疾患モデル作製のひと 3 D 肺組織培養 (3 D-Ltc) の生成
2019年2月12日
ここでは、生物学的および生物医学研究のモデル人間の肺疾患に 3 D 肺組織文化の生成に適している患者の切除から肺癌 agarose 充填精度カット スライスの準備のためのプロトコルを提案する.
この方法は、自然な3D構造と潜在的な治療法への主要な実験室所見の翻訳のための組成の生きているヒト組織の調査を可能にする。この技術は、個々の死亡した患者肺組織サンプルの可視化のために、外科的に切除またはヒト肺組織を植え替えることから組織培養物を特異的に生成可能にする。疾患のない肺組織は、肺疾患をモデル化する3D組織培養物として使用することができ、高い時空間分解能で早期の病態機構の解析を可能にする。
切除された肺サンプルを無菌15センチメートルの培養皿とティッシュペーパーで覆われた滅菌金属トレイの培養培地の15ミリリットルに入れ、30ミリリットルの注射器に42°Cの低融点アガロースを充填します。末梢静脈カテーテルから閉塞器を取り外し、カテーテルを30ミリリットルのシリンジに取り付けます。換気組織の直径0.5~3ミリメートルの気管支を、組織の無傷の部分で識別し、できるだけ気管支にカヌラをそっと挿入します。
鉗子を使用して、カヌラの周りの気管支壁を圧縮し、理想的には隣接する肺動脈を同時にクランプし、カヌラの周りの気管支を密閉し、他の追加の気道を閉塞させるために外科用クランプを使用して、アガロース漏れを防ぎます。次に、鉗子を使用して培養皿から肺組織を持ち上げ、注射器を使用してアガロースをカヌラを通して手動で送達し、毎秒0.3ミリリットル以下にする。肺組織が組織を過剰に膨らませることなく完全に満たされたら、すぐにカヌラを取り除き、気管支をクランプする。
アガロース凝固を容易にするために摂氏4度で培養培地に組織を沈め、さらに気管支開口部に対してアガロース充填手順を繰り返す。次に、アガロースで満たされた肺組織切片をスライスするまで摂氏4度培地で保存する。精密切断肺スライスの場合、細胞培養皿の底部にピンセットを軽く押しても崩壊しない、肺組織内の固体アガロース充填領域を特定する。
片側がまだ胸膜で覆われている固形充填領域の1〜1.5立方センチメートルブロックを物品切りし、シアノクリレート接着剤を使用して各組織ブロックの複数側をビブラートホルダーに取り付けます。長い組織ブロックを通して全体をスライスし、組織のわずか2〜3ミロメーターがスライスされていないままになるまで。鉗子を使用して、各500マイクロメートルのセクションを、栽培培地を含む12ウェルプレートの1つの井戸に移し、得られる。
すべての組織が切り離されたら、各井戸から個々の10センチメートルの培養皿にサンプルを移し、4ミリメートルの生検パンチャーを精密カット肺スライスの上面に直交して配置する。次いで、パンチャーを時計回りおよび反時計回りに移動させ、肺試料の組織パンチを得る。各パンチを96ウェルプレートの個々のウェルに新鮮な細胞培養培地に入れる。
すべての組織パンチが得られたら、最大5日間、細胞培養インキュベーターにプレートを置く。ヒト3D肺組織培養における免疫蛍光を用いた細胞核におけるフィブロネクチンの免疫標識は、保存された肺胞構造ex vivoのイメージングを可能にする。48時間の前繊維性サイトカインカクテルでヒト精密カット肺スライスパンチの治療は、線維症関連の細胞外マトリックス成分、コラーゲンタイプOne、およびフィブロネクチン遺伝子の有意な誘導を含むヒト肺3D組織培養における線維化のような変化をもたらす。
さらに、間葉マーカービメンチンのタンパク質レベルは、3D肺組織培養パンチの治療後、4人に3人の患者で調節される。この手順に従って、定量的リアルタイムPCRによるRNA分析、またはウェスタンブロッティングによるタンパク質分析などの他の方法を、組織内でそれぞれ遺伝子およびタンパク質発現を評価するために行うことができる。開発後、この技術は、実験性肺生物学の分野での研究、肺生物学の外植、ならびにヒト組織サンプルにおける毒物学的および薬理学的研究の道を開いた。
生きているヒト組織は感染する可能性があり、この手順を実行している間は、個人保護具や適切な組織貯蔵、輸送、廃棄物の取り扱いなどの予防措置を常に講じるべきであることを覚えておいてください
概要
本記事では、切除された患者組織からアガロース充填ヒト精密切片肺スライスを作製するためのプロトコルを提示します。これらのスライスは、生物学的および生物医学的研究においてヒト肺疾患をモデル化するための3D肺組織培養の構築に適しています。
研究の主要構成要素
科学分野
- 生物医学研究
- 肺疾患モデリング
- 3D組織培養技術
背景
- ヒト肺組織を用いることで、天然の3D構造における疾患の研究が可能です。
- この手法により、個々の患者の肺サンプルの可視化が行えます。
- 高い時空間解像度で、早期の病理メカニズムを解析することが可能です。
- 生きたヒト組織の感染性のため、予防措置が必要です。
研究目的
- 3D肺組織培養を作成するためのプロトコルを開発すること。
- 肺疾患のex vivo研究を促進すること。
- ヒト肺組織における遺伝子およびタンパク質発現の解析を可能にすること。
使用した手法
- 低融点アガロースを用いた肺組織サンプルの調製。
- アガロースを充填した肺切片の精密切断。
- 組織構造を可視化するための免疫標識技術。
- PCRおよびウェスタンブロッティングを用いた遺伝子およびタンパク質発現の解析。
主な結果
- サイトカイン処理後における肺組織培養中の線維化様変化の誘導。
- I型コラーゲンおよびフィブロネクチン遺伝子のアップレギュレーション。
- 処理済みサンプルにおける間葉系マーカーvimentinのタンパク質レベルの上昇。
- 実験肺科学および薬理学におけるさらなる研究の可能性。
結論
- この手法は肺生物学の理解を深めるものです。
- 毒性学的および薬理学的研究のためのプラットフォームを提供します。
- 今後の研究において、より優れた疾患モデル構築のために本手法を活用できます。
よくある質問
業界における実用的な重要性
精密切片肺スライスから誘導されたヒト3D肺組織培養は、天然のヒト組織構造における疾患メカニズムや薬物反応を研究するための、生理学的に適切なex vivoモデルを提供します。このアプローチは、個々の患者から得られた疾患部位または腫瘍周辺の肺サンプルにおいて、化合物の効果を直接評価することを可能にし、ターゲットのバリデーションおよびメカニズム的なリスク低減を支援します。本モデルは、細胞の多様性、細胞外マトリックスの組成、およびトランスレーショナルな関連性に不可欠な生物力学的特性を維持することで、前臨床評価における予測精度を高めます。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期発見およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： 3D構造と細胞型の多様性が維持された、無傷のヒト肺組織を用いて治療仮説の検証を可能にする。
- 運用上の価値： コラーゲンI型やフィブロネクチンなどの線維化関連バイオマーカーにおける薬剤誘発性の変化を測定することで、機能的なターゲット検証をサポートする。
- 科学的価値： 疾患に関連するヒト組織における初期の病態メカニズムを時空間的に分析することで、パスウェイの解明を促進する。
スクリーニングおよびアッセイの開発
- 科学的価値： マルチウェルプレートを用いた化合物スクリーニングに適した、標準化され再現性のある組織パンチを作製できる。
- 運用上の価値： 免疫蛍光染色、qPCR、ウェスタンブロッティングによる定量的読み取りを可能にし、用量反応およびタイムコース解析を実現する。
- 科学的価値： 生検パンチにより、限られた患者検体からの組織回収量を増加させ、アッセイのスケールアップと反復能力を向上させる。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 科学的価値： 精密切片肺スライスにおけるサイトカイン誘発性の線維化様変化を用い、細胞内レベルでのヒト特異的な線維化プロセスをモデル化する。
- 運用上の価値： in vivo 試験に先立ち、ヒト組織におけるターゲット結合および作用機序を評価するための疾患関連システムを提供する。
- 科学的価値： 分子レベルの読み取り値と組織レベルの機能的転帰との相関を可能にし、トランスレーショナルなバイオマーカーの整合を支援する。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は、初期のターゲット仮説検証からリード化合物の同定、そして前臨床検証に至る創薬の連続的なプロセスに適合しており、ヒト組織の応答に基づく反復的な最適化を可能にします。
- 探索生物学：無傷のヒト肺外植片における肺胞構造と細胞応答の可視化を可能にし、仮説検証を支援します。
- スクリーニング：96ウェル形式での化合物ライブラリースクリーニングに向けて、サイズと生存率が一定で、そのままアッセイに使用可能な組織パンチを提供します。
- 分析：遺伝子発現（qPCR）、タンパク質レベル（ウェスタンブロット）、および構造イメージング（免疫蛍光染色）を含むマルチプレックス読み取りを可能にし、処理条件の比較を実現します。
- トランスレーショナルリサーチ：ヒト組織の複雑性を維持し、患者層別化による応答分析を可能にすることで、探索研究と前臨床研究を橋渡しします。
- 企業内での再利用：複数のプロジェクトや治療領域に適用可能な、肺疾患モデリングのための再利用可能なプラットフォームを構築します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：ヒト肺組織を直接的に使用することで種間の翻訳ギャップを解消し、予測の信頼性を向上させる。
- 運用的価値：アガロース埋込と精密切片作成による組織調製を標準化し、ユーザー間および施設間での再現性を向上させる。
- 戦略的価値：ヒト組織を用いた早期の有効性および毒性シグナルを提供することで、開発の継続か中止かの判断（go/no-go決定）に寄与する。
- ポートフォリオへの影響：疾患部位または腫瘍周囲のヒト肺サンプルにおけるメカニズム的な効果に基づき、リスク調整後の化合物の優先順位付けを可能にする。
実施上の検討事項
- ヒト組織の取り扱い、無菌操作、およびビブラトムを用いた切片作成の専門知識が必要です。
- 外科的に切除された肺組織へのアクセスと、構造維持のための低融点アガロースの使用に依存します。
- 生きたヒト組織の感染リスクがあるため、標準化された培養条件と汚染制御が不可欠です。
- 反復実験間でのサンプルの均一性を確保するため、バイオプシーパンチのサイズと回転技術の最適化が含まれます。
- 組織の生存可能時間に制限があるため、切除後速やかな処理および培養の開始が求められます。
