astrios Cell Sorter</td><td>Beckman Coulter</td><td>B25982</td><td></td></tr><tr><td>Chromium i7 マルチプレックスキット、96 rxns</td><td>10X Genomics</td><td>120262</td><td></td></tr><tr><td>Chromium Single Cell 3'ライブラリー&ゲルビーズキット v2、4 rxns</td><td>10X Genomics</td><td>120267</td><td></td></tr><tr><td>Chromium Single Cell A チップキット、16 rxns</td><td>10X Genomics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tissue Culture Dish (60 mm x 15 mm)</td><td>Corning</td><td>353002</td><td></td></tr></tbody></table>

並列の単核 rna 配列のため大人の脊髄核の分離

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

個々 の細胞の遺伝子発現を調査セルの種類および細胞の同定ができます。単一細胞 RNA シーケンスは、中枢神経系など異種組織の特に細胞の転写プロファイルを勉強するための強力なツールとして浮上しています。ただし、セルを 1 つのシーケンスに必要な解離メソッドは、遺伝子発現と細胞死の実験的な変更につながることができます。さらに、これらのメソッドは、一般にアーカイブに関する研究とバイオ銀行材料が少なくて、新鮮な組織に制限されます。単一核 RNA シーケンス (Seq snRNA) は転写研究、それが正確に細胞の種類を識別する、冷凍または分離することは困難である組織の研究を許可を与えられた魅力的な代替され、解離による転写。ここでは、提案する下流 snRNA シーケンスの核の急速な隔離のための高スループット プロトコルこのメソッドでは、新鮮なまたは冷凍脊髄由来の核の隔離を有効にし、2 つの並列の液滴カプセル化プラットフォームと組み合わせることができます。

ここでは、下流の並列 RNA シーケンスの成体マウスの腰椎脊髄から核の分離を行った。プロトコルは 3 つの主要なコンポーネントを関与する: 組織混乱と細胞換散、均質化、およびショ糖密度遠心分離 (図 1)。秒以内に、洗剤機械換散は細胞およびティッシュの残骸 (図 2 a, 表 2) と同様に、核の数が多いと原油の核の準備をもたらした。15 分後に、低張性機械換散はいた以下の残骸 (図 2 b, 表 2) も少ない核原油核の準備をもたらした。両方の準備は、均質化を施行した (図 2 とD) と 0.04 %bsa を PBS に再懸濁の前にショ糖密度勾配遠心法 (...

ここでは、急速に下流の並列 RNA 配列のため新鮮なまたは冷凍組織から高品質の核を分離するためのプロトコルを提案する.我々 オプションを含める洗剤機械と低張性機械組織破壊とセル換散の核の隔離のどちらも使用できます。

並列の単核 RNA 配列のため大人の脊髄核の分離

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

単細胞RNAシーケンシングは、細胞の転写プロファイル、特に中枢神経系などの異種組織を研究するための強力なツールです。このプロトコルは、単核RNAシーケンシング用の核を単離する方法を提供する。細胞の代わりに核を用いることで、この方法は、凍結組織だけでなく、解解化が困難な組織に適用することができる。さらに、この方法は、疾患または傷害後の細胞における細胞型特異的変化を研究するために適用することができる。テキスト プロトコルで説明されているように、マウス安楽死でこの手順を開始します。次に、体の長さに沿って切開を行い、内臓を露出させる。鉗子を使用して体腔から内臓を引っ張ることによって、マウスを回避する。汚れが生じる可能性があるため、ペーパータオルを使用してエリアを清掃したり、臓器を取り除いたりしないでください。はさみを使用して、L2とL3脊椎間の椎骨柱を切断します。脊髄を取り出すには、25ゲージ1/4インチの針で氷冷PBSを含む3ミリリットルの注射器を取り付けます。針の先端を脊椎柱の仙骨端に入れる。2本の指を使って椎骨をつまんで針の先端にタイトなシールを作成し、プランジャーを押して脊髄をロストリーで排出します。氷冷PBSのペトリ皿に脊髄を入れます。コードの腰部のみが必要な場合は、脊髄の仙骨部と胸部を切り取ってください。この時点で、組織を凍結し、マイナス80°Cで保存するか、またはここで説明するように洗剤機械的細胞のリシス、またはテキストプロトコルに記載されているように低張力機械的なライシスのいずれかにすぐに使用する。洗剤の機械的細胞のリシスを決定するには、腰椎を冷やされたDounceホモジナイザーに入れ、500マイクロリットルの冷やされた洗剤リシスバッファーを加えます。緩い害虫の5ストローク、A、そしてタイトな害虫の5〜10ストロークでダウンス、B.ストロークの間に溶解溶液の外側のホモジナイザーを持ち上げることを避け、気泡を導入することを避けてください。さて、40ミクロンのストレーナーを冷やした50ミリリットルの円錐管の上に置き、低いショ糖緩衝液の1ミリリットルで予め濡らします。粗核を含むDounceホモジナイザーに低いショ糖バッファーを1ミリリットル加え、2~3回ピペットで軽く混ぜます。40ミクロンのストレーナーの上に粗核の準備を渡し、事前に冷やした50ミリリットルの円錐形チューブに入れられます。40ミクロンのストレーナーの上に追加の1ミリリットルの低スクロースバッファーを渡し、最終体積を低スクロースバッファーの3ミリリットルと500マイクロリットルのリシスバッファーに持ち込みます。複数のコードを組み合わせて、同じ円錐形のチューブで冷却する場合は、これらの手順を繰り返します。次いで、試料を摂氏4度で10分間Gの3200倍に遠心する。遠心分離が完了したら、上清をデカントします。我々は、低いショ糖バッファーの3ミリリットルを使用してパレットを中断します。壁からペレットを取り除くように静かに旋回し、再懸濁を容易にします。サンプルを氷の上に2分間置いた後、サスペンションをオークリッジチューブに移します。1の設定でホモジナイザーを使用して、低ショ糖バッファー内の核を15〜30秒間均質化し、サンプルを氷の上に保ちます。次に、血清ピペットを使用して12.5ミリリットルの密度スクロースバッファーを層し、低ショ糖バッファーホモジネートの下に、密度層を破壊する気泡を作り出さないので注意する。チューブをGの3200倍、摂氏4度で20分間遠心分離する。遠心分離が完了したら、すぐにフリックモーションで上清をデカントします。この手順を試みる間、直ちに遠心分離機からオークリッジチューブを取り外し、上清を素早くデカントすることを忘れないでください。100マイクロリットルから1ミリリットルの再懸濁液を用いて、壁に残っている核を懸濁させる。洗剤ベースの準備に残っているミエリンの眉をひそめないようにしてください。これらのステップを迅速に行わないと、過剰な細胞破片、またはミエリンを含む核調製が行われ、下流の単核RNAシーケンシングを妨げる可能性があります。30〜35ミクロンの孔サイズストレーナーを介して核をフィルタリングし、事前に冷却されたチューブに収集します。テキストプロトコルに記載されているように、単核RNAシーケンシングに進む前に、ヘモサイトメーターを使用して10 xの目的の下で核を数え、核収率を決定する。核の明るいフィールドおよび蛍光画像は、洗剤機械的なリシスプロトコルを用いて単離され、10xで示される。これらの核は、単一細胞のレベルで内因性遺伝子発現プロファイルの研究を可能にする、公平な方法で単離される。ここに示されている、単核RNAシーケンシングの代表的なtSNEプロットは、マウス腰椎脊髄から、大規模に平行な液滴カプセル化プラットフォームを用いた。新鮮な組織または凍結組織から単離された核は、商業的および学術的なプラットフォームの両方でシーケンシングに使用することができます。この技術により、研究者は、脊髄などの解解化が困難な組織、あるいはバイオバンク材料などの凍結組織を使用して、単一細胞レベルで転写プロファイルを探索することができます。この手順を試みる間, 安楽死と細胞のリシスの間の時間の量を減らすことが重要です..さらに、細胞のリシスから再懸濁液に導入される気泡を最小限に抑え、ペットの核を注意して購入することが重要です。この手順に従って、核は、特定の細胞タイプを分離するために、ファックソートなどの代替用途に使用することができる。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

成体マウス脳半球の異なる解剖領域からミクログリアを分離するためのプロトコルを提供し、続いて全長転写物の深い単一細胞RNAシーケンシングのための半自動化ライブラリ製剤を提供する。この方法は、健康と疾患におけるミクログリアの機能的不均一性を解明するのに役立ちます。...

ディープシングルセルRNAシーケンシングのための1つの成人マウス脳半球からの領域特異的ミクログリアの分離

この出版物は、成熟したアディポサイトからの核の単離、蛍光活性化分類による精製、および単一細胞レベルのトランスクリプトミクスのためのプロトコルを記述する。...

単細胞ゲノムアプリケーションのための脂肪組織核の分離

単核単離は、細胞膜の解離および洗剤ベースの透過性、最適化を必要とし、技術的なアーティファクトを導入する傾向があるステップに依存しています。我々は、単核RNA-seq(snRNA-Seq)またはATAC-seqに適した核を得て、組織全体から直接無傷核を迅速に単離するための洗浄剤および酵素フリープロトコルを実証する。...

洗浄剤と酵素を含まない方法を用いた組織全体からの核分離

腫瘍内不均一性は、神経膠腫を含む腫瘍の固有の特徴である。我々は、単核RNAおよびATACシーケンシング研究のために、新鮮な凍結したグリオーマ組織から単一核を単一核に分離するために、バッファーと勾配遠心分離の組み合わせを利用するシンプルで効率的なプロトコルを開発した。...

単核RNA-seqおよびATAC-seqのための新鮮な凍結脳腫瘍からの核分離

ここでは、髄質腎細胞タイプの表現を改善し、酵素組織解離による遺伝子発現アーティファクトを回避する凍結マウス腎臓から高品質の核を単離するためのプロトコルを提示します。...

単核RNAシーケンシングのための成体マウス腎臓からの核分離

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単一核RNAシーケンシングのためのマウス交感神経節のバーコード化抗体による低入力核単離および多重化

ここでは、一核RNA-seq、ATAC-seq、およびジョイントマルチオミクス(RNA-seqおよびATAC-seq)について、瞬間凍結されたアーカイブされた肝臓組織から核を単離するためのプロトコルを紹介します。...

シングルセルマルチオミクスのための瞬間凍結肝臓組織からの核の単離

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この研究では、下流の単一核RNAシーケンシングのために、凍結した哺乳類組織から高品質の核を単離するための、シンプルで迅速、かつ部分的に自動化されたプロトコルについて説明しています。...

単一核の配列のための凍結した哺乳類ティッシュからの単一核の隔離のための簡単で、速く、部分的に自動化されたプロトコル

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マルチオームシーケンシングのための新鮮および凍結固形腫瘍標本からの最適化された核分離(英語)

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ヒト筋肉間脂肪組織からの核の単離と下流の単一核RNAシーケンシング

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並列の単核 RNA 配列のため大人の脊髄核の分離

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