並列の単核 RNA 配列のため大人の脊髄核の分離
October 12th, 2018
ここでは、急速に下流の並列 RNA 配列のため新鮮なまたは冷凍組織から高品質の核を分離するためのプロトコルを提案する.我々 オプションを含める洗剤機械と低張性機械組織破壊とセル換散の核の隔離のどちらも使用できます。
単細胞RNAシーケンシングは、細胞の転写プロファイル、特に中枢神経系などの異種組織を研究するための強力なツールです。このプロトコルは、単核RNAシーケンシング用の核を単離する方法を提供する。細胞の代わりに核を用いることで、この方法は、凍結組織だけでなく、解解化が困難な組織に適用することができる。
さらに、この方法は、疾患または傷害後の細胞における細胞型特異的変化を研究するために適用することができる。テキスト プロトコルで説明されているように、マウス安楽死でこの手順を開始します。次に、体の長さに沿って切開を行い、内臓を露出させる。
鉗子を使用して体腔から内臓を引っ張ることによって、マウスを回避する。汚れが生じる可能性があるため、ペーパータオルを使用してエリアを清掃したり、臓器を取り除いたりしないでください。はさみを使用して、L2とL3脊椎間の椎骨柱を切断します。
脊髄を取り出すには、25ゲージ1/4インチの針で氷冷PBSを含む3ミリリットルの注射器を取り付けます。針の先端を脊椎柱の仙骨端に入れる。2本の指を使って椎骨をつまんで針の先端にタイトなシールを作成し、プランジャーを押して脊髄をロストリーで排出します。
氷冷PBSのペトリ皿に脊髄を入れます。コードの腰部のみが必要な場合は、脊髄の仙骨部と胸部を切り取ってください。この時点で、組織を凍結し、マイナス80°Cで保存するか、またはここで説明するように洗剤機械的細胞のリシス、またはテキストプロトコルに記載されているように低張力機械的なライシスのいずれかにすぐに使用する。
洗剤の機械的細胞のリシスを決定するには、腰椎を冷やされたDounceホモジナイザーに入れ、500マイクロリットルの冷やされた洗剤リシスバッファーを加えます。緩い害虫の5ストローク、A、そしてタイトな害虫の5〜10ストロークでダウンス、B.ストロークの間に溶解溶液の外側のホモジナイザーを持ち上げることを避け、気泡を導入することを避けてください。さて、40ミクロンのストレーナーを冷やした50ミリリットルの円錐管の上に置き、低いショ糖緩衝液の1ミリリットルで予め濡らします。
粗核を含むDounceホモジナイザーに低いショ糖バッファーを1ミリリットル加え、2~3回ピペットで軽く混ぜます。40ミクロンのストレーナーの上に粗核の準備を渡し、事前に冷やした50ミリリットルの円錐形チューブに入れられます。40ミクロンのストレーナーの上に追加の1ミリリットルの低スクロースバッファーを渡し、最終体積を低スクロースバッファーの3ミリリットルと500マイクロリットルのリシスバッファーに持ち込みます。
複数のコードを組み合わせて、同じ円錐形のチューブで冷却する場合は、これらの手順を繰り返します。次いで、試料を摂氏4度で10分間Gの3200倍に遠心する。遠心分離が完了したら、上清をデカントします。
我々は、低いショ糖バッファーの3ミリリットルを使用してパレットを中断します。壁からペレットを取り除くように静かに旋回し、再懸濁を容易にします。サンプルを氷の上に2分間置いた後、サスペンションをオークリッジチューブに移します。
1の設定でホモジナイザーを使用して、低ショ糖バッファー内の核を15〜30秒間均質化し、サンプルを氷の上に保ちます。次に、血清ピペットを使用して12.5ミリリットルの密度スクロースバッファーを層し、低ショ糖バッファーホモジネートの下に、密度層を破壊する気泡を作り出さないので注意する。チューブをGの3200倍、摂氏4度で20分間遠心分離する。
遠心分離が完了したら、すぐにフリックモーションで上清をデカントします。この手順を試みる間、直ちに遠心分離機からオークリッジチューブを取り外し、上清を素早くデカントすることを忘れないでください。100マイクロリットルから1ミリリットルの再懸濁液を用いて、壁に残っている核を懸濁させる。
洗剤ベースの準備に残っているミエリンの眉をひそめないようにしてください。これらのステップを迅速に行わないと、過剰な細胞破片、またはミエリンを含む核調製が行われ、下流の単核RNAシーケンシングを妨げる可能性があります。30〜35ミクロンの孔サイズストレーナーを介して核をフィルタリングし、事前に冷却されたチューブに収集します。
テキストプロトコルに記載されているように、単核RNAシーケンシングに進む前に、ヘモサイトメーターを使用して10 xの目的の下で核を数え、核収率を決定する。核の明るいフィールドおよび蛍光画像は、洗剤機械的なリシスプロトコルを用いて単離され、10xで示される。これらの核は、単一細胞のレベルで内因性遺伝子発現プロファイルの研究を可能にする、公平な方法で単離される。
ここに示されている、単核RNAシーケンシングの代表的なtSNEプロットは、マウス腰椎脊髄から、大規模に平行な液滴カプセル化プラットフォームを用いた。新鮮な組織または凍結組織から単離された核は、商業的および学術的なプラットフォームの両方でシーケンシングに使用することができます。この技術により、研究者は、脊髄などの解解化が困難な組織、あるいはバイオバンク材料などの凍結組織を使用して、単一細胞レベルで転写プロファイルを探索することができます。
この手順を試みる間, 安楽死と細胞のリシスの間の時間の量を減らすことが重要です..さらに、細胞のリシスから再懸濁液に導入される気泡を最小限に抑え、ペットの核を注意して購入することが重要です。この手順に従って、核は、特定の細胞タイプを分離するために、ファックソートなどの代替用途に使用することができる。
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概要
この研究は、生鮮または冷凍組織から高品質の核を迅速に分離するためのプロトコルを提示し、特に下流の大規模並列RNAシーケンシングのために開発されています。この方法論は、界面活性剤機械的および低張性機械的組織破壊と溶解の両方に対応し、難しい組織タイプから核を効果的に分離することができます。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 遺伝子発現解析
背景
- シングルセルRNAシーケンシング（scRNA-seq）は、不均一な組織における転写プロファイルの調査を可能にします。
- 全細胞ではなく核を分離することで、解離が困難な凍結組織の分析が可能になります。
- この方法により、特定の細胞タイプにおける傷害または疾患の影響を研究することができます。
研究の目的
- シングル核RNAシーケンシングに適した核を分離するための信頼性の高いプロトコルを開発すること。
- より広範な生物学的文脈での遺伝子発現プロファイルの分析を容易にすること。
- 疾患または傷害に対する細胞タイプ特異的な反応への洞察を可能にすること。
使用された方法
- このプロトコルは、マウスの脊髄組織から核を分離するための機械的溶解方法を含みます。
- マウスの脊髄は、安楽死と慎重な解剖の後にシーケンシングのために準備されました。
- 重要なステップには、核分離中のDounceホモジナイザーと様々なバッファー溶液の使用が含まれます。
- 収率と分離効率は遠心分離とフィルタリングの方法によって評価されました。
主要な結果
- 核の分離が成功し、その後のシングル核RNAシーケンシングを可能にしました。
- この結果により、単一細胞レベルでの内因性遺伝子発現プロファイルの研究が可能になりました。
- 主要な発見は、難しい組織における様々な条件に対する転写反応を調査する可能性を示しています。
結論
- この研究は、多様な生物学的シナリオにおけるシングルセル分析へのアクセスを向上させる核分離の効率的な方法を確立しました。
- これは、汚染を最小限に抑えるために迅速な処理と慎重な実行の重要性を強調しています。
- その影響は、神経機構、可塑性、および疾患モデルにおける反応の検討にまで及びます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Isolating nuclei from difficult-to-dissociate tissues like the spinal cord enables high-fidelity transcriptional profiling without dissociation artifacts, supporting target validation in neuroscience drug discovery. This method extends accessibility to frozen biobank samples, improving sample availability for preclinical studies and mechanistic de-risking of CNS targets. By enabling single-nucleus resolution in heterogeneous tissues, it enhances predictive confidence in early target engagement and pathway modulation assessments.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of cell-type-specific transcriptional responses in the spinal cord following disease or injury models.
- Operational Value: Reduces dissociation-induced gene expression changes, improving data reliability for target hypothesis testing.
- Predictive Value: Supports functional target validation by linking nuclear RNA profiles to phenotypic states in CNS tissues.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces nuclei suitable for massively parallel droplet-based sequencing, enabling scalable profiling of compound-treated tissues.
- Operational Value: Standardized lysis and filtration steps improve reproducibility across fresh and frozen spinal cord samples.
- Assay Readiness: Filtered nuclei preparations are compatible with commercial snRNA-Seq platforms, supporting downstream drug screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Allows comparison of gene expression profiles between fresh and frozen tissue, supporting biobank utilization in preclinical studies.
- Mechanistic De-risking: Facilitates study of endogenous gene expression in neuronal and glial populations without artifacts from enzymatic dissociation.
- Predictive Confidence: Enables detection of cell-type-specific changes relevant to CNS disease mechanisms and target modulation.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead optimization, particularly for CNS targets where tissue accessibility and sample preservation are critical.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling unbiased transcriptional profiling of spinal cord cell types following perturbation.
- Screening: Generates nuclei yields compatible with high-throughput sequencing platforms for compound effect evaluation.
- Analytics: Delivers quantitative, single-nucleus resolution gene expression data enabling condition comparisons and clustering.
- Translational Research: Connects fresh tissue findings to biobank studies through consistent nuclei isolation from frozen material.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized nuclei isolation protocol applicable across multiple CNS disease models and tissue types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing technical noise from dissociation artifacts.
- Operational Value: Enhances reproducibility and sample throughput through standardized mechanical lysis and density purification.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling reliable target engagement readouts in physiologically relevant CNS tissues.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by providing transcriptional evidence of target modulation in disease-relevant cell types.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue dissection, mechanical lysis, and nuclei handling to avoid contamination and degradation.
- Dependent on access to Dounce homogenizers, centrifuges, and strainers for nuclei isolation and purification.
- Necessitates standardized protocols across teams to ensure consistency in nuclei yield and quality for sequencing.
- Must account for tissue-specific optimization when applying to other CNS regions or disease models beyond lumbar spinal cord.
- Practical limitations include time sensitivity between euthanasia and lysis to prevent RNA degradation and myelin contamination.
