Name: 逆にジカと尿、血清、蚊のサンプルでハウスキーピング遺伝子の転写-ループ - Lamp 法 (RT ランプ) アッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: 学ぶジカウイルス検出のRT-LAMP法。尿・血清・蚊サンプルから約30分で迅速診断可能で、RNA抽出不要の簡便な手法です。妊婦や蚊媒介監視に有用なウイルス学的手法を習得できます。

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この作品は、モーリーンとロナルド ・ ハーシュ家族の慈善的貢献とフィールド神経科学研究所、ミシガン州の聖マリアによって支持されました。資金提供者には、研究デザイン、データ収集と分析、意思決定を発行し、または原稿の準備の役割はなかった。我々 はまた、彼らの重要な原稿のレビュー博士ベルナデット Zwaans とエリヤ病棟をありがとうございます。

ここで説明したすべてのメソッドは、ボーモント厚生制度レビュー委員会 (IRB) によって承認されています。関連するガイドラインと規制に従ってすべての実験を行った。
注意: 個人用保護具の使用を含むバイオ セーフティ レベル 2 標準によるとすべての可能性のある感染性物質を処理必要があります。バイオ セーフティ キャビネットにおけるエアロゾルを作り出すかもしれないプロシージャを行わなければなりません。さらに、ライブの蚊との仕事は、適切な節足動物封じ込めレベル 1-3 施設で行わなければなりません。ZIKV 先天性異常症の協会を与えられた、またはこれらの女性のパートナーの妊娠している女性、妊娠しようとしている必要がありますを大幅に削減 ZIKV への実験室の露出。ZIKV サンプルの輸送はカテゴリ B の生物学的物質に従って部門の輸送有害材料規則としてアメリカ合衆国に分類する (49 CFR Part 171-180) に従う必要がありますしたがってサンプルを出荷し、ガイドライン。ZIKV 米国 biospecimens へのインポートでは、疾病管理・予防 (CDC) 輸入許可センターが必要です。彼らが感染していない場合でも、アメリカ合衆国農務省 (USDA) が必要です ZIKV 伝送のためのベクトルとして役立つことができる節足動物のインポートを許可します。この情報は出版時点現在です。最新の推奨事項は、https://www.cdc.gov/zika/laboratories/lab-safety.html で見つけることが。
注: 実験計画で講じる必要がありますので、RT ランプ反応、偽陽性反応の率が高いしやすい。指定されたピペットおよびフィルターのヒントは、すべてのセットアップと RT ランプ反応の実行を使用してください。理想的には、横の作業の流れを確立する必要があります。可能であれば、汚染を防ぐために囲まれた部屋で、解析と画像処理 (セクション 5) が発生します。RT ランプ製品を含むテスト管の開口部は、最小限に抑える必要があります。
1. RT ランプ プライマーの準備
<ol><li>分子グレード水最終濃度 100 μ M (表 1) に各凍結乾燥 RT ランプ プライマーを再構築します。簡単に渦同種のソリューションを確保し、すべてのプライマー ソリューションを収集するテーブル トップ遠心分離機で最大速度でソリューションを簡単にスピンするプライマー ソリューション。</li>
	<li>準備、10 x のボリュームを使用して表 2FIP、BIP、F3、B3、LF、LB のプライマーの RT ランプ プライマー ミックス。簡単に渦同種のソリューションを確保して簡単に任意の損失を避けるためにテーブル トップ遠心分離機で最大速度でソリューションをスピンダウンするプライマー ソリューション。 注: Ae。 ネッタイシマカアクチン (AEDAE) の RT ランプ プライマーが LB プライマーを含まれていない (ループ プライマーは常に RT ランプ反応に必要な)。この場合、LB プライマー ボリュームを分子グレード水に置き換えます。</li>
	<li>-20 ° c に使用するプライマーを格納し、無料の融解を避けてください。</li>
</ol>2. サンプル準備
<ol><li>
尿サンプルの:防腐剤で新鮮な尿、凍結尿尿のいずれかを使用します。新鮮なまたは冷凍サンプル: すぐに 700 x gで 10 分間のコレクションの後、サンプルをスピン上清を使用しての分析や将来の使用に備えて-80 ° C で凍結します。使用する前に氷の上凍結試料を解凍します。</li>
	<li>
ひと血清サンプルの:いずれかの新鮮なまたは冷凍の血清サンプルを使用します。</li>
	<li>
ZIKV の感染細胞株: エアコン メディアまたはセル lysates のいずれかを使用します。 注: セル無料 Ae からメディアを完備しました。ヒトスジシマカ C6/36 セル 8 日感染後は、ZIKV RT ランプ反応のポジティブ コントロールとして使用できます。</li>
	<li>
Ae。 ネッタイシマカ蚊:いずれかの全体の新鮮なまたは冷凍の蚊の死体を使用。氷の上の凍結の蚊を解凍します。リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) の 100 μ L で個々 の蚊を配置することによって粗蚊 lysate を準備し、P10 ピペット先端部 (図 1) で 10 回蚊の粉砕による均質化。簡単に任意の残骸をペレットに lysate の原油を遠心分離機します。下流の RT ランプ解析の上澄みを使用します。 注: ポジティブ コントロールによって生成できる実験室の設定で約 103ゲノム相当量 200 でウイルスによる胸腔内マイクロインジェクションのメスの蚊を感染 nL と蚊に 5 日間を収穫感染後。</li>
</ol>3. RT ランプ マスター ミックスを調製します。
<ol><li>氷の上の RT ランプ マスター ミックス反応を表 3にボリューム ガイドを使用して、使用する各プライマーに備えます。 注: 使用不耐熱ウラシル DNA グリコシラーゼ (UDG) の誤検知を防止に役立ちます。</li>
	<li>、すべてのサンプルが混ぜように簡潔に渦、スピン ・ ダウン簡単にボリュームの損失を防ぐために。</li>
</ol>4. RT ランプ アッセイ
<ol><li>
ピペット 23.0 μ L あたり 200 μ L の PCR チューブに反応 RT ランプ マスターの組合せの。サンプル (尿、血清、または手順 2 に記載されている粗蚊ライセート清) の 2.0 μ L を追加します。これは RT ランプ反応あたり 25.0 μ L に総量をもたらすでしょう。否定的な制御分子グレードの水を使用します。肯定的な制御が含まれます。 注: 感染した細胞株の培養上清から PCR 標準またはウイルス株は、肯定的な制御として使用できます。<ol>
<li>オプション: デング ウイルス (DENV) など関連アルボ ウイルスの特異性制御反応が含まれます。サンプルの種類に応じて手順 2 で説明したように、サンプルを準備します。200 μ L の PCR チューブに RT ランプ マスター ミックスの 23.0 μ L に特異性制御の 2.0 μ L を追加します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ヒート ブロック、水浴、またはたちを使用して 30 分の 61 ° C で試料を加熱します。</li>
	<li>熱は 80 ° C 10 分の加熱によりポリメラーゼを非アクティブ化します。</li>
</ol>5. RT ランプ解析
注: 独立した密閉空間で RT ランプ解析を実行します。
<ol><li>
、孵化後 RT ランプ反応の色の変化の有無を見ることによって視覚的にアクセスします。
	<ol>
<li>蛍光核酸色素 1:10 (40 mM 20 mM 酢酸トリス 1 mM EDTA) TAE バッファーで希釈します。 注意: 任意の核酸染色核酸に結合し、したがっては発癌物質。処理するときは、手袋を着用します。</li>
		<li>12 μ RT ランプ反応、蛍光核酸色素希釈法の 2 μ L を追加します。 注: 否定的な反応の色でオレンジ色になります、陽性反応は黄/緑の色になります。</li>
		<li>省略可能: は、カメラを使用して、白地に RT ランプ反応の写真を撮る。</li>
	</ol>
</li>
	<li>302 nm UV の下でサンプル配置光蛍光による RT ランプ製品の存在を確認します。カメラを使用して結果の写真を撮る。 メモ: RT ランプを肯定的な反応には蛍光出力があります。 注意: は、紫外線を作業時に UV 保護目のグーグルや顔のシールドを着用します。</li>
	<li>
省略可能: サンプルの電気泳動の実行によって RT ランプ製品の存在を確認します。
	<ol>
<li>可視化のための核酸染色で 1 x TAE バッファーの 2% の agarose のゲルを注ぐ。 注意: 任意の核酸染色核酸に結合し、したがっては発癌物質。処理するときは、手袋を着用します。</li>
		<li>分子量を比較する最初の車線に DNA の梯子の 5 μ L を追加します。</li>
		<li>各 RT ランプ反応の DNA のローディングの染料の 2 μ L で 13 μ RT ランプ反応混合物を混ぜます。ローディングの染料の DNA を含んでいる 15 μ L の混合物をロードします。</li>
		<li>302 nm の紫外光を用いたゲル 90 V 90 分またはバンドを分離するまでのイメージを実行します。 メモ: 肯定的な RT ランプ反応では、ラダリング パターンがあります。RT ランプの否定的な反応は、任意のバンドを含めないでください。</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. ゴ ミ処理
<ol><li>二重密封された袋に RT ランプ反応の処分します。これは、将来的に偽陽性反応につながる RT ランプ製品をイアントが、オートクレーブ滅菌を行います。</li>
</ol>

<ol><li>Petersen, L. R., Jamieson, D. J., Powers, A. M., Honein, M. A. <a target="_blank" href="https://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMra1602113">Zika Virus.</a> New England Journal of Medicine. 374 (16), 1552-1563 (2016).</li>
<li>Francois, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robustness+of+a+loop-mediated+isothermal+amplification+reaction+for+diagnostic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Federation+of+European+Microbiological+Societies+Immunology+and+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Robustness of a loop-mediated isothermal amplification reaction for diagnostic applications.</a> Federation of European Microbiological Societies Immunology and Medical Microbiology. 62 (1), 41-48 (2011).</li>
<li>Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop-mediated+isothermal+amplification+%28LAMP%29+of+gene+sequences+and+simple+visual+detection+of+products%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products.</a> Nature Protocols. 3 (5), 877-882 (2008).</li>
<li>Gandasegui, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rapid-Heat+LAMPellet+Method%3A+A+Potential+Diagnostic+Method+for+Human+Urogenital+Schistosomiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Library+of+Science+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">The Rapid-Heat LAMPellet Method: A Potential Diagnostic Method for Human Urogenital Schistosomiasis.</a> Public Library of Science Neglected Tropical Diseases. 9 (7), 0003963(2015).</li>
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<li>Lamb, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Detection+of+Zika+Virus+in+Urine+Samples+and+Infected+Mosquitos+by+Reverse+Transcription-Loop-Mediated+Isothermal+Amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Rapid Detection of Zika Virus in Urine Samples and Infected Mosquitos by Reverse Transcription-Loop-Mediated Isothermal Amplification.</a> Scientific Reports. 8 (1), 3803(2018).</li>
<li>Faye, O., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18674965">One-step RT-PCR for detection of Zika virus.</a> Journal of Clinical Virology. 43 (1), 96-101 (2008).</li>
<li>Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR+inhibitors+-+occurrence%2C+properties+and+removal%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">PCR inhibitors - occurrence, properties and removal.</a> Journal of Applied Microbiology. 113 (5), 1014-1026 (2012).</li>
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<li>Chan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+Affordable+and+Portable+Medium-Throughput+Molecular+Device+for+Zika+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Rapid, Affordable and Portable Medium-Throughput Molecular Device for Zika Virus.</a> Scientific Reports. 6, 38223(2016).</li>
<li>Lee, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+Highly+Sensitive+Molecular+Diagnosis+of+Zika+Virus+by+Lateral+Flow+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Simple and Highly Sensitive Molecular Diagnosis of Zika Virus by Lateral Flow Assays.</a> Analytical Chemistry. 88 (24), 12272-12278 (2016).</li>
<li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-Cost+Detection+of+Zika+Virus+Using+Programmable+Biomolecular+Components%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components.</a> Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).</li>
<li>Song, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Instrument-Free+Point-of-Care+Molecular+Detection+of+Zika+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Instrument-Free Point-of-Care Molecular Detection of Zika Virus.</a> Analytical Chemistry. 88 (14), 7289-7294 (2016).</li>
<li>Yaren, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Point+of+sampling+detection+of+Zika+virus+within+a+multiplexed+kit+capable+of+detecting+dengue+and+chikungunya%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Central+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Point of sampling detection of Zika virus within a multiplexed kit capable of detecting dengue and chikungunya.</a> BioMed Central Infectious Diseases. 17 (1), 293(2017).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+sensitive+detection+of+Zika+virus+by+reverse+transcription+loop-mediated+isothermal+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid and sensitive detection of Zika virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification.</a> Journal of Virological Methods. 238, 86-93 (2016).</li>
<li>Priye, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+smartphone-based+diagnostic+platform+for+rapid+detection+of+Zika%2C+chikungunya%2C+and+dengue+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A smartphone-based diagnostic platform for rapid detection of Zika, chikungunya, and dengue viruses.</a> Scientific Reports. 7, 44778(2017).</li>
</ol>

レルと MBC ジカ ウイルス診断法の知的財産があります。残りの著者は競合する興味を持ってないです。

人間と蚊の両方のサンプル6を使用してこの紙の作品で説明している ZIKV RT ランプの試金。検出限界は約 1 ゲノム等価6、症候性 ZIKV 感染患者の典型的なウイルス負荷は 10 なので十分なする必要があります3  106 Pfu/ml7。さらに、このメソッドは最初の分離する RNA と細胞培養におけるウイルスの増幅なしのサンプル ZIKV を検出できます。時間、コスト、および qRT PCR と比較してこのアッセイの健康上のリスクが大幅に減少します。
RNA 分離なしに行われる RT ランプ反応尿このプロトコルに示された容積比で使用できるようにします。一方、1 つは理論的に RT ランプ反作用で使用されるサンプルの量を高めることができる、このサンプルが尿ケアを行使しなければなりません。尿には、PCR 反応を阻害することができる複数の化学物質が含まれています。尿中の尿素が...

2015 年にジカ (ZIKV) 注目を集めて著名なグローバル懸念の伝染病として妊娠中の感染は、流産、死産、重篤な神経学的な出生時欠損など小頭症、その他先天性にリンクされていたので先天性欠損症1。まれに、ZIKV は、ギランバレー症候群に関連付けられています。ZIKV は主にネッタイシマカ蚊; によって送信されます。しかし、それ1性的接触を通して広げることができます。迅速かつコスト効果の高い検出法の改良の必要性があったことを考えると ZIKV 感染は、ほとんどの人に無症候性または他アルボ1の感染症の症状と重なっている軽度のインフルエンザのような症状を呈する、ローカル蚊の個体数と同様、両方の人々 を画面に ZIKV。
定量的逆転写 PCR (qRT PCR) は ZIKV 検出; のための信頼性の高いアッセイです。ただし、この手法には、高価な特殊な装置、訓練された人員および興味のサンプルからの RNA の隔離が必要です。逆のトランスクリプション ループ lamp 法 (RT ランプ) は鎖と耐熱性 DNA ポリメラーゼの使用により 1 つの孵化の温度を必要なだけ PCR 技術に基づくワンステップ核酸増幅法変位プロパティ。これをたちの必要性を回避して試験を完了に必要な時間の長さを減少させます。RT ランプの付加的な利点は、高い特異性と感度、多くの PCR 阻害剤2への抵抗と温度、pH のレベルの範囲で堅牢性を含めます。比較的低コスト、試薬は室温で安定しています。これらの特徴を考えると、実験室やフィールドで RT ランプが展開できます。そのため、病原体や感染3,4、5の他の種類の範囲を検出するランプ反応が開発されています。本稿で記述されている RT ランプ プロトコルの目的は、ひと血清および尿中サンプルでも RT ランプ経由 30 分以内単一感染した蚊のように RNA の隔離なし ZIKV を検出するためです。実験室外側迅速かつ設定で動作する高感度、迅速な診断ツールである qRT PCR を交換するこのメソッドを使用できます。

<table><tbody><tr><td>Bst 2.0 WarmStart DNA ポリメラーゼ</td><td>New England Biolabs</td><td>M0537S</td><td></td></tr><tr><td>等温増幅バッファー&nbsp;</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>B0537S</td><td></td></tr><tr><td>WarmStart RTx逆転写酵素</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>M0380S</td><td></td></tr><tr><td>南極熱不安定UDG</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>M0372S</td><td></td></tr><tr><td>MgSO<サブ>4</サブ></td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>B1003S</td><td></td></tr><tr><td>100 mM dATPソリューション</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>ズN0440S</td><td>デオキシヌクレオチドセットN0446S</td></tr><tr><td>100 mM dCTP 溶液</td><td>New England Biolabs</td><td>N0441S</td><td>デオキシヌクレオチド セット N0446S</td></tr><tr><td>100 mM dTTP 溶液</td><td>New England Biolabs</td><td>N0443S</td><td>デオキシヌクレオチド セット N0446S</td></tr><tr><td>100 mM dGTP 溶液</td><td>New England Biolabs</td><td>N0442S</td><td>デオキシヌクレオチド セット N0446S</td></tr><tr><td>100 mM dUTP 溶液</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>R0133</td><td></td></tr><tr><td>SYBR グリーン I 核酸ゲル染色</td>剤 <td>Invitrogen</td><td>S7563</td><td></td></tr><tr><td>Nancy-520</td><td>Sigma Aldrich</td><td>01494</td><td></td></tr><tr><td>Low DNA Mass Ladder</td><td>Invitrogen</td><td>10-068-013</td><td></td></tr><tr><td>ジカポジティブコントロール</td><td>Robert Koch Institute, Germany</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1600</td><td></td></tr><tr><td>BlueJuice Gel Loading Buffer</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10816015プライマー</td><td>統合DNA技術</td><td>カスタムオリゴ</td><td></td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー 水</td><td>アンビオン</td><td>AM9938</td><td></td></tr><tr><td>尿防腐剤</td><td>ノルゲン Biotek</td><td>18126</td><td></td></tr><tr><td>ZIKV PCR標準</td><td>ロバートコッホ研究所</td><td>N / A</td><td>ベロE6細胞上清</td></tr><tr><td>DENV2 ニューギニアC制御</td><td>コネチカット州農業実験ステーション</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

逆にジカと尿、血清、蚊のサンプルでハウスキーピング遺伝子の転写-ループ - lamp 法 (rt ランプ) アッセイ

Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) Assay for Zika Virus and Housekeeping Genes in Urine, Serum, and Mosquito Samples

ジカ ウイルス (ZIKV) の感染は成人の無症候性することができます、ただし、妊娠中の感染は流産と重度の神経学的な先天性欠損症に 。このプロトコルの目的は、人間と蚊のサンプルで ZIKV を迅速に検出することです。ZIKV 検出のための現在のゴールド スタンダードは定量的逆転写 PCR (qRT PCR);逆のトランスクリプション ループ lamp 法 (RT ランプ) 高価な機器を必要とせずより効率的かつ低コストにテストのため可能性があります。本研究では RT ランプは最初のサンプルから RNA を隔離することがなく 30 分以内のさまざまな生体試料中の ZIKV 検出に使用されます。この手法は、患者の尿、血清、感染し、感染蚊のサンプル ZIKV を使用して示されています。18 s リボソーム リボ核酸とアクチンは、それぞれ人間と蚊のサンプル内のコントロールとして使用されます。

RT ランプ反応は、3 つの異なる方法を使用して分析できます。まず、蛍光核酸色素の添加、肯定的な反応になりますイエロー/グリーン色で否定的な反応が肉眼で見える色はオレンジが表示されます。第二に、RT ランプ反応を蛍光核酸色素添加結果蛍光信号サンプルが紫外線によって興奮しているとき。否定的な反応は、陰性対照に少量存在する背景の蛍光性の検出可能な蛍光シグナルを持っていないでしょう。最後に、RT ランプ反応は agarose のゲル実行できます。肯定的な否定的な反応には DNA バンドがあるないに対し、RT ランプ反応はバンディング パターンを持っています。これらの解析手法の 3 つすべてを使用してこの例を図 2および3に示します。これらのサンプルのどれもは、RT ランプ前に分離した RNA を持っていた。図 1は、RT ランプの反応で使用のために十分である pbs は、全体蚊の粉砕を示しています。ZIKV RT ランプ反応の...

このプロトコルは、効率的かつ低コスト ジカのウイルスを検出または逆のトランスクリプション ループ lamp 法 (RT ランプ) で人間の尿や血清のサンプルや蚊のターゲットを制御するメソッドを提供します。このメソッドは、RNA の隔離を必要としないし、30 分以内に行うことができます。

逆にジカと尿、血清、蚊のサンプルでハウスキーピング遺伝子の転写-ループ - Lamp 法 (RT ランプ) アッセイ

Infection with Zika virus (ZIKV) can be asymptomatic in adults, however, infection during pregnancy can lead to miscarriage and severe neurological birth ...

この方法は、サンプルにジカウイルスが含まれているかどうかを迅速に判断できます。これは、妊娠中の女性、妊娠しようとしているカップル、またはジカ感染の危険にさらされている地元の蚊集団の監視に役立ちます。この技術の主な利点は、高速で簡単で、高価な機器を必要とせず、RNA分離ステップなしで行うことができることです。妊娠中の感染は流産、死産、その他の重度の先天性神経学的出生時欠損に関連しているため、この技術の意味合いはジカ感染の診断にまで及ぶ。この方法はジカに関する洞察を提供することができますが、ウイルス特異的プライマーを使用してデング熱、チクングニア、またはウェストナイルウイルスなどの他の感染症にも適用できます。まず、各RT-LAMPプライマーを分子グレード水に再構成し、最終濃度の100マイクロモルにします。溶液が均一であることを保証するためにプライマー溶液を簡単に渦液。遠心分離機は、プライマー溶液を収集するために最高速度で約5秒間。その後、技術のプロトコルの表2に概説されているように、10倍のRT-LAMPプライマーミックスを準備します。均質性を確保するために簡単に渦を起分。そして、任意の損失を避けるために、最高速度で一時的に遠心分離機。使用の間にマイナス20度でプライマーを保管し、フリーズ解凍サイクルを避けます。ヒトの尿サンプルの場合、新鮮な尿、凍結した尿または尿を防腐剤に使用してください。使用前に氷上の凍結サンプルを解凍してください。ヒト血清サンプルは新鮮または凍結する必要があり、ZIKV感染細胞株には条件付き培地または細胞ライセートのいずれかが含まれている必要があります。最後に、Aedes aegypti蚊のために、新鮮または凍結のいずれか、全体の死体を使用してください。氷の上の凍った蚊の死骸を解凍します。PBSの100マイクロリットルに個々の蚊を置きます。P10ピペットチップを使用して蚊を10回粉砕し、均質化して粗い蚊のライゼートを作ります。粗なライゼートを簡単に遠心分離して、残骸をペレット化し、上清を下流のRT-LAMP分析に使用します。まず、技術のプロトコルの表3の概要として、使用されるプライマーセットごとに氷上でRT-LAMPマスターミックス反応を準備します。各サンプルが十分に混合されていることを確認するために渦を巻く。その後、ボリュームの損失を防ぐためにそれらを簡単に回転させます。各反応に対して、200マイクロリットルのPCRチューブに200マイクロリットルのPCRチューブに混合するRT-LAMPマスターのピペット23.0マイクロリットル。次に、サンプルを2マイクロリットル加え、総容積を25.0マイクロリットルにします。負のコントロールには分子グレードの水を使用し、正のコントロールを含むようにしてください。必要に応じて、技術のプロトコルで概説されているように、デング熱ウイルスなどの関連するアルボウイルスの特異性制御反応を含める。ヒートブロック、水浴、またはサーモサイクラーを使用して、サンプルを摂氏61度で30分間加熱します。この後、ポリメラーゼを加熱非活性化するために10分間80°Cに加熱します。RT-LAMP 解析を別の密閉空間で実行します。TAEバッファーで蛍光核酸染料を1~10個希釈します。RT-LAMP反応の12ミコルリットルに蛍光核酸色素溶液の2つのミコーリットルを加えます。色の変化の存在を探すことによって目視でRT-LAMP反応を評価する。オプションでカメラを使用して、白い背景にRT-LAMP反応の写真を撮ります。次に、302ナノメートルのUV光下にサンプルを置き、蛍光によるRT-LAMP製品の存在を確認します。カメラを使用して結果を撮影します。電気泳動の実施を開始するには、可視化のための核酸染色を用いて1x TAEバッファーに2%アガロースゲルを注ぎます。最初のレーンにDNAラダーを5マイクロリットル加えて分子量を比較します。RT-LAMP反応ごとに、RT-LAMP反応混合物の13マイクロリットルを2マイクロリットルのDNAローディング色素と混合します。この15マイクロリットルの混合物をロードします。90ボルトで90分、またはバンドが分離されるまでゲルを実行します。302ナノメートルのUV光を持つ画像。終了したら、RT-LAMP反応を二重密閉袋に入れなさい。本研究では、RT-LAMP反応を分析するために3つの異なる方法が利用される。蛍光核酸色素を使用すると、正の反応は黄色緑色になり、ネガティブ反応はオレンジ色に見えます。この色素は、サンプルがUV光によって励起されると蛍光シグナルを生じます。最後に、RT-LAMP反応はアガロースゲルで使い果たすことができます。正のRT-LAMP反応はバンディングパターンを持ち、否定的な反応はDNAバンドを持たない。これらの方法は、ZIKV RT-LAMP反応の特異性を実証するために使用される。ZIKV分子制御のみが正のRT-LAMP反応を有する。さらに、公知のZIKV感染を有する患者の尿および血清の両方でZIKVが検出される一方で、ZIKV感染のない無症候性対照患者では見られない。その後、サンプルをヒト18S rRNAについて試験する。患者から採取したサンプルのみが18S rRNAに対して陽性であることが分かる。蚊のサンプルはZIKVまたはRT-LAMP品質管理AEDAEのために同様にテストすることができる。ZIKVとZIKVに感染した蚊の陽性分子制御のみがZIKVに陽性であると見られる。しかし、すべての蚊はRT-LAMPによってAEDAEにとって陽性です。一度習得すると、この技術は、それが正常に実行されている場合、30分以内に行うことができます。RT-LAMP反応は偽陽性反応を起こしやすいことを覚えておくことが重要です。予防手順には、熱labileウラシルDNAグリコシラーゼを反応に使用すること、横型ワークフローを使用する、別の空間で分析を行う、および増幅後のチューブが開いている時間を短縮するが含まれる。この手順に従って、サンプルに存在するウイルスや他のターゲットのコピーの数など、追加の質問に答えるために QPCR のような他の方法を実行できます。このビデオを見た後、あなたはジカウイルスを検出し、人間の尿や血清だけでなく、蚊のコントロールを標的にするRT-LAMPを使用する方法をよく理解する必要があります。ジカウイルスや核酸汚れで作業することは非常に危険であり、手袋を着用するなどの予防措置は、常にこの手順を実行している間に取られるべきであることを忘れないでください。ジカウイルス感染と先天性異常との関連を考えると、妊娠している女性、妊娠しようとしている女性、またはこれらの女性のパートナーは、ジカウイルスへの実験室への暴露を大幅に最小限に抑えるべきである。

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