Name: CD4 の分離+ T 細胞および循環の解析 T 濾胞ヘルパー (cTfh) 末梢血を使用して 6 色フローサイトメトリーから細胞のサブセット (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: 学ぶフローサイトメトリーによる末梢血由来CD4+T細胞および循環T濾胞ヘルパー細胞サブセットの分離・解析法。高速バッチ処理で細胞生存性を維持し、疾患バイオマーカー評価に応用可能です。

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仕事は、ETB し会員数白血病英国からの助成金によって支えられました。

血液サンプルは健常者 (NS) から得られた (n = 12) 辺縁帯リンパ腫 (MZL) 患者だけでなく、(n = 7) および他の種類の B 細胞非ホジキン リンパ腫 (BNHL) (6 FL 患者、2, リンパ形質細胞性リンパ腫患者および 1 の低悪性度 B 細胞非ホジキン リンパ腫明記のない患者)。患者は情報を与えて、すべての研究のための場所で倫理的な承認を得て、書面による同意後レスターのロイヤル診療所で血液診療所から募集されました。倫理的な承認は、レスターシャー、ノーサンプトンシャー、ラトランド研究倫理委員会 1、患者のサンプルと健康研究機関 (HRA) システムオン委員会イースト ・ ミッドランズ-ダービーの 06/Q2501/122 参照によって得られた、14/EM/1176 を参照健常者。
1. CD4 の分離+全末梢血 T 細胞
<ol><li>K2EDTA 管に標準的な穿刺および最大実行可能性を維持するために、できるだけ早く処理による新鮮な末梢血 (2 に 15 mL) を取る。 注:規格研究所個人保護具 (コート、手袋、メガネ) を使用し、クラス II の安全キャビネットで仕事を遂行します。</li>
	<li>血とすべての必要な試薬をもたらす (CD4+トウキョウ セル場合凍結媒体密度勾配メディア、2% 胎仔ウシ血清/リン酸緩衝生理食塩水 (PBS/FBS) 濃縮カクテル) 室温に。</li>
	<li>血を混ぜて人間 CD4 の濃縮のための抗体の市販カクテル+ T 細胞。血のすべて 1 mL に試薬 50 μ L を使用します。血の 5 に 15 mL の 50 mL のコニカル ポリプロピレン チューブを使用します。 注:4 に 2 ミリリットルの血液を使用している場合は、この手順を実行 14 mL の円錐ポリプロピレン管で。</li>
	<li>20 分間室温で混合物を孵化させなさい。</li>
	<li>2% の等量混合物を希釈 FBS/PBS</li>
	<li>
密度勾配メディア インターフェイスを妨害しないし、密度勾配媒体への血液の拡散を避けるためにすぐに遠心分離に進みますをゆっくりと上にこの希釈混合気を層します。
	<ol>
<li>2 に 3 ml の血、14 mL の円錐のポリプロピレン管ですが 4 mL の血液の密度勾配媒体 3 mL を使用してください、14 mL の円錐形ポリプロピレン管および 5 に 15 mL の血液の密度勾配媒体 4 mL を使用してください、50 mL コニカル ポリプロピレン チューブの密度勾配媒体 15 mL を使用しています。</li>
	</ol>
</li>
	<li>20 ° C でブレーキをオフ 1,200 x gで 20 分間の層の混合物を遠心します。 注:以下周囲温度は赤血球および顆粒球による汚染にあります。低速は、CD4 を原因となります+分離プロセスが失敗します。従事して休憩を残して細胞収量が低下します。エアロゾルを防ぐために閉じることができるローターを備えたベンチ トップ遠心分離機を使用します。</li>
	<li>濃縮の CD4 を削除+パスツール ピペットを使用してインターフェイスから細胞層。 注:濃縮細胞層の標準「バフィー コート」cd4 陽性だけではなく白い曇りの細胞のようになります+細胞が存在、これは当然のことながら小さいと見づらい。</li>
	<li>追加 2 %fbs/PBS CD4 に+細胞量 10 mL、2% で 2 回洗いまで FBS/PBS 各洗浄中に 400 x gで 10 分間遠心分離。</li>
	<li>2% でペレットを再懸濁します細胞染色細胞数と生存率を決定する重要な染料 (トリパン ブルー) FBS/PBS とカウント。</li>
	<li>オプションのステップ: 5 x 105 1 ml 中 (FBS の 10% ジメチルスルホキシド) を凍結で 1 x 10 の6セルを再懸濁します。 注:低温保存と融解によっていくつかの表面のマーカーのレベルを改変すること。それは、したがって、非常に重要なすべてのサンプルが一貫して処理されます。分析変数の違いを最小限にするためサンプルは低温保存と本研究における解析のバッチだった。</li>
</ol>2. フローサイトメトリー
<ol><li>融解凍結 CD4+細胞 37 ° C、洗って一度に予め温めておいた媒体 (RPMI 1640 + L-グルタミン 10 %fbs と 1 x ペニシリン-ストレプトマイシン補完) で水バースの迅速に。</li>
	<li>9 mL 400 × gで 5 分間遠心分離媒体にセルを追加し、上清を除去します。</li>
	<li>PBS で 1% ウシ血清アルブミン (BSA) で細胞を再懸濁します (50 μ L) をそれぞれの条件をテストするのには、5 x 10 の5と 1 x 10 の6セルの使用します。</li>
	<li>セルを混ぜて染色バッファー (50 μ L)。 メモ: 華麗な染色バッファーは、これらの染料の固有の化学的性質により同時に使用する 2 つ以上の BV または BUV 汚れデータ分析を妨げる様々 な染色工芸品をできなくなります。鮮やかな染色バッファーの 50 μ L を 1% の 50 μ L に置き換えることが、単一または無染色条件で BSA/PBS。</li>
	<li>(あたりで表 1する「使用量」の列) のセルに抗体を追加し氷上で 30 分間暗闇の中で孵化させなさい。</li>
	<li>1% の 2 回セルを洗浄 BSA/PBS 各洗浄中に 600 x gで 3 分間遠心分離。</li>
	<li>1% で再懸濁します BSA/PBS (400 μ L) と流れ cytometry 取得管への転送。</li>
	<li>渦流れの cytometer でデータを取得する前に優しく細胞。</li>
</ol>3. 流れの Cytometry コントロールとセットアップ
<ol><li>明白な破片や死んだ細胞 (ハイサイド (SSC) の散布面積と低前方散乱 (FSC) エリア イベント)16からリンパ球を分離できるようにフォト ダイオード電圧を設定無染色のサンプルを使用します。単一のステンド グラス サンプルを使用すると、光電子増倍管 (PMT) 電圧ように設定すべてのイベントが検出可能な規模の内で落ちると確信して作っている間バック グラウンド蛍光から蛍光陽性が分かるでしょう。 注:改善すると、PMT 電圧に対して最適な解像度 (「ピーク 2」法19) の最低電圧を見つけるにぼんやりと蛍光ビーズを用いた各 PMT の CV をプロットします。</li>
	<li>キャプチャ ビーズと単一の汚れを使用して補償行列を生成することによりスペクトル重複アカウント。市販補償ビーズ (60 μ L) とネガティブ コントロール ビーズ (60 μ L) を 1% に追加 BSA/PBS (100 μ L) と渦。 注:使用するキャプチャ ビーズは、宿主および使用されている抗体の IgG アイソタイプを一致しなければなりません。補償行列必要があります再計算場合は、タンデムのロット番号染料変更、ロット間の発光スペクトルにおけるかなりの変動を表示できます。</li>
	<li>単一の抗体 (20 μ L) と渦を追加します。</li>
	<li>暗闇のなかで 30 分室温で孵化させなさい。</li>
	<li>200 x gで 10 分間遠心分離し、上澄みを廃棄します。</li>
	<li>1%BSA/PBS で再懸濁します (500 μ L) と渦。</li>
	<li>製造元の指示に従って取得ソフトウェアで指定された補償行列ジェネレーターを使用して流れの cytometer でサンプルを取得します。</li>
	<li>FMO コントロールを使用して、≥4 色16の実験で背景の蛍光性の主要なソースである、染料の流出を考慮しての陽性マーカー蛍光のゲートの配置をご案内します。条件ごとに、ステップ 3 で説明一般的な細胞表面染色プロトコルに従って省略1 つの染色手順からフルオロ (CD45RA は省略すると、ただしライブ/死者の汚れは省略も)。条件ごとに 100,000 のリンパ球を取得します。</li>
	<li>セルの ≤0.5% でゲート陽性を設定します。FMO コントロールの図解例については図 2を参照してください。</li>
</ol>4. データ解析
<ol><li>非常に小さな破片を除外する FSC パラメーターに 5,000 台のしきい値を設定する流れの cytometer の集録ソフトウェアを採用してください。</li>
	<li>停止ゲートを使用して 10,000 の cTfh セルを取得 (CD4+ CD45RA- CXCR5+)。 注:個々 のユーザーは、以上 10,000 のセルを収集できます。この数は、意味のある結果と回収時間を提供するために十分なセルの収集間の妥協だった。</li>
	<li>FSC 領域を使用して/SSC 地域ドット プロット描画しながら破片を除くリンパ球の人口を選択する楕円や多角形ゲートとあからさま死んで細胞 (高い SSC 地域と低 FSC エリア イベント)。</li>
	<li>FSC 領域を使用して/FSC 幅ドット プロット、ポリゴンは描画ゲート (ダブレットがある単一のセルに同じような幅が拡大された領域) のダブレットを排除しながら単一のセルを選択します。</li>
	<li>FSC 領域を使用して CD45RA と生存率マーカー ドット プロット/ライブ、CD45RA を選択長方形のゲートを描く-細胞 (このマーカーの低蛍光細胞)。</li>
	<li>FSC 領域を使用して/CD4 ドット プロット、CD4 を選択長方形のゲートを描く+のセル (このマーカーの高い蛍光セル)。</li>
	<li>CD4 を使用して CXCR5 ドット プロット/CXCR5 を選択長方形のゲートを描く (このマーカーの高い蛍光細胞) 細胞の+ (すなわち、cTfh)。</li>
	<li>使用して、CXCR3/CCR6 ドット プロット、クワッドはゲートに cTfh1、cTfh セルを分割する 2 と 17 細胞 (高低各マーカーは、細胞)。 注:+ CXCR5 CD4 表現型と細胞+ CXCR3+ CCR6+は悪いが特徴します。我々 は cTfh1/1718としてこれらのセルを参照従来ヘルパー T 細胞 (CD4+ CXCR5-) CXCR3 の th17 細胞と th1 細胞の表示式と CCR6 の間の移行は、cTfh1/1719として記載されています。</li>
	<li>範囲ツールを使用して cTfh セルを分割 PD 1 ヒストグラムを使用して (または、個々 の cTfh1 2、17 または 1/17 のサブセットが好ましい場合) PD 1 に-/+またはこんにちは個体群。 注:PD 1+と PD 1こんにちは間の区別は文献で定義されています。しきい値は、同じ抗体パネルとフローサイトメトリーを用いたヒト扁桃リンパ球懸濁液の正真正銘の Tfh を検出するために必要な同じ PD 1 強度として設定されました。また、PD1こんにちはセルだけはアイコス+、ICOS のマーカーを抗体パネルに追加できます。</li>
</ol>

<ol><li>Vinuesa, C. G., Linterman, M. A., Yu, D., MacLennan, I. C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+Helper+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Follicular Helper T Cells.</a> Annual Review of Immunology. 34 (1), 335-368 (2016).</li>
<li>Nurieva, R. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl6+Mediates+the+Development+of+T+Follicular+Helper+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bcl6 Mediates the Development of T Follicular Helper Cells.</a> Science. 325 (5943), New York, N.Y. 1001-1005 (2009).</li>
<li>Breitfeld, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+B+Helper+T+Cells+Express+Cxc+Chemokine+Receptor+5%2C+Localize+to+B+Cell+Follicles%2C+and+Support+Immunoglobulin+Production%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Follicular B Helper T Cells Express Cxc Chemokine Receptor 5, Localize to B Cell Follicles, and Support Immunoglobulin Production.</a> The Journal of Experimental Medicine. 192 (11), 1545-1552 (2000).</li>
<li>Linterman, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+helper+T+cells+are+required+for+systemic+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Follicular helper T cells are required for systemic autoimmunity.</a> The Journal of Experimental Medicine. 206 (3), 561-576 (2009).</li>
<li>Bindea, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+Dynamics+of+Intratumoral+Immune+Cells+Reveal+the+Immune+Landscape+in+Human+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal Dynamics of Intratumoral Immune Cells Reveal the Immune Landscape in Human Cancer.</a> Immunity. 39 (4), 782-795 (2013).</li>
<li>Gu-Trantien, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2B+follicular+helper+T+cell+infiltration+predicts+breast+cancer+survival%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">CD4+ follicular helper T cell infiltration predicts breast cancer survival.</a> The Journal of Clinical Investigation. 123 (7), 2873-2892 (2013).</li>
<li>Amé-Thomas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+intratumoral+follicular+helper+T+cells+in+follicular+lymphoma%3A+role+in+the+survival+of+malignant+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Characterization of intratumoral follicular helper T cells in follicular lymphoma: role in the survival of malignant B cells.</a> Leukemia. 26 (5), 1053-1063 (2012).</li>
<li>Bossaller, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ICOS+Deficiency+Is+Associated+with+a+Severe+Reduction+of+CXCR5%2BCD4+Germinal+Center+Th+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">ICOS Deficiency Is Associated with a Severe Reduction of CXCR5+CD4 Germinal Center Th Cells.</a> The Journal of Immunology. 177 (7), 4927-4932 (2006).</li>
<li>Morita, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Blood+CXCR5%2BCD4%2B+T+Cells+Are+Counterparts+of+T+Follicular+Cells+and+Contain+Specific+Subsets+that+Differentially+Support+Antibody+Secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Human Blood CXCR5+CD4+ T Cells Are Counterparts of T Follicular Cells and Contain Specific Subsets that Differentially Support Antibody Secretion.</a> Immunity. 34 (1), 108-121 (2011).</li>
<li>Locci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+circulating+PD-1%2BCXCR3-CXCR5%2B+memory+Tfh+cells+are+highly+functional+and+correlate+with+broadly+neutralizing+HIV+antibody+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Human circulating PD-1+CXCR3-CXCR5+ memory Tfh cells are highly functional and correlate with broadly neutralizing HIV antibody responses.</a> Immunity. 39 (4), 758-769 (2013).</li>
<li>He, J., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24138884">Circulating Precursor CCR7loPD-1hi CXCR5+ CD4+ T Cells Indicate Tfh Cell Activity and Promote Antibody Responses upon Antigen Reexposure.</a> Immunity. 39 (4), 770-781 (2013).</li>
<li>Schmitt, N., Bentebibel, S. -E., Ueno, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotype+and+functions+of+memory+Tfh+cells+in+human+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Phenotype and functions of memory Tfh cells in human blood.</a> Trends in Immunology. 35 (9), 436-442 (2014).</li>
<li>Simpson, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+circulating+T+cells+resembling+follicular+helper+T+cells+is+a+fixed+phenotype+that+identifies+a+subset+of+severe+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+and+Rheumatism%22%5BJournal%5D)">Expansion of circulating T cells resembling follicular helper T cells is a fixed phenotype that identifies a subset of severe systemic lupus erythematosus.</a> Arthritis and Rheumatism. 62 (1), 234-244 (2010).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+frequencies+of+activated+B+cells+and+T+follicular+helper+cells+are+correlated+with+disease+activity+in+patients+with+new-onset+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Immunology%22%5BJournal%5D)">High frequencies of activated B cells and T follicular helper cells are correlated with disease activity in patients with new-onset rheumatoid arthritis.</a> Clinical and Experimental Immunology. 174 (2), 212-220 (2013).</li>
<li>Ueno, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Circulating+T+Follicular+Helper+Cell+Subsets+in+Health+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Human Circulating T Follicular Helper Cell Subsets in Health and Disease.</a> Journal of Clinical Immunology. 36, 34-39 (2016).</li>
<li>Maecker Holden, T., Trotter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+controls%2C+instrument+setup%2C+and+the+determination+of+positivity%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity.</a> Cytometry Part A. 69 (9), 1037-1042 (2006).</li>
<li>Jia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+Function+of+CD4%2B+T+Follicular+Helper+%28Tfh%29+Cells+Associated+with+Hepatocellular+Carcinoma+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Impaired Function of CD4+ T Follicular Helper (Tfh) Cells Associated with Hepatocellular Carcinoma Progression.</a> PLOS ONE. 10 (2), 0117458(2015).</li>
<li>Byford, E. T., Carr, M., Ladikou, E., Ahearne, M. J., Wagner, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+Tfh1+%28cTfh1%29+cell+numbers+and+PD1+expression+are+elevated+in+low-grade+B-cell+non-Hodgkin%27s+lymphoma+and+cTfh+gene+expression+is+perturbed+in+marginal+zone+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Circulating Tfh1 (cTfh1) cell numbers and PD1 expression are elevated in low-grade B-cell non-Hodgkin's lymphoma and cTfh gene expression is perturbed in marginal zone lymphoma.</a> PLOS ONE. 13 (1), 0190468(2018).</li>
<li>Annunziato, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+and+functional+features+of+human+Th17+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Phenotypic and functional features of human Th17 cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 204 (8), 1849-1861 (2007).</li>
<li>Duan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotype+and+function+of+CXCR5%2BCD45RA-CD4%2B+T+cells+were+altered+in+HBV-related+hepatocellular+carcinoma+and+elevated+serum+CXCL13+predicted+better+prognosis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Phenotype and function of CXCR5+CD45RA-CD4+ T cells were altered in HBV-related hepatocellular carcinoma and elevated serum CXCL13 predicted better prognosis.</a> Oncotarget. 6 (42), 44239-44253 (2015).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+CXCR5%2BCD4%2Bhelper+T+cells+in+systemic+lupus+erythematosus+patients+share+phenotypic+properties+with+germinal+center+follicular+helper+T+cells+and+promote+antibody+production%5BTitle%5D)+AND+%22Lupus%22%5BJournal%5D)">Circulating CXCR5+CD4+helper T cells in systemic lupus erythematosus patients share phenotypic properties with germinal center follicular helper T cells and promote antibody production.</a> Lupus. 24 (9), 909-917 (2015).</li>
<li>Sage, P. T., Francisco, L. M., Carman, C. V., Sharpe, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+receptor+PD-1+controls+follicular+regulatory+T+cells+in+the+lymph+nodes+and+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">The receptor PD-1 controls follicular regulatory T cells in the lymph nodes and blood.</a> Nature Immunology. 14 (2), 152-161 (2013).</li>
<li>Sage, P. T., Alvarez, D., Godec, J., von Andrian, U. H., Sharpe, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+T+follicular+regulatory+and+helper+cells+have+memory-like+properties%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Circulating T follicular regulatory and helper cells have memory-like properties.</a> The Journal of Clinical Investigation. 124 (12), 5191-5204 (2014).</li>
<li>Sage, P. T., Tan, C. L., Freeman, G. J., Haigis, M., Sharpe, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+TFH+Cell+Function+and+Increased+TFR+Cells+Contribute+to+Defective+Antibody+Production+in+Aging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Defective TFH Cell Function and Increased TFR Cells Contribute to Defective Antibody Production in Aging.</a> Cell Reports. 12 (2), 163-171 (2015).</li>
<li>Yu, N., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22752562">CD4+CD25+CD127low/- T Cells: A More Specific Treg Population in Human Peripheral Blood.</a> Inflammation. 35 (6), 1773-1780 (2012).</li>
</ol>

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このプロトコルでは、これまで文献で識別されるすべての関連するサブセットの検出の有効化、末梢血 cTfh 細胞を分析するシンプルかつ効率的な方法を表します。標準的な外来患者診療所やシリアルのサンプルの一部は、臨床データと並行して集めることができるよう、血液サンプルを簡単に効率的に入手できます。ターンでは、これにより病気の進行や治療への反応のバイオ マーカーとしての cTfh のサブセットを評価する前向き研究であります。これらの研究は、Tfh 不全、自己免疫などしっかりと血液の癌の特定の種類の病態に関与しているどこの病気で特に正当化されるでしょう。さらに、唯一セル表面のマーカーは、このプロトコルで使用されるので、フローサイトメトリーを用いた cTfh 細胞を並べ替えて病における cTfh 機能の変化を調査できます。MZL 患者の cTfh セルを並べ替え健常者21と比較した場合の発現遺伝子の違いを見つけることができました。
我々 が見つかりましたその効率的な CD4+ T 細胞分離改善データ分析。遠心ブレーキやスピー...

卵胞 T のヘルパー細胞 (Tfh) は、CD4+リンパ組織1で最初に特徴付けられた T 細胞サブセット。これらの細胞は、PD 1 と CXCR5 表面の受容器を表現、イリノイ 21 と IL-4 を分泌し、BCL 62,3転写因子の核の式を表示します。その名の通り、彼らは胚中心で発見され、1高親和性抗体の生産に欠かせない。
調節不全 Tfh の応答は、病気の発症、4自己反応性 B 細胞の拡大を促進する最も顕著な自己免疫疾患に関与しています。彼らはまた、固体5,6のリンパがん7腫瘍微小環境における役割を果たします。逆に、表面タンパク質 Tfh の必須の遺伝的欠陥は、ひと免疫不全症候群8誘導性 T 細胞 costimulator (アイコス) 結果など機能します。CD4+ CXCR5+ひと末梢血細胞濾胞 T のヘルパー細胞 (cTfh) と呼ばれている、Tfh 細胞組織9のメモリ実装部と考えられています。ここで説明したメソッドの目的は次の CD4 cTfh サブセットの解析+細胞の末梢血から分離。
いくつかの cTfh のサブセットが定義され、彼らが B 細胞の助けを提供効率は異なります 1 つのサブセット別9,10、11,12。これらのサブセットの相対的な割合は、そこでほとんどの目立つように自己免疫疾患がより機能的な PD 1 の相対的な増加ではほとんど常に、病気の数で変更されます+ こんにちは以下と比較して cTfh2 または cTfh17 のサブセットおよび/または機能的な PD-1-および cTfh1 サブセット12。これらの変更の程度は頻繁 cTfh サブセット分布の Tfh のアクティビティを反映可能性があります病気の予後バイオ マーカーとしての潜在的な役割を示す、疾患活動と自己抗体の抗体価を含む臨床パラメーターに関連付けるリンパ組織9,12,13,14。また、参加者からの血液採取は迅速、安全かつ許容できのでシリアル病気の進行や治療への反応の分析のための監視します。
孤立した CD4 の使用伝統的な末梢血単核細胞 (マーカー) 懸濁液上+ T 細胞 cTfh 細胞解析のための相当な数を取得する必要な時間を減らすことによってより高いスループット流れ cytometry 実験を有効にします。これは、セル (FACS) を並べ替え並べ替えの流れを使用して珍しい cTfh サブセットからセルをアクティブになったときに特に便利です。効率化を支援するために""流れの cytometry の実験で使用されるサンプルのバッチ処理を有効にするこれらの懸濁液を凍結保存することができます。テスト、CD4 の+純度は凍結によって減少されていません。
シュミットら12,によって提案されている細胞表面マーカーの 2 つのグループの統一された方式を使用して彼らの発見方法の初期の段階で cTfh 細胞を分類する使用される別の所の別のマーカーはここで紹介中15 cTfh と単一フローサイトメトリーでその 9 認識されたサブセットの同時識別を有効にするのに実験します。
唯一セル表面のマーカーを使用すると、セル固定や透過、不要、したがって下流の機能研究のため生きている残ることができます。FACS を用いた同じ抗体パネルを並べ替え] セルで、これを促進する可能性があります。このパネルは、使用されている流れの cytometer の制限を可能にする他のマーカーを含むように拡張可能性があります。
マルチカラー フロー フローサイトメトリー実験の分析は特に細胞集団が蛍光マーカーとしての明確なバイモーダル分布を持っていない場合, 2次元ドット プロットにゲーティングの本質的に主観的な性質のために挑戦することができます、cTfh 細胞およびそのサブセット用ケース。このため、人口のより良い解決を有効にして自信を持って戦略をゲートを設定する工芸品を減らすために効果的なコントロールを設定することが不可欠です。抗体パネル デザインとフローサイトメトリー用の基本的なコントロールのセットアップ実験、すなわち、補正し FMO コントロールのステップ 3.4.2 および 3.4.3,respectively のとおり。
CTfh のすべてのセルが CD4 として定義されている+ CXCR5+ CD45RA-。特性の Tfh 活性化マーカー PD 1 の表現のレベルは、PD 1-、PD 1+または PD 1こんにちはcTfh セルのサブセットを識別するために決定できます。その後、CCR6 と CXCR3 ケモカイン受容体の組み合わせを使用して、伝統的な Th1、2 または 17 細胞、cTfh によって発現するとして特徴付けられる cTfh1、2 または CXCR3 のプロフィールによって 17 のような+ CCR6-、CXCR3- CCR6-と CXCR3- CCR6+、それぞれ。
私たちの研究室で使用される抗体パネルは、表 1に表示されます。ユーザーは、彼らのローカル流れの cytometer 上使用可能なレーザーと光フィルター構成を考慮して、fluorophore 選択を適応させる必要があります。
次の考慮事項 fluorophores の選択に影響します。できるだけ明るい蛍光物質を使用します。特に、明度 (それほど高い表現) マーカーの最も明るい利用できる蛍光物質を使用します。PD 1、CXCR3 CCR6 などの調光器のマーカーとより少ない程度に、CXCR5。具体的には新しい BB、BV、BUV 使用してフルオロ優れた輝度を提供し、こうして細胞の異なる集団の簡単に解像度を有効にします。
発光スペクトルの重複そしてこうして必要な補償のレベルを最小限に抑えるため可能な限り分散 fluorophore 選択。流れ cytometry パネルの設計を支援するために使用することができます無料、フリー、オンライン ツールをここで見つけることができます: http://www.bdbioscienes.com/us/s/spectrumviewer。発光スペクトルの領域を節約する両方の死者の検出 (および除外) 有効にする APC h7 (CD45RA に共役) と重なる部分発光波長性色素を用いた「ダンプ チャンネル」を採用または CD45RA+を使用して、単一の検出器。
ここでは、異なると最近記述されているサブセットを循環の割合を決定するためのフローサイトメトリーによる末梢血 CD4+ T 細胞の分離とその後の分析のためのプロトコルが表示されます。

<table><tbody><tr><td>RosetteSep Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>15062</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17144003</td><td></td></tr><tr><td>BUV395 Mouse Anti-Human CD183&nbsp;クローン1C6/CXCR3</td><td>BDホライゾン</td><td>565223</td><td></td></tr><tr><td>BV711マウス対ヒトCD196(CCR6)&nbsp;クローン11A9</td><td>BDホライゾン</td><td>563923</td><td></td></tr><tr><td>BV421ラット反ヒトCXCR5(CD185)&nbsp;クローン&nbsp;RF8B2</td><td>BD Horizon</td><td>562747</td><td></td></tr><tr><td>BB515 マウス対ヒトCD4&nbsp;クローン &nbsp;RPA-T4</td><td>BD Horizon</td><td>564419</td><td></td></tr><tr><td>PEマウス 対ヒトCD279&nbsp;クローン MIH4</td><td>BD Pharmingen</td><td>557946</td><td></td></tr><tr><td>APC-H7 マウス 抗ヒト CD45RA クローン&nbsp;HI100</td><td>BD Pharmingen</td><td>560674</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD 固定可能な遠赤色デッドセル染色キット、633または635 nm励起用</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>L34973</td><td></td></tr><tr><td>ブリリアント染色バッファー</td><td>BD Horizon</td><td>563794</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse Ig, &kappa;/Negative Control Compensation Particles Set</td><td>BD CompBead</td><td>552843</td><td></td></tr><tr><td>FACS Aria II Flow Cytometer</td><td>BDBiosciences</td><td>644832</td><td></td></tr><tr><td>FACSDiva 6.1.3</td><td>BD Biosciences</td><td>643629</td><td>Flow Cytometer 取得ソフトウェア</td></tr><tr><td>FlowJo 10.2</td><td>Treestar Inc.</td><td></td><td>フローサイトメトリーデータ解析ソフトウェア</td></tr><tr><td>抗CXCR3抗体</td><td>BD Horizon&nbsp;</td><td></td><td></td>565223</tr>抗<tr><td>CCR6抗体</td>BD<td>ホライゾン&nbsp;</td><td></td><td></td>563923</tr>抗<tr><td>CXCR5抗体</td><td>BDホライゾン&nbsp;</td><td></td><td></td>562747</tr><tr><td>抗CD4抗体</td><td>BDホライゾン&nbsp;</td><td></td><td></td>564419</tr><tr><td>抗PD-1抗体</td><td>BDファーミンゲン&nbsp;</td><td></td><td></td>557946</tr>抗<tr><td>CD45RA抗体</td><td>BDファーミンゲン&nbsp;</td><td></td><td></td>560674</tr><tr><td>生存率マーカー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>L34973</td><td></td></tr></tbody></table>

cd4 の分離+ t 細胞および循環の解析 t 濾胞ヘルパー (ctfh) 末梢血を使用して 6 色フローサイトメトリーから細胞のサブセット

Isolation of CD4+ T-cells and Analysis of Circulating T-follicular Helper (cTfh) Cell Subsets from Peripheral Blood Using 6-color Flow Cytometry

異常 T 濾胞ヘルパー (Tfh) 細胞活性は自己免疫の条件の検出と B 細胞非ホジキン リンパ腫のリンパ節微小環境を分析するとき、彼らの存在は臨床結果と関連付けられました。循環 T 濾胞ヘルパー細胞 (cTfh)、Tfh 細胞、血液中の循環メモリ コンパートメントのサブセットが病気で混乱も、したがって、潜在的な新規予測バイオ マーカーを表します。末梢血でのテストは、比較的非侵襲的な単純なシリアルを監視できますので便利です。CD4 を分離する方法について説明します+ T 細胞人間の血液さらに cTfh 細胞としてのさまざまなサブセットの割合を列挙するフローサイトメトリーによる解析から (cTfhPD 1-/+ こんにちは、cTfh1、2、17、cTfh1/17)。これらのサブセットのレベルは、リンパ腫と健常者と患者間比較しました。メソッドが定期的に集められた患者材料から信頼性の高い結果を得るに十分な堅牢なことがわかった。分析について述べる技術は、細胞選別と RT-PCR などダウン ストリーム アプリケーションを簡単に適合できます。

高い CD4+純度は、CD4 を使用して達成された+隔離のプロトコルは、すべての血液サンプルの間で信頼性があったが私たちによってテスト (意味: 96.6%、SD: 2.38、n = 31) (図 3)。
CTfh の同定 (CD4+ CXCR5+細胞) 代表的な健常者では提案する (図 4A)。CD4 内合計 cTfh 細胞の割合+細胞が 29.4% の中央値 (四分範囲 (IQR) = 10.8) 12 健常者の間で。リウマチ性関節炎11,14、全身性紅斑性<sup class="xr...

ここでは、分離と CD4 のキャラクタリゼーションのためのプロトコル+ T 細胞サブセットひと末梢血からの説明。CD4 精製+ T 細胞は濾胞 T のヘルパー細胞のサブセットの割合を決定するためのフローサイトメトリーで分析しました。

CD4 の分離+ T 細胞および循環の解析 T 濾胞ヘルパー (cTfh) 末梢血を使用して 6 色フローサイトメトリーから細胞のサブセット

Aberrant T-follicular helper (Tfh) cell activity is detectable in autoimmune conditions and their presence is associated with clinical outcomes when the ...

この方法は、健康な状態と病気の状態で循環T濾胞ヘルパー細胞サブセットの違いを実証するのに役立ちます。この手法の主な利点は、高速でサンプルをバッチ処理できること、および下流の機能分析のためにセルが生き続ける点です。この技術は、疾患進行のバイオマーカーとして循環T-濾胞ヘルパーサブセットの評価を促進し、臨床的重症度のマーカーと相関する。この手順のデモンストレーションを手伝うのが博士ルチア・パイです

isolation-cd4-t-cells-analysis-circulating-t-follicular-helper-ctfh

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

このビデオは、ヒト末梢血単核細胞(PBMC)からのCD4+Vδ1+γδT細胞の低濃度集団の磁気標識ベースの単離のためのプロトコルを示しています。FITC標識抗Vδ1抗体、磁気抗FITCマイクロビーズ、および抗CD4抗体被覆超常磁性ビーズの組み合わせを使用して、CD4+Vδ1+...

ヒト末梢血単核細胞からのCD4+ Vδ1+ γδ T細胞の選択的単離

このビデオでは、2つの蛍光色素を使用して、ヒト末梢血単核細胞(PBMC)のCD4+およびCD8+...

末梢血単核細胞中の免疫細胞サブセットを同定するためのフローサイトメトリーアッセイ

他のT細胞サブセットとは異なるエフェクター機能を持つ、Th17細胞は、中央炎症性自己免疫に関与している。このインビトロのTh17分化プロトコルは、ナイーブCD4 + Tリンパ球は、Th17細胞に分化することができ、さらに自己免疫および宿主応答におけるそれらの役割を検討するかどうかを決定するための手段を提供する。...

離とナイーブCD4 Tリンパ球のTh17分化

このプロトコルは、高感度の細胞ベースの細胞毒性アッセイについて説明しています。このアッセイは、エフェクターCD8+ T細胞の数が増加している場合の生標的CD4+ T細胞の頻度の減少を列挙することにより、抗原特異的CD8+...

細胞毒性活性を測定するための細胞ベースのフローサイトメトリーアッセイ

多くの実験系は、免疫応答におけるT細胞の発達および機能を調節するメカニズムを理解するために利用されています。ここではレトロウイルス形質導入を用いた遺伝子アプローチは、調節経路を同定することに、経済的、時間効率的な、そして最も重要なのは、非常に有益である、記載されています。...

遺伝的分化を制御するメカニズムを研究するためのアプローチと機能などのヘルパーT細胞のレトロウイルス形質導入

この記事では、スペクトルサイトメトリー、蛍光色素を区別するために、発光スペクトルの形状を使用するフローサイトメトリーでの新しいアプローチを説明します。このアルゴリズムは、補償を置き換え、独立したパラメータとして自家蛍光を扱うことができます。この新しいアプローチは、固形臓器から単離された細胞の適切な分析が可能になります。...

スペクトラルフローサイトメトリーにより固形組織から単離された細胞懸濁液の分析

ここでは、CD4 を識別するためにフロー フローサイトメトリーによるプロトコルを提案+および CD8+ T 細胞、γδ T 細胞、B 細胞、NK 細胞、7 つではなく 2 つだけ螢を用いたひと末梢血単球。このアプローチでは、5 つの追加のマーカーはほとんど流れの cytometers...

7 免疫細胞サブセット 2 螢光色素の差別フローサイトメトリー

ここで提示される、色素希釈を用いた抗原タンパク質またはペプチドに応答して増殖CD4+T細胞を測定するためのプロトコルである。このアッセイは、特に希少な抗原特異的T細胞に対して感受性があり、抗原特異的細胞のクローニングを容易にするために改変することができる。...

カルボキシフルオレスチンスクシニミジルエステルを用いたヒト抗原特異的CD4+T細胞の増殖の定量化

本プロトコルは、前処理された腫瘍細胞との同種共培養システムにおけるヒトT細胞刺激の ex vivo...

前処理腫瘍細胞の同種共培養環境におけるヒトT細胞活性の解析

ミルテニーMACのキットを用いてリンパ球の分離は、全体のリンパ組織のホモジネートから細胞を浄化するために信頼性の高い方法です。国内でのみ有効のシステムを使用して精製した細胞は通常、≥96パーセント純粋です。ここで、我々は、CD4 +...

CD4 +ミルテニーMACS精製を使用してマウスのリンパ節からT細胞の分離

学ぶフローサイトメトリーによる末梢血由来CD4+T細胞および循環T濾胞ヘルパー細胞サブセットの分離・解析法。高速バッチ処理で細胞生存性を維持し、疾患バイオマーカー評価に応用可能です。

CD4 の分離⁺ T 細胞および循環の解析 T 濾胞ヘルパー (cTfh) 末梢血を使用して 6 色フローサイトメトリーから細胞のサブセット

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