Name: 大人のゼブラフィッシュの DNA 基づかせていたワクチンの前臨床スクリーニングのため予防接種 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-30T14:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 39 s
Description: 学ぶDNAワクチン接種法をDanio rerioで前臨床スクリーニングする方法。筋肉内注射と電気穿孔を用い、結核などの感染症に対するワクチン候補を効率的に評価できる。

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著者は、レーナ ・ Mäkinen と Hannaleena ・ ピッポ、特にすべての仕事のために行っている開発とワクチン接種のプロトコル、および実際の実験で彼らの助けの最適化、実験免疫学研究グループのメンバーに感謝しています。プロトコルを使用しています。
この作品は、ジェーンの ja によって支えられた Aatos Erkon Säätiö (ジェーンと Aatos Erkko 財団原産地に)、ねんどろいど Juséliuksen Säätiö (ねんどろいど Juselius 財団原産地する)、タンペレ大学の専門家の責任領域の競争状態の研究資金(修士課程) に病院、演奏 Tuberkuloosisäätiö (タンペレ結核財団; 原産地に陛下と m. n.)、Suomen Kulttuurirahasto (フィンランド文化財団; 陛下に)、Suomen Tuberkuloosin Vastustamisyhdistyksen Säätiö (フィンランドの結核財団;陛下) に Väinö ja Laina テクスチャペインティング säätiö (Väinö と Laina キビ財団 m. n. に) および (m. n.) にタンペレ市科学財団。

アダルト ゼブラフィッシュを含む実験では、予防接種と感染症モデルとその後の研究のための動物実験の許可を要求します。すべての方法とここで説明実験フィンランドの動物実験委員会 (ESAVI) によってを承認し、EU ディレクティブ 2010/63/EU に従って実施研究。
1. DNA ワクチン抗原のクローニング
<ol><li>強い、構成のプロモーター、サイトメガロ ウイルス (CMV) の即時初期プロモーターなど関心の菌株の真核生物の表現のために最適化された発現プラスミドを選択します。抗原の発現の生体内での検証を有効にするには、このプロトコルで使われる pCMV EGFP プラスミド9などの蛍光タグをエンコードするワクチン プラスミドを選択します。</li>
	<li>発現から約 90-600 nt (30-200 aa)26の潜在的免疫保護抗原シーケンス (またはいくつかのシーケンス) を選択する適切な web ベースおよび bioinformatic ツールを使用-の-で使用される病原体の利益、それ以降の感染モデル。</li>
	<li>利用可能なソフトウェアを使用して、または手動で病原体ゲノムから抗原遺伝子を増幅し、発現プラスミドの多重クローニング サイトに抗原シーケンスをクローンのプライマーを設計します。抗原を選択する際に正しいリーディング ・ フレームを保持することを確認します。</li>
	<li>5' プライマーのコザック シーケンス (CCACC)27と開始コドン (ATG) の両方が含まれます。C ターミナル EGFP タグを保持するには、抗原シーケンスと 3' プライマーの介在の終止コドン (タグ、TAA は、TGA) は避けてください。また、興味の抗原と同じ読書フレームに GFP タグが残っていることを確認します。</li>
	<li>クローンのプライマーで PCR の製品の十分な量を生成するのに RNA またはテンプレートとして病原体から抽出した DNA を使用します。好ましくは、校正のポリメラーゼは DNA を使用して正しい抗原シーケンスを保持します。</li>
	<li>PCR の製品の浄化し、ゲル電気泳動による製品の正しいサイズをチェックします。消化し、消化ワクチン プラスミドと PCR の製品を縛る。</li>
	<li>結紮ミックスを適切なプロトコルに従って細菌の有能なセルに変換します。肯定的なコロニーと大腸菌のプラスミド生産のための適切な抗生物質選択を使用します。pCMV EGFP プラスミドには、このためのアンピシリン耐性遺伝子など含まれています。</li>
	<li>サンガーを使用して正しい抗原シーケンスの挿入を確認するシーケンス。PCMV EGFP プラスミッド シーケンス抗原に次のプライマーを使用できます: CMV 転送 5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3 'と EGFP N 逆 5' 3 CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG'。</li>
	<li>生産し、ワクチン構成体の十分な量を浄化します。溶解または滅菌水でプラスミドを溶出します。濃度は、少なくとも 0.72 μ M または 2,000 ng/μ L と作り出されたプラスミド DNA が高品質であることを確認します。</li>
</ol>2. マイクロインジェクション針を引いてください。
<ol><li>マイクロインジェクション針を事前に準備します。10 cm アルミノケイ酸塩のガラス管を使用します。ホウケイ酸ガラス管は成魚を注入するためあまりにも脆性に注意してください。</li>
	<li>マイクロ ピペット針製造装置と針を引っ張る。 注意: 針は図 1で示したものと同様になります。このプロトコル (材料のテーブル) で使用され、デバイスが次の設定は、針の目的の種類。<ol>
<li>引き手バーでガラスの V 溝にキャピラリーを設定し、軽くクランプを締めます。</li>
		<li>フィラメントの横にあるホルダーを移動し、引き手バーにフィラメントの反対側のフィラメントを介して毛細血管を軽く押します。キャピラリーとフィラメントを触れないでください。</li>
		<li>締め付けノブを締めて安全ガラスを設定し、プルのボタンを押します。 注意: フィラメントは暑いです。</li>
	</ol>
</li>
	<li>針の先端を保護するために 15 cm シャーレ プレート内再利用可能な接着剤の部分に針を置きます。針をきれいに保つために覆われている料理をしてください。</li>
</ol>3. マイクロ ピペット針を充填
<ol><li>ワクチン ミックスを準備します。プラスミド線量あたりの 0.5-12 μ g を使用します。1 予防接種のミックスにいくつかの異なるプラスミドを組み合わせ、魚あたり 12 μ g の最大 DNA 濃度を使用します。</li>
	<li>各グループ (下記参照) の魚の数によると「マスター ミックス」ワクチンの量を計算します。各投与キャピラリー針の充填と射出の観察の両方を容易にするために無菌ろ過フェノールレッドの 1 μ l を追加します。滅菌 1 を加える 1 つの注入量85-7 μ l の最大容量まで PBS x。 注: 注入量 7 μ L より高い注射液の時折の液もれ、避けるべき、したがってであります。</li>
	<li>テープ、適切なホルダー、空ヒント ボックスの側などに、糊面の一部を配置します。優しく細針をテープに接続します。</li>
	<li>研究室のフィルムの一部にワクチン ミックス 7 μ の最大をピペットで移しなさい。ロード ヒントを使用すると、針の中に映画からワクチンを転送します。ピペットで移しなさいゆっくりと慎重に、針の中に空気の泡をピペッティングを避けてください。</li>
	<li>針の残りの小さい空気泡を削除に 15-30 分のために解決しなさい</li>
</ol>4. 予防接種用マイクロインジェクターおよび遺伝子導入装置の設定
<ol><li>正しい位置にマニピュレーターや光源を設定します。空気圧タップをオープンの位置に切り替えます。</li>
	<li>空気圧機器のパラメーターを調整する (図 2を参照してください) を以下のようにポンプします。<ol>
<li>通気ノブを毛管作用によってピペットの埋め戻しを防ぐために保持するためにイジェクト ポートで設定します。取り出しポートからピペットへチューブを設定します。このプロトコルでは真空ポートを使用しないでください。</li>
		<li>パルス長を調整: 使用時間指定モード、電子タイマーが圧ソレノイドが開いたまま時間の時間をコントロールします。取り出し圧力ゲージの横に緑のランプは点灯圧ソレノイドが (通電) を開くことを確認。</li>
		<li>パルスの範囲を 10 に設定 s;この設定では、パルスがさらに設定する 100 ms から 10.1 米使用、 10 ターン期間ダイヤルパルスの長さを微調整するため、ダイヤルの各ターンは、1.0 s。必要な場合、これも注射中に調整できます。</li>
		<li>空気圧ポンプや、リモートのフット スイッチ(推奨) のフロント パネルのパルス発信側 (「スタート ボタン」) を使用します。これが空気圧ポンプのフロント パネルに接続されています。</li>
	</ol>
</li>
	<li>マニピュレーターのピペット ホルダーに針を設定します。ピンセットで針の先端をカット、液体をプッシュすることができ、顕微鏡を使用して正しい位置を表示します。一度フット スイッチを押して針から小さな液滴を 1 のパルスにプッシュを参照してください。</li>
	<li>遺伝子導入装置の次の設定を使用: 電圧 = 40 V;パルスの持続時間 = 50 ms でパルス数 = 6。ピンセットを本体に接続します。実際の電圧とパルス長のモニターに表示大差ない設定から参照してください。</li>
</ol>5. DNA ワクチンとエレクトロポレーションの注入
<ol><li>このプロトコルは、使用、健康的な 12 ヶ月歳アダルト ゼブラフィッシュに 6 によると予防接種。水 1 リットルあたり 7 魚の最大の 14/10 h/明暗サイクルとフローをシステムで魚を保ちます。</li>
	<li>麻酔魚28のタンクの水で 0.02%、3-アミノ安息香酸エチル エステル (tricaine) ソリューション (pH 7) を準備します。10 cm シャーレまたは類似のものを使用します。</li>
	<li>汚水回収タンクを準備するには、クリーン システム水の 3 L と 5 L ビーカーを充填します。</li>
	<li>予防接種予防接種の中に固定位置に魚を保つためにパディングを準備します。3 cm 厚のスポンジに、2 の 5 × 7 cm2個を取る。鋭いはさみやメス刃を持つスポンジに溝をカットします。 注: 複数の実験で同じ予防接種パディングを使用できます。70% アルコールで浸すことによって実験間にスポンジを消毒して乾燥させて.</li>
	<li>徹底的にシステム水でスポンジを浸し、シャーレにスポンジをセットします。</li>
	<li>高速魚の予防接種前に 24 h。</li>
	<li>0.02 %tricaine を含むシャーレに配置することによって 1 つのゼブラフィッシュを麻酔します。エラの動きがないまで、刺激をタッチしても反応しない魚を待ちます。一度に 1 つの魚を麻酔します。</li>
	<li>プラスチック スプーンを使用して、ぬれたスポンジに麻酔のゼブラフィッシュを転送し、溝に魚の腹側を設定します。正しい位置に頭と魚の体のほとんどは、溝の中が、背びれと尻尾が溝から突き出たを確認します。</li>
	<li>顕微鏡下で針を慎重に配置、ゼブラフィッシュの背側筋、微調整を使用して、x 軸と y 軸に近い約 45 ° の角度ホイール変えればエンブリオバイオプシーに対応。</li>
	<li>針を進めて、力を要求しない、背びれの前にスケールすることがなく小さな場所を見つけます。抵抗が感じられる場合は、隣接するスポットをみてください。避けるためにスケールや背鰭の付け根、背骨を負傷します。 注: 針を押しながら曲げる場合、は、針をそれを切断することによって少し短きます。</li>
	<li>徐々 にワクチン ソリューションを筋肉に注入するのにフット スイッチを使用します。注射を顕微鏡で観察する: 筋肉組織に入る、フェノールレッドが見える。必要な場合は、パルスの持続時間を調整します。 注: また、注入用空気圧ポンプのフロント パネルのパルス発信側ボタンを使用します。ただし、リモートのフット スイッチの使用は、10 回転ダイヤル ホイールによるパルスの長さを調整するための他の手を使用してできます。これは、過剰な組織の損傷を引き起こす可能性がありますも高速ソリューションを注入することを避けてください。任意の空気を挿入してはならないことを確認します。</li>
	<li>Electroporate 注射後すぐに魚。魚がまだ麻酔であることを確認します。スポンジで魚を維持し、注射部位の両側に電極が配置されるようピンセット型の電極間に魚を設定します。きつすぎる電極ピンセットを押さないが、魚との接触の両方の電極を保ちます。<ol>
<li>6 40 V、50 ms のパルスを与える遺伝子導入装置のスタート ボタンを押します。</li>
		<li>そっと魚を回収タンクに転送します。</li>
		<li>70% エタノールを swiping によって各エレクトロポレーション後電極を掃除します。 注意: 慎重に接種後魚の福利を監視します。不快感の兆しを見せて魚を安楽死させる (麻酔、異常から回復が遅い水泳、あえぎ) 0.04 %tricaine で。回復後、フロースルー ユニットに魚を転送、通常それをフィードします。</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 可視化と抗原の発現のイメージング
<ol><li>予防接種後 2-7 日 0.02 %tricaine で魚を麻酔し、UV ライトを使用して、注射部位の近くの EGFP 発現を参照してください。 注: UV 光の下で目視検査、大規模実験にも成功したの予防接種、定期的検証に適している簡単かつ非侵襲的操作です。魚の画像が必要ない場合は、麻酔や魚を移動することがなくレギュラー水槽でこの手順を実行することも。</li>
	<li>画像をキャプチャするのにには、射出サイト8の EGFP 発現を可視化するのに蛍光顕微鏡を使用します。2 X 対物レンズを使用し、蛍光または可視ライトのビューを可視化する適切なフィルターを選択します。</li>
	<li>腹ひれをシャーレの底に向かってピンセットで軽く押して、まだ麻酔下の魚を保ちます。同じ面積の光顕微鏡と蛍光画像を取る。</li>
	<li>29適切なソフトウェアを使用して光顕微鏡と蛍光画像をマージします。スケール バーを追加します。</li>
</ol>7 発現量と抗原の大きさの定量化
<ol><li>0.04 %tricaine で魚を安楽死させます。メスとピンセット紫外光下背側の筋肉の蛍光灯の一部を解剖します。サンプル8からタンパク質を抽出します。</li>
	<li>体内の正しいサイズを確認-西部のしみの分析は、西洋ワサビペルオキシダーゼ (HRP) を使用して蛋白質を作った-共役 GFP 抗体 (または類似の)8。融合抗原なし背景信号と EGFP の発現制御との非特異的結合を除外するネガティブ コントロール (unimmunized 魚) が含まれます。 注: 西部のしみの分析のため抗原融合蛋白質 (kDa) の予想サイズ計算できます、たとえば、式で。 DsDNA の分子量 (MW) = (607.4 x ヌクレオチドの数) + 157.9;または web ベースのツールを使用しています。</li>
	<li>GFP ELISA8 (オプション) を使用して各抗原の発現を定量化します。</li>
</ol>8 m ・ marinum感染症モデルで予防接種プロトコルを組み合わせること
<ol><li>感染症モデルおよび使用法の新規ワクチン候補の有効性の信頼性の決定に必要なグループのサイズを決定する (たとえば、Myllymakiらを参照してください。24とチャラン ・ Kantharia30)。実験を計画している間適切な検出力の計算を行います。</li>
	<li>候補者ワクチンの有効性を評価するには、魚 5 週間 postimmunization に感染します。M. marinumほとんどの潜在的な感染につながる魚8,20,31の約 30 コロニー形成単位 (cfu) と腹腔内感染を使用します。 メモ: M. marinumを使用している場合、BSL2 安全プロトコルに従ってください。細菌やウイルスの準備は、病原体によって異なります。</li>
	<li>それぞれの魚の病原体の数を定量化します。感染魚 4 週間後を安楽死させるし、qPCR M. marinum20,24の特異的なプライマーから DNA を抽出し、それぞれの魚の細菌負荷を決定します。 注: 必ず適切な制御グループを含めるし、正しい統計メソッドを使用して結果を分析してください。通常、空 pCMV EGFP プラスミドで免疫した魚のグループは、適切なネガティブ コントロールです。</li>
	<li>GFP タグなし抗原と肯定的な結果を確認します。手順 1 で説明した抗原のクローンを作成し、予防接種の実験を繰り返します。</li>
</ol>

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大人のゼブラフィッシュ DNA 基づかせていたワクチンとの免疫の手順には、いくつかの技術的な専門知識が必要です。経験豊富な研究員の準備を除く約 3 分を取る 1 つの魚を接種します。したがって、約 100 の魚の最大の免疫は、日以内に。100 以上の魚は、実験のために必要がある場合は、3 日前までの間予防接種を分けることができます。実験の品質に加えて、もっとも魚を処理し、予防接種を実行するための十分な訓練は魚の幸福にとって不可欠です。ときは住宅計画、実験と実験を行う者に必要な資格、魚、地元の法律や動物福祉規則とガイドラインに従うことを確認してください。
要約すると、予防接種プロトコルでは合併症を避けるためにいくつかの重要な手順があります。成功した予防接種することを確認1)免疫になる魚が健康で十分な年齢とサイズ (より稚魚の予防接種にダウン スケール ワクチン ボリュームとエレクトロポレーション設定が必要することができます)。2)魚が正しくない麻酔 0.02 %3-アミノ安息香酸エチルより強い彼らのプロシージャ全体で麻酔をかけられたまま (麻酔を保持する魚の回復を確実に可能な限り短い)3)スポンジ パッドが正しくずぶぬれ;4)空気圧ポンプから各パルスで液体を注入し、パルスの長さが調整されていない場合 (y 軸に沿って少し後方針を引っ張って助けることができる);5)ワクチン ソリューションと気泡がないです。6)エレクトロポレーションの設定と実際のパルス電圧および長さが正しい;7)電極損害を与えるない皮膚エレクトロポレーション敷地 (エレクトロポレーション、維持電極が穏やかで、魚との接触、エレクトロポレーション後すぐに回収タンクに魚をリリース)。
汚水回収タンクでエレクトロポレーション後魚を監視し、不快感の兆しを見せて魚を安楽死させるのには重要です。さらに、流暢なワークフローを確保するための大規模な実験を開始する前の手順を練習する必要は。可能であれば、針や、エレクトロポレーションを充填の援助を十分に訓練を受けた同僚を求めます。
DNA のワクチン接種方法には、ワクチン抗原のオーダーメイド設計ができます。全体の抗原のクローンを作成または、好ましくは、細胞の局在と免疫原性24に基づいて抗原の部分を選択することが可能です。さらに、メソッドは、1 つワクチン構成にいくつかの抗原やアジュバントを組み合わせてまたは同じ time2にいくつかの独立したプラスミドを注入できます。抗原シーケンスの後停止コドンを含むかプラスミッドから EGFP 遺伝子を切除によって、後続の N 末端 GFP タグなし抗原を表現するためにも同じプラスミッドのベクトルを利用することが可能です。これは、GFP のサイズが比較的大きいことができる抗原の折りたたみ影響を与えるし、したがって、可能性のある予防接種により誘発される体液性応答を制限する肯定的な審査結果を確認することに合理的な可能性があります。
高い抗原の発現は、DNA ワクチンの免疫原性2にリンクされています。4 倍抗原またはからレポーター遺伝子の発現を増強する示されているように、注射後エレクトロポレーションこのプロトコルに含まれているはしたがって、ゼブラフィッシュ32で 10 倍に。さらに、エレクトロポレーション技術としてこうしてワクチンによる免疫応答2をさらに促進する局所の炎症を誘導、適度な組織の損傷が発生します。その一方で、エレクトロポレーションは一般的によく容認です。ここで使用される機器、実質的に大人のゼブラフィッシュの 100% は 40 でこのプロトコル35V の 6 パルスからよく回復します。
エレクトロポレーションを使用すると、セルにワクチン プラスミドのエントリを強化、に加えて、ワクチン プラスミッドおよびポリア尻尾での強力なユビキタス プロモーターの使用抗原の 3' 終わりに transfected 魚類細胞の抗原の表現を向上させる。いくつかのケースで大幅ワクチン接種種と異なる場合は対象病原体のコドン コドン最適化見つかってターゲット遺伝子の表現の2のさらなる向上に役に立つ。このゼブラフィッシュ -M. marinumモデルで、コドン最適化イースト 6とCFP-10、 2 つの抗酸菌モデル遺伝子の発現レベルに重大な影響がなかったし、したがってと判断されているこのモデル35 で不要です.
ターゲット遺伝子発現プロファイルによっては、インスタンスのサイズと問題の抗原の構造上、抗原の間いくつかの変化があります。しかし、抗原の発現は、同じワクチンで免疫した魚のグループ内で通常似ています。通常、最も明るい EGFP 発現観察 4 日 1 週間 postvaccination に、2-10 日のスケールが可能です。大規模な実験では、抗原を含む前に魚 (2-3) の小さいグループである各抗原 EGFP の融合蛋白質の表現を検証することをお勧めします。GFP 発現が観測されない任意の時点で予防接種後 2-10 日場合、ことを確認1)免疫プロトコルは慎重に続いた。常に肯定的な制御として空 pCMV EGFP プラスミドで免疫した魚のグループがあるし、ことを確認2)抗原デザインおよび分子クローニングは正しく遂行された (適切なプライマー デザイン; 抗原と EGFP タグ両方が同じリーディング ・ フレームとない介在停止コドンとなる含まれます)。正しい抗原デザインにもかかわらず、いくつかのケースでは、GFP が検出できません。これは誤った折りたたみまたは融合蛋白質の急速な破壊が原因かもしれません。このような状況では、抗原を再設計する必要があります。
養殖魚を予防接種に使用されるワクチンに使用されるプラスミド用量は通常 1 μ g またはより少ない7,33,34。レポーター遺伝子の発現は、ゼブラフィッシュ、次のエレクトロポレーション; 少なくとも 0.5 μ g のプラスミド注射後も検出できます。ただし、相対的なターゲット遺伝子発現は魚 (補足図 1) あたりプラスミドの高い量が大幅増加します。魚 pCMV EGFP 記者プラスミドを注入で 0.5 μ g を注入した魚と比較してレベルの高い EGFP 8 回に 4 つのプラスミドの 5-20 μ g を注入しました。したがって、十分に高くターゲット遺伝子発現を確認ながらワクチン漏れは十分に小さい (≤7 μ L) 過剰な組織損傷を防ぐため、注入量を持つこと、我々 は予備審査用魚あたり 5 に 12 μ g を使用しました。ワクチンの免疫原性、蛍光顕微鏡と西部のしみ、レポーター遺伝子の発現を検出する十分なターゲット遺伝子発現が必要高に加えてスクリーニング目的のため生体内で正しいことを確認する必要があります。標的抗原の翻訳。ただし、線量の低いプラスミド (0.5 – 1 μ g)、実験用途の他のタイプに便利です。
結論としては、さまざまな細菌やウイルス感染症に対する新しいワクチン接種の候補者の前臨床試験で DNA のプラスミッドと大人のゼブラフィッシュの予防接種のためこのプロトコルを使用できます。GFP 融合タンパク質としてワクチン抗原の発現は、予防接種の成功イベントと抗原発現の可視化できます。この結核に対する新規ワクチンの抗原候補の前臨床スクリーニング法を適用します。このため、私たちはゼブラフィッシュ 5 週間 postvaccination に感染し、細菌カウント qPCR20,24それぞれの魚を決定します。

1990 年代に1で最初の DNA ワクチン研究を行った、それ以来、DNA ワクチンは、様々 な感染症、癌、自己免疫疾患、およびアレルギー2に対してテストされています。哺乳動物で、馬のウエスト ナイル ウイルスに対する DNA ワクチンとイヌ口腔悪性黒色腫のがん治療用ワクチンがライセンスされているが、これらは現在臨床使用2。哺乳類研究により誘発される利息に加えて DNA ワクチンがウイルス性疾患と養殖魚の免疫する便利な方法であると判明します。2005 年以来、商業利用されている魚伝染性造血器壊死症ウイルス (IHNV) に対するワクチンと伝染性膵臓壊死症ウイルス (IPNV) に対するワクチンは最近認可された3。さらに、魚の病原体に対するいくつかの DNA ワクチンが開発されています。
従来のワクチンはしばしば、不活化またはライブ弱毒病原体を含む、彼らは病気2を送信する潜在的な危険性をもたらします。彼らは全体の病原体自体ではなく、細菌やウイルスの抗原を2,4エンコード プラスミドの管理に基づいているため DNA ワクチン、ターンでは、このリスクを回避します。DNA ワクチンは、単一ワクチン構成5ワクチン抗原の精密な設計および抗原の組み合わせやアジュバントの柔軟な定式化を可能にする DNA 組換え技術で生産されています。さらに、DNA ワクチンの生産はより速くより簡単に、タンパク質ベース組換えワクチン、ワクチン候補スクリーニング目的のため、また、パンデミック発生の場合の例の主要な利点はよりコスト効率2。
魚、DNA ワクチンの最も一般的な投与経路、筋肉内投与、腹腔内および経口3,6、7中、に哺乳類の皮下、皮内ルート追加オプション2。筋肉内注射をした後投与の DNA プラスミド入力管理サイトにあるセル (e.g。、主細胞、しかしも居住者抗原提示細胞 [Apc])。エレクトロポレーション2,8transfected セルの割合を大幅に改善できます。セルを入力した後、いくつかのプラスミド DNA はプラスミッドによって符号化される遺伝子が転写2核に入る。このプロトコルでは、真核生物式9用に最適化された強力なユビキタス プロモーターを持つ pCMV EGFP プラスミドを利用します。このコンス トラクターには、抗原は、GFP との融合タンパク質として変換されます。GFP 活魚の蛍光顕微鏡による抗原の発現の単純な可視化による成功したワクチン接種と正しい抗原製品の確認をできます。
哺乳類の DNA ワクチンを transfected セル型2,5によって免疫応答の種類を刺激するために示されています。トランスフェクション細胞抗原を細胞外に分泌や Apc によって包まれている抗原が主要組織適合遺伝子複合体 II 分子2に表示されて、その後、細胞死にそれらを解放します。これは B 細胞の応答2,5,10に加えて特に、CD4 および CD8 T 細胞の応答をトリガーします。魚、T および B リンパ球と樹状細胞 (Dc)、識別されている、まだ抗原提示の分業はあまりよく理解されて11。ただし、ゼブラフィッシュ Dc は、哺乳類の対応12の省の表現型および機能特性を共有する示されています。さらに、DNA ワクチンは、T および B 細胞の応答6,13,14,15,16 を含む哺乳類、魚と同様の免疫反応を引き出すために示されています。.
両方の幼虫と大人のゼブラフィッシュ モデル別の感染症結核このプロトコル17,18,19,20 で使用の魚・ m ・ marinum感染症モデルなどに幅広く使われて ,21,22。哺乳類のモデル生物と比較してゼブラフィッシュのメリットは、サイズが小さく、高速な再現性と低いハウジング費用23。これらの側面は、ゼブラフィッシュに新規ワクチンや医薬品化合物23,24,25の大規模な前臨床スクリーニング研究のための理想的な動物モデルを作る。
このプロトコルではアダルト ゼブラフィッシュ DNA に基づくワクチン接種による抗酸菌症に対して候補者を評価できる方法新規ワクチン抗原をについて説明します。まず、我々 は筋にワクチン プラスミドと後続のエレクトロポレーションの筋肉内注射のための詳しいプロトコルが続いて pCMV EGFP 発現プラスミドに抗原を複製する方法について説明します。各抗原の発現は、蛍光顕微鏡 1 週間 postimmunization によって確認されます。M. marinum魚のワクチン接種を実験的に感染させることによって、抗原候補の有効性がテストされます。

<table><tbody><tr><td>pCMV-GFP プラスミド</td><td>Addgene</td><td>#11153</td><td></td></tr><tr><td>2-プロパノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>278475-2L</td><td>DNA抽出</td></tr><tr><td>アンピシリン ナトリウム塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0166-5G</td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>メルク</td><td>1.02445.2500</td><td>DNA抽出</td></tr><tr><td>ECM エレクトロスクエアポレーター</td><td>BTXハーバード装置</td><td>BTX ECM 830</td><td></td></tr><tr><td>FastPrep-24 5G</td><td>MPバイオメディカル</td><td>116005500</td><td>ホモジナイザー</td></tr>フ<tr><td>レーミング/ブラウンマイクロピペットプーラーSutter</td><td>Instrument Co.</td><td>P-97</td><td>針の引っ張り</td></tr><tr><td>GeneJet PCR Purification kit</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>K0701</td><td></td></tr><tr><td>GFP ELISA kit</td><td>Cell Biolabs, Inc.</td><td>AKR-121</td><td></td></tr><tr><td>グアニジンチオシアン酸 (FW 118.2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9277-500G</td><td>DNA抽出</td></tr><tr><td>ImageJ2</td><td>imagej.net/Downloads</td><td></td><td>無料ソフト</td></tr><tr><td>LB寒天</td><td>Σ</td><td>L2897-1kg</td><td></td></tr><tr><td>LBブロス(ミラー)</td><td>Σ</td><td>L3522-1kg</td><td></td></tr><tr><td>マイクロマニピュレーター</td><td>成重</td><td>MA-153</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>AZ100</td><td>蛍光顕微鏡</td></tr><tr><td></td><td>顕微鏡 オリンパス</td><td>ZS61</td><td></td></tr><tr><td>ナイトシー フルアダプターシステム w/ロイヤルブルー カラー ライトヘッド</td><td>電子顕微鏡 科学</td><td>SFA-RB</td><td></td></tr><tr><td>PBS錠</td><td>VWR ケミカルズ</td><td>E404-200TABL.</td><td></td></tr><tr><td>フェノール赤ナトリウム塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114537-5G</td><td></td></tr><tr><td>PV830 フネマチックピコポンプ</td><td>WPI</td><td>SYS-PV830</td><td></td></tr><tr><td>QIAGEN プラスミド マキシキット</td><td>Qiagen</td><td>ID:12163</td><td>プラスミド抽出</td></tr><tr><td>クエン酸ナトリウム (FW294.1)</td><td>VWR Chemicals</td><td>27833.294</td><td>DNA extraction</td></tr><tr><td>Tri Reagent</td><td>Molecular Research Center, Inc.</td><td>TR 118</td><td>DNA抽出</td></tr><tr><td>トリカイン(エチル3-アミノ安息香酸メタンスルホン酸塩)</td><td>シグマ</td><td>A5040-100g</td><td>動脈および安楽死液</td></tr><tr><td>トリス(自由塩基)(FW121.14)</td><td>VWRライフサイエンス</td><td>0497-500G</td><td>DNA抽出</td></tr><tr><td>ピンセット電極(7 mm)キット</td><td>BTXハーバード装置</td><td>BTX 450165</td><td>ピンセットタイプ電極</td></tr><tr><td>2.8 mmセラミックビーズ</td><td>オムニインターナショナル</td><td>19-646-3</td><td>DNA 抽出</td></tr><tr><td>2 mL キャップ付きタフチューブ</td><td>オムニインターナショナル</td><td>19-649</td><td>DNA 抽出</td></tr><tr><td>アルミノケイ酸キャピラリー</td><td>ハーバード製装置</td><td>30-0108</td><td></td></tr><tr><td>マイクロローダー 20 & マイクロ;L</td><td>eppendorf</td><td>5242956.003</td><td>ローディングチップ</td></tr><tr><td>シャーレ、16 mm</td><td>Sarsted</td><td>82.1473</td><td></td></tr><tr><td>メス</td><td>Swan Morton</td><td>0501</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td></td><td>実験室 フィルム</td></tr><tr><td>ピン</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>プラスチック スプーン</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ヘラ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>スポンジ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>発泡スチロールワークベンチ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ピンセット</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

大人のゼブラフィッシュの dna 基づかせていたワクチンの前臨床スクリーニングのため予防接種

Immunization of Adult Zebrafish for the Preclinical Screening of DNA-based Vaccines

DNA に基づく予防接種への関心は、過去 20 年間に増加しています。DNA ワクチンは、一連の選択した抗原または抗原の組み合わせをオーダーメイドで安全な設計を可能にするプラスミドにクローニングに基づいています。宿主細胞に DNA ワクチンの投与は、体液性および細胞性免疫応答を刺激する抗原の発現に します。このレポートでは、抗原のシーケンス pCMV EGFP プラスミド、摂取量を改善するために筋肉内マイクロインジェクションと後続のエレクトロポレーションによるワクチン候補者と成人のゼブラフィッシュの予防接種のクローニングのためのプロトコルについて説明します。ワクチン抗原、緑色蛍光タンパク質 (GFP) として表されます-融合蛋白質として生きた魚と同様、elisa 法による融合タンパク質の発現レベルの定量化から紫外線の下で抗原の発現の確認を可能にします。西部のしみの分析と検知します。ワクチン候補の保護効果は結核菌 marinum 5 週間 postvaccination で魚を感染させることによってテストが続いて qPCR で細菌の数量化による 4 週間後。哺乳類の前臨床スクリーニング モデルに比べると、このメソッドは、抗酸菌感染症に対する新規 DNA ワクチン候補者の選考のためコスト効果の高い方法を提供します。メソッドは、さまざまな細菌やウイルスの病気に対する DNA 基づかせていたワクチンをスクリーニングにさらに適用できます。

アダルト ゼブラフィッシュ DNA のワクチン接種のプロトコルに関連する手順は図 3に示します。最初に、選択した抗原シーケンスが pCMV EGFP プラスミドに複製され、プラスミド DNA が生成され24 (図 3) を精製しました。ワクチン候補は、マイクロインジェクターを筋肉注射して、注射部位 (図 3) のセルにプラスミッドの摂取量を改善するために electroporated。使用されるワクチン接種用量 pCMV EGFP プラスミドのさまざまな量を注入して elisa 法による (補助図 1) GFP 発現を測定して最適化を行った。7 日間 postvaccination、融合タンパク質の発現に 2 つは紫外線の下で検出され (図 3および図 4) の蛍光顕微鏡による可視化します。異なった抗原の発現レベルは非常に異なりますが集中 (抗原 1) にかすかな式 (図 4)。(抗原 1) の背側の筋肉の間またはもっと限られた地域 (抗原 2) さらに、GFP の発現が観察できる (図 4)。ただし、10 日以内蛍光を検出されない場合はお勧め抗原クローニングやプライマーの設計に間違いがないことを確認します。表現された融合タンパク質の正しいサイズの確認、蛋白質は注射部位周囲の筋肉組織から抽出し、西部のしみの分析に使用できます。
ワクチン候補の効果を評価するには、腹腔内注入 (図 5) M. marinumの低線量で魚に挑戦.4 ~ 5 週間感染後細菌数 qPCR で決定されますが、細菌の負荷制御グループ (図 5) と比較します。高用量・ m ・ marinum感染症(図 5後生存率を監視することによって最も有望なワクチン候補の有効性をテストことができますさらに、)。しかし、生きているか、死んでいるの状態だけではなく、感染症の進行に対する定量的な結果を与えることに加えて qPCR ベース cfu 数量より少ない時間を必要とするサイズを小さいグループし、は、したがって、プライマリより倫理的なアプローチ画面。全体的にみて、このプロトコル (図 5) 12 週間以内新規ワクチン抗原の有効性の審査が容易になります。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58453/58453fig1.jpg"> 図 1: クローズ アップ (12 X) アルミノケイ酸塩針アダルト ゼブラフィッシュ筋肉内注射で使用します。以下のヒントは、ピンセットでカットされているし、薬剤に使用する準備ができています。この図は、Oksanen35から適応されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58453/58453fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58453/58453fig2.jpg"> 図 2: マイクロインジェクション装置およびセットアップします。アダルト ゼブラフィッシュ DNA ワクチン接種に必要な装置の主要なコンポーネントは太字で強調表示されます。重要な調整が示されます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58453/58453fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58453/58453fig3.jpg"> 図 3: プラスミド ワクチンと予防接種のプロシージャを準備します。(1) 選択した抗原の pCMV EGFP プラスミドの GFP タグに隣接してクローンを作成します。(2) ワクチン構成は微生物生産、濃縮し、精製します。(3) 12 μ g のプラスミドをマイクロインジェクターと麻酔大人ゼブラフィッシュの背側の筋肉に注入し、注射部位はその後 6 40 V、50 ms のパルスを electroporated。(4) 2 ~ 7 日 postvaccination、抗原 GFP 融合タンパク質 GFP 発現は蛍光顕微鏡で可視化します。(5) 蛍光部背側の筋肉を解剖して蛋白質の抽出に使用できます。西部のしみの分析と GFP elisa 法による発現レベルで融合タンパク質のサイズを確認しました。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58453/58453fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58453/58453fig4v2.jpg"> 図 4: 抗原 EGFP 融合タンパク質の発現を可視化します。麻酔大人ゼブラフィッシュは実験的ワクチン抗原 (抗原 1-3) の 12 μ g と予防接種し、注射部位は electroporated、その後、6 40 V、50 ms パルス。7 日間 postvaccination、注射部位に 2 つの顕微鏡のイメージを作成します。最初に、GFP の発現は、蛍光顕微鏡下で検出されます。2 X の大きさの目標を使用してイメージを作成および .tiff 形式で保存領域が検査されます。同じエリアの光学顕微鏡画像は、ImageJ ソフトウェアを使用して蛍光画像とマージされます。抗原と個々 の魚の量と抗原の発現の位置が異なります。たとえば、背側の筋肉の間 1 抗原の発現が観察され、抗原 3 強くより限られた地域で表されるに対し、2 抗原の発現は小さな白い斑点と見られています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58453/58453fig4v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58453/58453fig5.jpg"> 図 5: 抗酸菌感染に対するワクチン候補の有効性をテストします。大人 (1) ゼブラフィッシュ、抗酸菌症に対する実験的 DNA ワクチンとワクチンを接種します。(2) 5 週間 postvaccination、魚が結核菌 marinum (~ 30 cfu) の低用量に感染しています。(3) 4 週間後、内部臓器を切除し、DNA の抽出に使用されます。それぞれの魚の細菌数 (4) M. marinumを使用して qPCR で定量化され、-特異的プライマー。抗原 1 抗原 2、3 中細菌数 (p &lt; 0.01、二元) の大幅な減少につながったと予防接種には効果がなかった。最も有望なワクチン候補 (抗原 1) の (5) の保護効果は、生存実験、魚の細菌の高用量 (~ 10,000 cfu) に感染している、彼らの生存は 12 週間の監視でさらに評価されます。細菌の負担の減少に一致して観察パネル4抗原 1 ワクチン接種はまたM. marinum感染魚の生存を改善 (p &lt; 0.01)、この抗原を示唆していることができる有望な新しい結核ワクチンの候補。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58453/58453fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure S1" src="/files/ftp_upload/58453/58453figS1.jpg"> 補足図 1: プラスミッド DNA の量に影響を与える大人ゼブラフィッシュの EGFP 発現をプラスミド由来します。魚のグループ (n = 各グループ 5) pCMV-EGFP の 0.5-20 μ g を注入した、エレクトロポレーション (50 V の 6 パルス) は、トランスフェクションを強化する使用されました。コントロール (CTRL) 魚は EGFP 遺伝子を含まない空の pCMV プラスミドの 2 μ g を注入しました。GFP ELISA は、魚の乳剤の相対の EGFP 発現を定義する実行 3 日間これらをだった。P-値: *p &lt; 0.03、* *p &lt; 0.004 です。誤差範囲は、標準偏差を表しています。NS = 重要ではないです。この図は、Oksanen35から適応されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58453/58453figS1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

DNA ワクチンと大人ゼブラフィッシュ (動脈分布) の予防接種のためのプロトコルについて述べると予防接種の成功イベントの検証方法を説明。このメソッドは、さまざまな感染症モデルにおけるワクチン候補の前臨床スクリーニングに適しています。

大人のゼブラフィッシュの DNA 基づかせていたワクチンの前臨床スクリーニングのため予防接種

The interest in DNA-based vaccination has increased during the past two decades. DNA vaccination is based on the cloning of a sequence of a selected ...

このプロトコルを使用して結核に対する新しいワクチン候補を探しますが、私は他の感染症にも適用できます。哺乳類モデルと比較して、この方法は、新規DNAベースワクチン候補の予備スクリーニングのための費用対効果の高い手順を提供する。この手順のデモンストレーションは、私たちの研究室の技術者であるハンナレナ・ピッポです。まず、ガラスの毛細管を極棒のV溝にセットし、クランプノブを軽く締めます。ホルダーをフィラメントの隣に移動し、フィラメントを通してフィラメントの反対側の極性バーにキャピラリーを軽く押し込みます。次にクランプノブを締め、安全ガラスを下ろし、プルボタンを押します。この後、針の先端を保護するためにペトリ皿の中に再利用可能な接着剤の一部に針を置きます。まず、1回当たり0.5~12マイクログラムのプラスミドを使用して注射ミックスを調製する。グループ内の魚の数に合わせて、マスターミックスの適切なボリュームを準備します。毛細血管の針をテープの粘着性のある側に適切なホルダーに置きます。次に、プラスミド用量のピペット液滴を実験室フィルムの一部にする。この後、フィルムからプラスミド滴を針に移すためにローディングチップを使用します。ピペットはゆっくりと慎重に、針に空気の泡をピペットを避けます。マイクロマニピュレータと光源を配置します。次に、空気圧タップを開いた位置に切り替えます。マイクロインジェクタフロントパネルでは、タイミングモードを使用してパルス長を10秒に調整します。次に、10ターンの周期ダイヤルでパルス長を微調整します。次に、マイクロマニピュレータのマイクロピペットホルダーに針をセットします。ピンセットを使用して針の先端を切り取り、液体を押し出し、顕微鏡を使用して針の位置を評価します。リモートフットスイッチを1回押して、1秒間のパルスが小さな液滴を針から押し出すことを確認します。次に、エレクトロポレーターの設定を調整し、ピンセットをエレクトロポレーターに接続します。注射中に一定の位置に魚を保つためにパッドとして中央に切られた溝とスポンジの一部を使用してください。スポンジをシステムウォーターに十分に浸し、ペトリ皿に入れます。プラスチック製のスプーンを使用して、麻酔をしたゼブラフィッシュを濡れたスポンジに移し、魚の腹側を溝に下に置きます。顕微鏡の下で、ゼブラフィッシュの背部筋肉に近い45度の角度で針を置き、背びれの前に鱗のない小さな場所を見つけ、針を筋肉に押し込みます。抵抗が感じられる場合は、隣接するスポットを試してみてください。徐々にプラスミド溶液を筋肉に注入するために、フットスイッチを使用してください。顕微鏡下では、フェノールレッドは筋肉組織に入ると見えるはずです。注入部位の両側にツイーザー型電極を配置して、射出直後に魚を電気ポレートする。エレクトロポレーターの開始ボタンを押して、6つの40ボルト50ミリ秒のパルスを与えます。その後、魚を回収槽にそっと移します。最後に、テキストプロトコルに従って魚を麻酔した後、UV光を使用して、注入部位の近くでEGFP発現を見る。このプロトコルでは、DNA抗原を発現ベクター中のGFPに隣接してクローニングした。ゼブラフィッシュは、マイクロインジェクターを用いてDNA抗原プラスミドを筋肉内に注射し、細胞内へのプラスミドの摂取を改善するために注射部位を電気ポポレートした。イメージングの場合、抗原発現は蛍光顕微鏡で可視化できます。この場合、3つの抗原全てのGFP融合タンパク質の発現は、その強度は様々であったが、注射部位の近くで検出された。マイコバクテリア抗原による免疫化から5週間後、ゼブラフィッシュはマイコバクテリウムマリナムに感染した。QPCRは、感染後4週間で各魚の細菌の負担を決定するために使用されました。対照群と比較して、抗原1で免疫された魚は、M.marinumによる感染後の細菌負荷の減少を示した。この方法を行う上で、慎重にプラスミド構築物を設計し、抗原の発現を検証し、大規模な実験の前に注入技術を実践することが重要である。この技術は、成体ゼブラフィッシュにおける新規DNAベースワクチン候補の費用対効果の高い前臨床スクリーニングへの道を開くことができる。動物の福祉は非常に重要であり、この手順を実行する間適切な麻酔が不可欠であることを忘れないでください。

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