Name: MALT1 Paracaspase 活動による骨髄性生得的なシグナル伝達経路制御 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: 学ぶMALT1パラカスパーゼによる骨髄性生得的免疫シグナル伝達経路の選択的制御機構。ヒトPBMCとマウス脾細胞を用いた比較解析でサイトカイン産生の調節を解明し、免疫応答と治療標的の理解に貢献します。

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我々 は Unterreinerらから図 2 aをここで再現する彼らの承認 (ナンバー 4334770630127) のエルゼビアに感謝します。(2017 年)。

<ol><li>Coornaert, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+antigen+receptor+stimulation+induces+MALT1+paracaspase-mediated+cleavage+of+the+NF-kappaB+inhibitor+A20%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+immunology%22%5BJournal%5D)">T cell antigen receptor stimulation induces MALT1 paracaspase-mediated cleavage of the NF-kappaB inhibitor A20.</a> Nature immunology. 9 (3), 263-271 (2008).</li>
<li>Rebeaud, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proteolytic+activity+of+the+paracaspase+MALT1+is+key+in+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+immunology%22%5BJournal%5D)">The proteolytic activity of the paracaspase MALT1 is key in T cell activation.</a> Nature immunology. 9 (3), 272-281 (2008).</li>
<li>Jaworski, M., Thome, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+paracaspase+MALT1%3A+Biological+function+and+potential+for+therapeutic+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">The paracaspase MALT1: Biological function and potential for therapeutic inhibition.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (3), 459-473 (2016).</li>
<li>Meininger, I., Krappmann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+signaling+and+activation+by+the+CARMA1-BCL10-MALT1+signalosome%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte signaling and activation by the CARMA1-BCL10-MALT1 signalosome.</a> Biological Chemistry. 397 (12), 1315-1333 (2016).</li>
<li>Qiao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+architecture+of+the+CARMA1%2FBcl10%2FMALT1+signalosome%3A+nucleation-induced+filamentous+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell%22%5BJournal%5D)">Structural architecture of the CARMA1/Bcl10/MALT1 signalosome: nucleation-induced filamentous assembly.</a> Molecular cell. 51 (6), 766-779 (2013).</li>
<li>Gross, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Card9+controls+a+non-TLR+signalling+pathway+for+innate+anti-fungal+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Card9 controls a non-TLR signalling pathway for innate anti-fungal immunity.</a> Nature. 442 (7103), 651-656 (2006).</li>
<li>Chiffoleau, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-type+lectin-like+receptors+as+emerging+orchestrators+of+sterile+inflammation+represent+potential+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">C-type lectin-like receptors as emerging orchestrators of sterile inflammation represent potential therapeutic targets.</a> Frontiers in Immunology. 9 (FEB), 1-9 (2018).</li>
<li>Taylor, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dectin-1+is+required+for+beta-glucan+recognition+and+control+of+fungal+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Dectin-1 is required for beta-glucan recognition and control of fungal infection.</a> Nature Immunology. 8 (1), 31-38 (2007).</li>
<li>Lanternier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+immunodeficiencies+underlying+fungal+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+pediatrics%22%5BJournal%5D)">Primary immunodeficiencies underlying fungal infections.</a> Current opinion in pediatrics. 25 (6), 736-747 (2013).</li>
<li>Thome, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifunctional+roles+for+MALT1+in+T-cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Multifunctional roles for MALT1 in T-cell activation.</a> Nature reviews. Immunology. 8 (7), 495-500 (2008).</li>
<li>Unterreiner, A., Stoehr, N., Huppertz, C., Calzascia, T., Farady, C. J., Bornancin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+MALT1+paracaspase+inhibition+does+not+block+TNF-%CE%B1+production+downstream+of+TLR-4+in+myeloid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+Letters%22%5BJournal%5D)">Selective MALT1 paracaspase inhibition does not block TNF-α production downstream of TLR-4 in myeloid cells.</a> Immunology Letters. , 48-51 (2017).</li>
<li>Strasser, D., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22265677">Syk Kinase-Coupled C-type Lectin Receptors Engage Protein Kinase C-δ to Elicit Card9 Adaptor-Mediated Innate Immunity.</a> Immunity. 36 (1), 32-42 (2012).</li>
<li>Jaworski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malt1+protease+inactivation+efficiently+dampens+immune+responses+but+causes+spontaneous+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Malt1 protease inactivation efficiently dampens immune responses but causes spontaneous autoimmunity.</a> The EMBO journal. 33 (23), 2765-2781 (2014).</li>
<li>Yu, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALT1+protease+activity+is+required+for+innate+and+adaptive+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">MALT1 protease activity is required for innate and adaptive immune responses.</a> PLoS ONE. 10 (5), 1-20 (2015).</li>
<li>Bardet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+T-cell+fingerprint+of+MALT1+paracaspase+revealed+by+selective+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The T-cell fingerprint of MALT1 paracaspase revealed by selective inhibition.</a> Immunology and Cell Biology. 96 (1), 81-99 (2018).</li>
<li>Thoma, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+and+profiling+of+a+selective+and+efficacious+syk+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Discovery and profiling of a selective and efficacious syk inhibitor.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 58 (4), 1950-1963 (2015).</li>
<li>Bauer, B., Steinle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HemITAM%3A+A+single+tyrosine+motif+that+packs+a+punch%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">HemITAM: A single tyrosine motif that packs a punch.</a> Science Signaling. 10 (508), 1-10 (2017).</li>
<li>Gringhuis, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://journals.plos.org/plospathogens/article?id=10.1371/journal.ppat.1001259">Selective c-Rel activation via Malt1 controls anti-fungal TH-17 immunity by dectin-1 and dectin-2.</a> PLoS Pathogens. 7 (1), (2011).</li>
<li>Dufner, A., Schamel, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cell+antigen+receptor-induced+activation+of+an+IRAK4-dependent+signaling+pathway+revealed+by+a+MALT1-IRAK4+double+knockout+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Communication+and+Signaling%22%5BJournal%5D)">B cell antigen receptor-induced activation of an IRAK4-dependent signaling pathway revealed by a MALT1-IRAK4 double knockout mouse model.</a> Cell Communication and Signaling. 9 (1), 6(2011).</li>
<li>Phelan, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiprotein+supercomplex+controlling+oncogenic+signalling+in+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A multiprotein supercomplex controlling oncogenic signalling in lymphoma.</a> Nature. , In press (2018).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

この仕事で人間のシグナル伝達経路とマウス自然細胞研究し、MALT1 蛋白分解機能への依存度を調査簡単な実験設定を使用しました。以前の作業11で拡大して、我々 の研究は、MALT1 paracaspase 活動が C 型レクチン様受容体誘導サイトカイン産生、TNF α などを制御することを示した。対照的に、TLR 4 誘導性 TNF α は両草種と MALT1 の独立していた。総称して、これらのデータは、MALT1/CBM シグナロソーム下流の C 型レクチン様受容体、6、研究以前12,18で発表されたの主要で選択的な貢献を確証しました。
TLR 4 MALT1 骨髄細胞内のシグナル伝達の明確な独立性は他に適用するかどうかのセルタイプを探検するために残っています。例えば、B リンパ球、tlr 以前示された B 細胞抗原受容体<sup class="xr...

MALT1 の paracaspase 活動 (粘膜関連リンパ組織リンパ腫転座蛋白質 1) は、2008 年1,2で明らかにされました。その後、研究の数は、リンパ球の抗原受容体応答への重要な貢献を報告しています。マウス T 細胞、T 細胞の依存の自己免疫および B 細胞リンパ腫の設定3,4薬理データが重要な役割をサポートと同様に遺伝的モデル。CARD11-BCL10-MALT1 複雑な5、抗原受容体近位伝達によってトリガーされるアセンブリに発生します MALT1 paracaspase 活性化リンパ球の T ・ B 細胞受容体の下流。また同様 CARD9 BCL10 MALT1 コンプレックスが例えば C 型レクチン様受容体 (CLLR) の下流にシグナルを伝達するために重要という十分な証拠がある,自己免疫 1、ヒトデクチン 2、骨髄性で MINCLE 細胞6,7。自己免疫 1 はこの経路は真菌感染症8,9防御の重要なので、特によく研究されています。ただし、Toll 様受容体 (TLR) 経路で MALT1 の含意は、物議を醸す10を推移しています。ひと骨髄細胞における最近の証拠は TLR 411の下流 TNF 産規制で MALT1 paracaspase 活性に直接的な役割を否定しました。
現在の仕事で特定の薬理学的ツール阻害剤、サイトカイン産生の測定に依存する生得的なシグナル伝達経路をプローブする様々 な実験的設定と人間の刺激条件マウス骨髄細胞を使いました。

<table><tbody><tr><td>100 & マイクロ;m ナイロン製セルストレーナー</td><td>Sigma</td><td>CLS431752</td><td></td></tr><tr><td>14 mL ファルコンチューブ</td><td>BD ファルコン</td><td>352057</td><td></td></tr><tr><td>15 mL ファルコンチューブ</td><td>ファルコン</td><td>352090</td><td></td></tr><tr><td>50 mL ファルコンチューブ</td><td>ファルコン</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>6ウェルプレート</td><td>Costar</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>96ウェル平底プレート、低蒸発蓋付き</td><td>Costar</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>96ウェルV底プレート</td><td>Costar</td><td>734-1798</td><td></td></tr>塩化<tr><td>アンモニウム-NH4Cl</td>シ<td>グマ</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>アッセイ希釈液RD1-W ELISA</td><td>R&D</td><td>895038</td><td>Assay diluent</td></tr><tr><td>細胞培養マイクロプレート、384 ウェル、黒</td><td>Greiner</td><td>781986</td><td></td></tr><tr><td>枯渇 Zymosan</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-dzn</td><td>now: tlrl-zyd</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシ</td><td>ド</td><td>Sigma D2650</td><td>DMSO</td></tr><tr><td>EDTA-Na2</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td>エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩二水和物</td></tr><tr><td>ELISA muTNF-&alpha;</td><td>R&D</td><td>SMTA00</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS C tubes</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-096-334</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS dissociator</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>GM-CSF</td><td>Novartis-Heat-inactivated</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Fetal wevine serum</td><td>Gibco</td><td>10082</td><td>FBS</td></tr><tr><td>HTRF hu IL-23</td><td>CisBio</td><td>62HIL23PEG</td><td></td></tr><tr><td>HTRF hu TNF-&alpha;</td><td>CisBio</td><td>62TNFPEC</td><td></td></tr><tr><td>HTRF 再構成バッファー</td><td>CisBio</td><td>62RB3RDE</td><td>50mM リン酸バッファー、pH 7.0、0.8M KF、0.2% BSA</td></tr><tr><td>IFN-&γ;</td><td>R&D</td><td>L4516</td><td></td></tr><tr><td>IL-4</td><td>ノバルティス</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>アボット</td><td>フォレン</td><td></td></tr><tr><td>リポ多糖類 (LPS)</td><td>シグマ</td><td>L4391</td><td>LPS ヒト試料に</td></tr><tr><td>使用 リポ多糖類</td><td>シグマ</td><td>L4516</td><td>LPS マウス試料に使用</td></tr><tr><td>溶解バッファー</td><td>自作</td><td>-</td><td>155 mM NH4Cl、10 mM KHCO3、1 mM EDTA、pH 7.4</td></tr><tr><td>マグネット</td><td>Stemcell</td><td>18001</td><td></td></tr><tr><td>マイクロプレート、384 ウェル ホワイト</td><td>Greiner</td><td>784075</td><td></td></tr><tr><td>単球濃縮キット</td><td>Stemcell</td><td>19059</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Mr. Frosty Cryo 1&deg;C凍結容器</td><td>Nalgene</td><td>5100-0001</td><td>冷却装置(プロパノール-2を含む)</td></tr><tr><td>PBS 1x pH 7.4 [-] CaCl2 [-] MgCl2</td><td>Gibco</td><td>10010</td><td>リン酸緩衝生理食塩水</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td>ペン/連鎖球菌</td></tr>性<tr><td>重炭酸カリウム - KHCO3</td><td>Sigma</td><td>P9144</td><td></td></tr><tr><td>PrestoBlue</td><td>Invitrogen</td><td>A13262</td><td>生存率評価用レサズリン溶液</td></tr><tr><td>Propanol-2</td><td>Merck</td><td>1.09634</td><td></td></tr><tr><td>リードバッファー</td><td>メソスケールディスカバリー</td><td>R92TC-3</td><td>トリプロピルアミンを含むトリスベースのバッファー</td></tr><tr><td>回収細胞培養凍結培地</td><td>Gibco</td><td>12648-010</td><td>凍結培地</td></tr><tr><td>ロズウェルパーク記念研究所 培地 (RPMI) Glutamax</td><td>Gibco</td><td>61870</td><td>+ iMoDCs + 10% FBS + 1 mM ピルビン酸ナトリウム + 100 U/mL ペン/溶連菌 + 5 & マイクロ;M &β;-ヒトPBMCおよび単球用メルカプトエタノール + 10% FBS + Pen/Strep + 5 &マウス脾細胞用M&β;-メルカプトエタノール</td></tr><tr><td>分離バッファー</td><td>自作</td><td>-</td><td>PBS pH 7.4 + 2% FBS + 1 mM EDTA pH 8.0</td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム</td><td>Gibco</td><td>11360</td><td></td></tr><tr><td>トレハロース-6,6-ジベヘン酸</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-tdb</td><td>TDB</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P7949</td><td>ポリソルベート 20</td></tr><tr><td>UltraPure 0.5 M EDTA pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>15675</td><td>エチレンジアミン四酢酸</td></tr><tr><td>Viewsealのシー</td><td>ラーGreiner BioOne</td><td>676070</td><td></td></tr><tr><td>V-PLEXの炎症性パネル1の人間のキット</td><td>MesoScaleの発見</td><td>K15049D</td><td>電気化学発光の多重測定法(IL-1ベータ;、TNF-&アルファ;、IL-6、IL-8)</td></tr><tr><td>ベータ;-メルカプトエタノール</td><td>Gibco</td><td>31350</td><td></td></tr></tbody></table>

malt1 paracaspase 活動による骨髄性生得的なシグナル伝達経路制御

Myeloid Innate Signaling Pathway Regulation by MALT1 Paracaspase Activity

多くの研究によって対処されている、リンパ球様細胞でその機能のほか paracaspase MALT1 はまたパターン認識受容体の下流生得の細胞で重要な役割を果たしています。SYK と CARD9-依存性シグナル伝達カスケード MALT1 依存的に、NF-κ B の活性化につながるを誘発する C 型レクチン様受容体ファミリの自己免疫 1 および自己免疫-2 メンバーである最もよく研究します。一方で、Toll 様受容体 (TLR) TLR 4 など NF-κ B 活性化が MYD88/アイラック依存型カスケードを介して信号を伝達します。それにもかかわらず、MALT1 TLR 4 シグナル伝達に貢献するかもしれないかどうか明白でなく残ったが。MLT-827、MALT1 paracaspase 活動の強力かつ選択的な阻害剤を最近の証拠ことを示しますひと骨髄細胞における TLR 4 の下流 TNF 産 MALT1 TNF 産下流ではなく自己免疫-1 の独立 MALT1 であります。依存。ここでは、我々 はさらに、さまざまな人間とマウス細胞製剤と自己免疫 1、MINCLE または TLR 4 経路の刺激を使用してパターン認識における MALT1 の選択的関与に対処。サイトカイン TNF-を超えてあり、MLT 827 SYK 阻害剤 (Cpd11)、IKK 阻害剤 (AFN700) を比較することによって、我々 はまた追加の洞察力を提供しました。総称して、提供されたデータがさらに MALT1 C 型レクチン様受容体依存性の証拠-対照的に TLR シグナルをシグナリングします。

骨髄細胞における MALT1 自己免疫 1、ヒトデクチン 2、MINCLE6など、いくつかの C 型レクチン様受容体活性化シグナルを下流に中継します。(裾) ITAM モチーフ含んでいる受容体に依存してこれらの経路 (例えば,自己免疫 1) または ITAM モチーフを含む共同受容体 (例えば, FcRγ、ヒトデクチン 2、MINCLE の) 募集、SYK キナーゼ (図 1) をアクティブにします。これは蛋白質キナーゼ C アイソ フォーム、すなわち pkc δ、CARD9、ひいては CARD9/BCL10/MALT1 複雑な形成、TRAF6 の下流 NF-κ B 活性化12募集を廃止するの活性化に します。対照的に、TLR 4 経路は、TRAF6 MYD88/アイラック依存的 NF κ B 活性化 (図 1) が、MAL...

MALT1 免疫を調節するが、不明確のままどのようにこれが発生します。MALT1 の生得的なシグナリング Toll 様や C 型レクチン様受容体、MALT1 が骨髄性サイトカインの生産を調節することを示すの下流と下流への貢献を解明する選択的 MALT1 paracaspase 阻害剤 MLT 827 を使いました。C 型レクチン様受容体の選択的に。

MALT1 Paracaspase 活動による骨髄性生得的なシグナル伝達経路制御

Besides its function in lymphoid cells, which has been addressed by numerous studies, the paracaspase MALT1 also plays an important role in innate cells ...

そこで、私たちの原稿の方法の目的は、ヒトとマウスのシステムを用いて骨髄細胞のシグナル経路の比較分析を提供することです。これは、選択されたパターン認識受容体の下流に関与するシグナル経路を定義するのに役立ちます。したがって、このメソッドは実装が簡単です。これは、シグナル伝達機構の解明に不可欠な一次細胞製剤および検証された基準化合物に依存しています。この手順を実証するのは、ラティバ・トゥイールとアデリーン・ウンテライナー、それぞれ私たちのグループの科学者と研究員です。ラミナーフローフードでは、無菌のハサミ、1リットルのビーカー、ビニール袋をセットしました。以前に入手したバフィーコートをビーカーに入れ、はさみを使用して慎重に開きます。25 mm ピペットを使用して、EDTA の 2 ミリモルを添加した PBS の 100 ml を追加します。ゆっくりと上下にピペットで混ぜます。そして、希釈したバフィーコートの25mlを、それぞれ15mlの多糖ベースの密度勾配で予め充填された6つの50ml円錐遠心管に移す。チューブを800gで20分間遠心分離し、その密度に基づいて細胞を分離できるように、休憩なしで適度な加速を行います。遠心分離後、赤血球と顆粒球を含むペレット、血漿で作られた上層、および末梢血単核細胞を含む白い環が見える。PBMCリングを収穫し、新しい50 mlの管にそれらを移すために10 mlのピペットを使用してください。PBSとEDTAでトップアップ。テキスト プロトコルで説明されているように、遠心時間と速度を減少させる 3 つの連続したのスケーションを実行します。最後の洗浄後、25mlの氷冷ライシスバッファーでペレットを再懸濁し、浸透圧で赤血球を分解します。溶液が明らかになるまで室温でインキュベートする。その後、25mlの分離バッファーを加え、反応を停止します。遠心分離機を150gで8分間洗浄し、溶液を洗浄する。上清を注ぎ、分離バッファーでペレットを再懸濁します。細胞を数えた後、1ウェルあたり12,500細胞まで培養培地で希釈する。384ウェルプレートの各ウェルにこの細胞懸濁液の30 mlを配布します。次に、各ウェルに4倍の濃縮化合物溶液の15マイクロリットルを加え、1時間5%の二酸化炭素で摂氏37度でプレートを前キューバベートします。必要に応じて、 LPS を 1 ml あたり 1 ng の最終濃度に追加するか、または 1ml あたり 100 mcg の最終濃度に Zymosan を枯渇させた。その後、5%の二酸化炭素で摂氏37度で一晩プレートをインキュベートします。翌日は、分泌されたTNFアルファレベルを測定するために上清の10マイクロリットルを取る。シリアル希釈を開始するには、MLT-827ストック溶液を培地で希釈し、一度に8マイクロモルの濃度に達します。0.08%DMSOの培地を使用して、6ステップ1:5シリアル希釈を行います。単回投与試験の準備のために、MLT-827、AFN700、および化合物11ストック溶液を培地で希釈し、一度に4マイクロモル濃度に達する。まず、枯渇したZymosanの10mgに無菌内毒素フリー水2mlを加えます。このストック溶液を均質化するボルテックス。溶液をアリコートし、その後、摂氏20度でアリコートを保存します。本研究では、ヒトPBMCsおよびマウス脾臓細胞は、枯渇したZymosan、デクチン-1アゴニスト、またはリポ多糖(TL4アゴニスト)のいずれかで刺激される。上清中のNTNFα放出は、20時間後に測定される。ヒトとマウスの両方のアッセイにおいて、MLT-827化合物は、Dectin-1経路によって駆動されるTNFアルファ産生を選択的にブロックするが、TLR4経路によってはブロックしない。LPSで刺激された単球では、TNFアルファの産生はほぼ完全にAFN700によって除化されるが、それはTLR4経路のNF-κB活性への依存性およびSIC活性への依存性と一致するCpd11に敏感ではない。対照的に、Dectin-1およびMODが駆動するTNFアルファ産生は、MLT-827、AFN700、およびCpd11に対する感受性を示す。これは、Dectin-1経路におけるSIC CBMシグナル伝達カスケードの関与に関するさらなる証拠を提供する。IL-1 β、IL-6、およびIL-23の産生は、3つの阻害剤にも敏感であり、TNFアルファに類似した調節機構を示す。しかし、IL-8の産生に見られる限られた効果は、このサイトカインが明確な調節メカニズムを有することを示唆している。トレハロース-ジベヘン酸濃度を1ml当たり50mcg以上に上げると、MLT-827のブロッキング効果に応じてMALT1パラカスパーゼ活性に依存していたTNFアルファ、IL-6、IL-1ベータの産生が可能です。同様の結果は、デクチン-1を刺激するために枯渇したZymosanの濃度を増加させるとモッズに挑戦したときに見られました。この方法により、パラカスパーゼMALT1がC型レクチン様受容体シグナル伝達を選択的に調節することを示すことを可能にした。それは、よく特徴付け参照化合物を使用することが不可欠です。ストックソリューションの希釈手順に注意してください。これは、限られた溶解性を有する化合物にとって重要である。

myeloid-innate-signaling-pathway-regulation-malt1-paracaspase

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JoVE Journal

Biology

生物学

シアリダーゼのアッセイは、微生物感染と生マクロファージの細胞表面の受容体レベルでの炎症性疾患への関与のTLRセンサの新しい分子機構（s）を解明する簡単な技術的なアプローチです。...

Toll様受容体の活性化を調節するのNeu1シアリダーゼ活性の検出

監視劈開カスパーゼ-3活性およびカリウム誘発性膜の脱分極に続いてライブセルイメージングとCleaveable蛍光色素基質を用いて不死化オリゴデンドログリア細胞のアポトーシス

このプロトコルを記述するカスパーゼ分子蛍光補完 (BiFC);自分の活性化の最初のステップであるイニシエーター カスパーゼの誘起近接を視覚化に使用することができますイメージング...

カスパーゼ活性化分子蛍光補完への道をライトアップ

蛍光顕微鏡を使用し、アクティブなカスパーゼ 1 のアダプター、ASC 染色細胞単位で炎症: NLRP3 インフラマソーム活性化の検出について述べる。乳酸脱水素酵素のリリースの試金である人口に基づいて pyroptotic 換散を検出する.

インフラマソーム活性化とマウス骨髄由来マクロファージにおける Pyroptotic の細胞死の検出

走査型電子顕微鏡および NMR による脂質結合ネクロトーシス従来および共焦点の生細胞顕微鏡イメージングなどの MLKL...

ネクロトーシス MLKL を介した細胞膜破壊の解析

このプロトコルは、ヒト血液サンプルから単球由来マクロファージ(MDM)を取得するワークフロー、細胞の生存率と挙動を損なうことなく炎症性カスパーゼ二分子蛍光相補(BiFC)レポーターをヒトMDMに効率的に導入する簡単な方法、および生細胞における炎症性カスパーゼ活性化を測定するためのイメージングベースのアプローチを記述しています。...

ヒト単球由来マクロファージにおける炎症性カスパーゼ誘導近接の可視化

このプロトコルは、パイロトーシス、アポトーシス、ネクロプトーシス、およびパンノプトーシスなどの細胞死経路の開始を決定するための感染、無菌の侮辱、および癌のin vitro および in vivo...

自然免疫細胞死を評価するためのカスパーゼ活性化の評価

本プロトコルは、フローサイトメトリーまたは分光蛍光光度計を使用して蛍光発生基質を介してカスパーゼ活性を測定する2つの方法を記載する。...

蛍光アッセイまたはフローサイトメトリーを使用したカスパーゼ活性の測定

ここでは、マウスに異種移植され、骨髄穿刺から得られた急性ヒト骨髄性白血病細胞におけるmTORC1、JAK/STAT5、およびMAPK経路の下流のシグナル伝達を分析するためのリン酸化流サイトメトリーベースの方法について説明します。p-STAT5、p-4EBP1、p-RPS6、p-ERK1/2の各レベルを、高感度の次世代スペクトルフローサイトメーターを用いて同時に測定します。...

急性骨髄性白血病患者由来異種移植の細胞内リン酸化流サイトメトリー

このビデオでは、マウスの骨髄から骨髄樹状細胞を区別するための手順を示しています。マウス脛骨と大腿骨、および骨髄の処理の分離が実証されています。細胞の表現型とのCpGを用いてIL -...

骨髄前駆細胞から骨髄樹状細胞の培養

学ぶMALT1パラカスパーゼによる骨髄性生得的免疫シグナル伝達経路の選択的制御機構。ヒトPBMCとマウス脾細胞を用いた比較解析でサイトカイン産生の調節を解明し、免疫応答と治療標的の理解に貢献します。

MALT1 Paracaspase 活動による骨髄性生得的なシグナル伝達経路制御

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