大人のゼブラフィッシュの DNA 基づかせていたワクチンの前臨床スクリーニングのため予防接種

このプロトコルを使用して結核に対する新しいワクチン候補を探しますが、私は他の感染症にも適用できます。哺乳類モデルと比較して、この方法は、新規DNAベースワクチン候補の予備スクリーニングのための費用対効果の高い手順を提供する。この手順のデモンストレーションは、私たちの研究室の技術者であるハンナレナ・ピッポです。

まず、ガラスの毛細管を極棒のV溝にセットし、クランプノブを軽く締めます。ホルダーをフィラメントの隣に移動し、フィラメントを通してフィラメントの反対側の極性バーにキャピラリーを軽く押し込みます。次にクランプノブを締め、安全ガラスを下ろし、プルボタンを押します。

この後、針の先端を保護するためにペトリ皿の中に再利用可能な接着剤の一部に針を置きます。まず、1回当たり0.5~12マイクログラムのプラスミドを使用して注射ミックスを調製する。グループ内の魚の数に合わせて、マスターミックスの適切なボリュームを準備します。

毛細血管の針をテープの粘着性のある側に適切なホルダーに置きます。次に、プラスミド用量のピペット液滴を実験室フィルムの一部にする。この後、フィルムからプラスミド滴を針に移すためにローディングチップを使用します。

ピペットはゆっくりと慎重に、針に空気の泡をピペットを避けます。マイクロマニピュレータと光源を配置します。次に、空気圧タップを開いた位置に切り替えます。

マイクロインジェクタフロントパネルでは、タイミングモードを使用してパルス長を10秒に調整します。次に、10ターンの周期ダイヤルでパルス長を微調整します。次に、マイクロマニピュレータのマイクロピペットホルダーに針をセットします。

ピンセットを使用して針の先端を切り取り、液体を押し出し、顕微鏡を使用して針の位置を評価します。リモートフットスイッチを1回押して、1秒間のパルスが小さな液滴を針から押し出すことを確認します。次に、エレクトロポレーターの設定を調整し、ピンセットをエレクトロポレーターに接続します。

注射中に一定の位置に魚を保つためにパッドとして中央に切られた溝とスポンジの一部を使用してください。スポンジをシステムウォーターに十分に浸し、ペトリ皿に入れます。プラスチック製のスプーンを使用して、麻酔をしたゼブラフィッシュを濡れたスポンジに移し、魚の腹側を溝に下に置きます。

顕微鏡の下で、ゼブラフィッシュの背部筋肉に近い45度の角度で針を置き、背びれの前に鱗のない小さな場所を見つけ、針を筋肉に押し込みます。抵抗が感じられる場合は、隣接するスポットを試してみてください。徐々にプラスミド溶液を筋肉に注入するために、フットスイッチを使用してください。

顕微鏡下では、フェノールレッドは筋肉組織に入ると見えるはずです。注入部位の両側にツイーザー型電極を配置して、射出直後に魚を電気ポレートする。エレクトロポレーターの開始ボタンを押して、6つの40ボルト50ミリ秒のパルスを与えます。

その後、魚を回収槽にそっと移します。最後に、テキストプロトコルに従って魚を麻酔した後、UV光を使用して、注入部位の近くでEGFP発現を見る。このプロトコルでは、DNA抗原を発現ベクター中のGFPに隣接してクローニングした。

ゼブラフィッシュは、マイクロインジェクターを用いてDNA抗原プラスミドを筋肉内に注射し、細胞内へのプラスミドの摂取を改善するために注射部位を電気ポポレートした。イメージングの場合、抗原発現は蛍光顕微鏡で可視化できます。この場合、3つの抗原全てのGFP融合タンパク質の発現は、その強度は様々であったが、注射部位の近くで検出された。

マイコバクテリア抗原による免疫化から5週間後、ゼブラフィッシュはマイコバクテリウムマリナムに感染した。QPCRは、感染後4週間で各魚の細菌の負担を決定するために使用されました。対照群と比較して、抗原1で免疫された魚は、M.marinumによる感染後の細菌負荷の減少を示した。

この方法を行う上で、慎重にプラスミド構築物を設計し、抗原の発現を検証し、大規模な実験の前に注入技術を実践することが重要である。この技術は、成体ゼブラフィッシュにおける新規DNAベースワクチン候補の費用対効果の高い前臨床スクリーニングへの道を開くことができる。動物の福祉は非常に重要であり、この手順を実行する間適切な麻酔が不可欠であることを忘れないでください。