Name: 周囲温度、77 K で生体試料の電子常磁性共鳴の使用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-11T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: 学ぶ 生体試料の電子常磁性共鳴（EPR）分光法によるフリーラジカル測定法。スピンプローブを用いた活性酸素種の検出と試料処理プロトコルについて、酸化還元生物学研究への応用を含めて解説します。

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この作品は、コロラド大学大学院医学研究科長の戦略的研究基盤賞、R01 HL086680-09 ・ 1R35HL139726-01、E.N.G.、UCD CFReT 奨学 (彼) によって支えられました。著者に感謝博士サンドラ イートンと博士ギャレス イートン (デンバーの大学)、博士ジェラルド ローゼンと博士ジョセフ p. 花王 (メリーランド大学)、博士スジャータ ベンカタラマン (コロラド大学デンバー) 役に立つ議論のためジョアン Maltzahn、アシュリーTrumpie とアイビー ・ マクダーモット (コロラド大学デンバー) のテクニカル サポート。

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<li>Chen, K., Swartz, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidation+of+Hydroxylamines+to+Nitroxide+Spin+Labels+in+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Oxidation of Hydroxylamines to Nitroxide Spin Labels in Living Cells.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 970 (3), 270-277 (1988).</li>
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生物学的設定でフリーラジカル産生の評価は理解の酸化還元規制で、健康と病気、シグナル伝達で重要ですがこれらの種の測定が高いフリーラジカル種の半減期が短いために挑戦と技術一般的に使用されるメソッドの制限。フリーラジカルの検出のためだけに明確な方法である、EPR は酸化還元の生物学で貴重な強力なツールです。このプロジェクトは、実験計画と異なる細胞コンパートメントの in vitroと異なる組織コンパートメントで ROS スピンを使用して、プローブを検出するためのサンプルの準備の実践的 EPR 方法を示す体内。我々 はまた生体試料を処理し、効率を改善するためにサンプルを格納する実用的な方法を提供します。
スピン プローブと ROS 効率的に反応する EPR で検出できる安定ニトロキシドラジカルを生成します。スピン プローブ (繰返しヒドロキシルアミン) のいくつかの誘導体は、異なる細胞コンパートメント10のフリーラジカルの検出に最適です性別透水特性と合成されています。このプロトコルは細胞膜透過性のスピン プ...

酸化ストレスと活性酸素の対策がすべての器官システムで多様な病気の研究に重要な活性酸素種 (ROS) の検出は、半減期が短いと高い反応性のために挑戦。電子常磁性共鳴 (EPR) 法は、フリーラジカルの検出の最も明白な方法です。スピン プローブより一般的に使用される蛍光プローブ上の利点を持っています。蛍光プローブは、比較的安価で使いやすく、活性酸素の急速な敏感な検出を提供するが、彼らは人工信号、ROS 濃度と特異性1 の一般的な不足を計算することができないことに起因する深刻な制限を持ってください。.
EPR の生物学的研究のための使用を容易にするさまざまな生物学的関連性の高いフリーラジカル種と同様、pO2pH、酸化還元の範囲を測定できるプローブを合成されているスピン状態2,3, 4,5,6,7。スピン トラップは、短寿命ラジカルをキャプチャするため開発されているし、フォーム長期的付加、EPR8によって検出を容易にします。両方のクラス (スピン プローブとスピン トラップ) の利点と制限があります。スピン プローブの 1 つの一般的に使用されるクラスは、EPR サイレントと安定したニトロキシドを形成する短寿命ラジカルと反応して環状の hydroxylamines です。繰返し hydroxylamines 反応スーパーオキシドと 100 回スピン トラップ、細胞酸化防止剤との競争にそれらを有効にするよりも高速が彼らは特異性がないし、適切なコントロールとラジカルまたはソースを識別する阻害剤を使用する必要ニトロキシド信号を担当します。スピン トラップ展示特異性、間と異なるスペクトル スーパーオキシド スピン トラッピングとラジカルの生分解しやすいパターンによって閉じ込められた種、彼らが遅い速度をある付加体します。スピン トラッピングのためのアプリケーションは、生物医学研究9,10、11,12,13で十分に文書化されています。
このプロジェクトの目的は実験を設計するための実用的な EPR 方法を示しますし、異なる細胞コンパートメント体外と異なる組織コンパートメント体内にプローブ スピンを使用して活性酸素を検出するサンプルを準備します。複数の原稿は、マウスモデルの解析の異なる細胞コンパートメントの体外およびプロセスの組織をターゲットに細胞膜透過性、細胞不浸透性、そしてミトコンドリア標的スピン プローブを使用して、これらの目標に関連するプロトコルを公開しています。14,15します正確なことを確認する別の細胞コンパートメントの in vitro 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH) スピン プローブを用いた活性酸素を測定するためのアプローチを検証することによって文献のこのボディに基づいて構築。測定、結果が偏る可能性があります潜在的な技術的な問題を強調表示します。我々 はまた CMH スピン プローブを用いた肺組織、気管支肺胞洗浄液、血で EPR 測定を実行するメソッドを提供します。これらの研究は、マウス組織を収穫する前に別のスピン プローブ、CPH を注入する手法し同様、組織を処理するさまざまな方法を比較します。最後に、ストレージの 77 K において EPR 測定前にサンプルの転送を許可するポリテトラフルオロ エチレン (PTFE) チューブのサンプルを格納するための実用的な方法を開発します。

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>LifeTech</td><td>10566-016</td><td>細胞培養培地</td></tr><tr><td>ジエチレントリアミン五酢酸 (DTPA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6518-5G</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム (NaCl)&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>&nbsp;BP358-212</td>は<td>、50 mMリン酸生理食塩水バッファーの調製に使用されました&nbsp;シグマアルドリッシュによる&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>リン酸二塩基性カリウム(HK2PO4</td>)<td>フィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>&nbsp;BP363-500</td>は<td>、50 mMリン酸生理食塩水バッファーの調製に使用されました&nbsp;シグマアルドリッシュによる&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>リン酸カリウム一塩基性(KH2PO4</td>)<td>Sigma Aldrich</td><td>P-5379</td><td>は、50 mMリン酸生理食塩水バッファーの調製に使用されました&nbsp; Sigma aldrishによると&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>クレブス・ヘンセライト緩衝地帯(KHB)&nbsp;</td><td>(Alfa Aesar, Hill)</td><td>J67820</td><td></td></tr><tr><td>ウシ赤血球スーパーオキシドジスムターゼ (SOD)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>&nbsp;S7571-30KU</td><td></td></tr><tr><td>ホルボール 12-ミリスチン酸 13-アセテート (PMA)&nbsp;</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>P1585-1MG</td>は<td>DMSO</td></tr><tr><td>アンチマイシンA(AA)</td>に溶解しますシ<td>グマアルドリッチ</td><td>A8674-25MG</td><td>エタノールに溶解し、ガラスバイアルに保存します(使用されるMWは4ロットの平均分子量です)</td></tr><tr><td>1-ヒドロキシ-3-メトキシカルボニル-2,2,5,5-テトラメチルピロリジン。HCl (CMH)</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>ALX-430-117-M050</td><td></td></tr><tr><td>1-ヒドロキシ-3-カルボキシ-2,2,5,5-テトラメチルピロリジン。HCl (CPH)</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>ALX-430-078-M250</td><td></td></tr><tr><td>1-Hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-テトラメチルピペリジン、1-ヒドロキシ-2,2,6,6-テトラメチル-4-[2-(トリフェニルホスホニオ)アセトアミド]ピペリジニウム二塩化物 ( mito-TEMPO-H)</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>ALX-430-171-M005</td><td></td></tr><tr><td>1-ヒドロキシ-2,2,6,6-テトラメチルピペリジン-4-イル-トリメチルアンモニウムクロリド。HCl (CAT1H)</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>ALX-430-131-M250</td><td></td></tr><tr><td>ヘパリン&nbsp;</td><td>Sagent Pharmaceuticals</td><td>NDC 25021-400-10</td><td></td></tr>塩化<tr><td>ジフェニルヨードニウム&nbsp;</td><td>シグマAldrich</td><td>43088</td><td></td></tr>デ<tr><td>フェロキサミンメシル酸塩</td><td>シグマAldrich</td><td>D9533-1G</td><td></td></tr><tr><td>Critoseal</td><td>ライカ</td><td>39215003</td><td></td></tr><tr><td>ブランド使い捨てBLAUBRAND&nbsp;マイクロピペット、intraMark</td><td>Sigma Aldrich</td><td>708733</td><td>キャピラリー</td></tr><tr><td>PTFE フラクショナル フッ素樹脂チューブ 3/16"外径 x 1/8インチID</td><td>NORELL</td><td>1598774A</td><td>テフロンチューブ&nbsp;</td></tr><tr><td>NMRサンプルチューブ用シリコーンゴムストッパー&nbsp;外径が4mm-5mm(内径3.2mm〜4.2mm)の薄肉チューブ用TS-4-5-SR</td><td>NORELL</td><td>94987</td><td></td></tr><tr><td>EMXnanoベンチトップESR分光計&nbsp;</td><td>Bruker BioSpin GmbH</td><td>E7004002</td><td></td></tr><tr><td>EMX NANO TISSUE CELL</td><td>Bruker BioSpin GmbH</td><td>E7004542</td><td></td></tr></tbody></table>

周囲温度、77 k で生体試料の電子常磁性共鳴の使用

Use of Electron Paramagnetic Resonance in Biological Samples at Ambient Temperature and 77 K

別の細胞およびティッシュ コンパートメントにおける活性酸素種 (ROS) の正確かつ特定の検出は生物学的設定におけるシグナル伝達レドックス調節の研究に不可欠です。電子常磁性共鳴 (EPR) は、フリーラジカルを明確に把握する唯一の直接の方法です。その利点は、高い特異性と特定の種の生理学的レベルを検出したが、データの正確な解釈を確保するため、専門的な技術、注意サンプル準備と適切なコントロールが必要です。繰返しヒドロキシルアミン スピン プローブは、スーパーオキシドまたは EPR 分光法によって定量することができますニトロキシド信号を生成するその他のラジカルと選択的に反応します。細胞膜透過性のスピン プローブおよび急速にミトコンドリアに蓄積するように設計スピン プローブ別の細胞コンパートメントに活性酸素濃度の測定を可能にします。
培養細胞、細胞透過性 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH) と一緒に、細胞不浸透性のスーパーオキシド ジスムターゼ (SOD) 前処理なしの使用または細胞膜透過性 PEG SOD の使用には、細胞内活性酸素から細胞の分化。ミトコンドリア 1-hydroxy-4-[2-triphenylphosphonio)-acetamido]-2,2,6,6-tetramethyl-piperidine,1-hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-[2-(triphenylphosphonio)acetamido] ピペリジ ニウム塩化 (水戸-テンポ-H) の測定が可能になりますミトコンドリア ROS (主に活性酸素)。
スピン プローブと EPR 分光は、体内モデルにも適用できます。活性酸素は、肺などの組織と同様、血液や肺胞液などの細胞外液に検出できます。EPR 測定のための組織を処理して静脈内 1-hydroxy-3-carboxy-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CPH) スピン プローブの生体を提供いくつかの方法が掲載されています。In vitroとin vivoモデルから得られた試料測定は室温で実行できますが、-80 ° C で保存および 77 K において EPR によって分析できるはまたサンプルは、特殊なチューブ安定-80 ° c で保存し、77 K、効率的、実用的を有効にして格納と転送のサンプルを容易に再現可能な方法で実行できます。

CMH を用いた活性酸素検出は、X を使用して検証された/XO 活性酸素生成カタラーゼの影響 (図 1 a) をしていた SOD、によって完全に、ニトロキシド (CM.) 信号抑制されたを示すためのシステム。合計、細胞の過酸化物は、SOD 前処理 +/-細胞膜透過性の CMH スピン プローブでインキュベーターの細胞によって未加工 264.7 のセルで評価されました。細胞懸濁液とバッファーは、2 つのサンプル型で値透水性自然とスピン プローブ (図 1 b) の急速な平衡のために類似していたことを示したニトロキシド濃度を測定しました。ニトロキシド根本的な信号制御の細胞と比較して PMA 刺激未加工 264.7 のセルで増加。この信号はだった細胞細胞不浸透性 SOD (図 1) で前処理の大幅減衰します。各色は、時間の経過と共に特定の日に収集されたデータの一貫性と結果の再現性...

電子常磁性共鳴 (EPR) 分光法は、フリーラジカルを測定する明確な方法です。選択的スピン プローブは、異なる細胞コンパートメント中のフリーラジカルの検出に使用します。治療、保存、および EPR 測定用サンプルを転送を容易にする生物学的サンプルを収集するために、実用的で効率的な手法を提案します。

周囲温度、77 K で生体試料の電子常磁性共鳴の使用

The accurate and specific detection of reactive oxygen species (ROS) in different cellular and tissue compartments is essential to the study of ...

調節不全酸化還元シグナル伝達は、多様な疾患の病因に関係する。レドックス生物学の研究では、異なる細胞および組織コンパートメントにおける活性酸素種の正確な検出が必要です。EPR分光法は、フリーラジカルを明確に測定する唯一の方法です。このプロトコルは、EPR分光法用の生物学的サンプルの取り扱いと保存のための実用的な方法を示す。これらのプロトコルは、2つの代表的なモデルにおけるEPRおよびスピンプローブの使用を示す。それらは他の生物的な設定で活性種を評価するように適合することができるが。実験の設計とサンプルの取り扱いは、再現性にとって重要です。セル密度を考慮し、適切な時間に一致するコントロールを確保することをお勧めします。生の264.7細胞を1ミリリットルのクレブス-ヘンセリートバッファーまたはKHBで穏やかに洗浄します。そして、KHBの500マイクロリットルで細胞を治療し、1ウェルあたり100マイクロミルのDTPAを補う。スーパーオキシドジスムターゼで退却するには、各ウェルに15マイクロリットルのスーパーオキシドジスムターゼストック(車両)を加え、プレートを摂氏37度で10分間置きます。スーパーオキシドジスムターゼ前処理の最後に、10ミリモルCMHの12.5マイクロリットルと125マイクロモルPMAの40マイクロモルPMA作業溶液を適切な井戸に加え、摂氏37度で50分間インキュベートします。すぐに氷の上にプレートを置き、氷の上の個々の1.5ミリリットルのチューブに各井戸から緩衝液を収集します。次に、新鮮なKHBとDTPAを100マイクロリットルずつ各ウェルに加え、各ウェルの底から細胞を静かに削ります。その後、ピペット処理で細胞懸濁液を再懸濁し、細胞を氷上の個々の1.5ミリリットルチューブに移します。室温でのスーパーオキシド検出のために、最初に1つのバッファーまたはセルサンプルの50マイクロリットルをキャピラリーチューブにロードし、チューブを密封します。直ちにチューブを電子常磁性共鳴(EPR、分光計)に入れ、室温測定用のEPR取得パラメータを設定します。常にコントロールと同じ実験条件下で処理されたプローブの同じ濃度を含むバッファのブランクサンプルをテストする。77度ケルビンでのスーパーオキシド検出の場合、1つのサンプルの150マイクロリットルをストレートポリテトラフルオロエチレン(PTFE、チューブ)の1~2インチにロードし、一端にゴム栓を付けます。チューブのもう一方の端を第2のストッパーで密封し、液体窒素でサンプルをフラッシュフリーズします。その後、すぐにストッパーを取り外し、液体窒素貯蔵のためにラベル付けされたクライオチューブにPTFEチューブを置きます。EPR測定の場合、EPR分光計の指デュワーを液体窒素で満たし、サンプルを含むPTFEチューブを液体窒素に入れる。EPR 分光計に指デュワーを配置し、77 度ケルビンで測定のための EPR 取得パラメーターを設定します。凍結肺組織のROS検出のために、乾燥した氷の上に組織を置き、ピンセットを使用してドライアイス上のフラッシュ凍結組織を安定させます。サンプルを5つの15ミリグラムに切り、タール1.5ミリリットルチューブで部分の重量を量ります。196マイクロリットルのKHBとDTPAと4マイクロリットルのCMHをサンプルに加え、肺サンプルを37°Cの水浴で1時間インキュベートしてから、組織断片を短い遠心分離でペレット化します。次に、サンプルを氷の上に置いてから、150マイクロリットルの上清をPTFEチューブに移してフラッシュ凍結します。PMAで刺激された生264.7細胞における全スーパーオキシド産生の評価が実証されるように、PMA処理細胞の細胞懸濁液および緩衝液の両方における亜酸化窒素濃度が類似していることを明らかにし、その結果、スピンプローブの透過性と迅速な平衡化が可能である。この第二酸化窒素ラジカルシグナルは、PMAで刺激された生の264.7細胞ではシグナルが増加し、対照細胞と比較して、細胞不透過性のスーパーオキシドジスムターゼで前処理された細胞では増加しない。PMAによる刺激後の生の264.7細胞で低温で得られた亜酸化窒素の濃度も、室温データと一致するスーパーオキシドジスムターゼの存在下で減衰する。第二四酸化窒素濃度は、PBS治療対照と比較して、BLEoマウスおよび治療されたマウスの血液および気管支肺胞洗浄液および、ブリーマウスおよび負傷した動物から採取された肺組織片の上清内で増加する。また、レトロ軌道スピンプローブ注入後、bleoマウスおよび処置動物は、コントロールに比べてより高いスピンプローブ信号を示す。これらの実用的なプロトコルは、研究者が低温測定を含むEPRによって異なる細胞コンパートメントおよび生物学的サンプルでのフリーラジカル産生をテストすることを可能にする。

use-electron-paramagnetic-resonance-biological-samples-at-ambient

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

このプロトコルは、電子スピン共鳴顕微鏡による生細胞の周囲の環境中の酸素濃度のミクロンスケールの三次元イメージングのための方法を説明します。...

電子スピン共鳴酸素マッピングのためのライブ種のマイクロイメージング

このビデオでは、15のN標識野生型および変異型エンボプラキンタンパク質と非標識ビメンチンタンパク質との間のタンパク質間相互作用を研究するための核磁気共鳴分光法の技術について説明しています。野生型エンボプラキンとビメンチンとの相互作用が成功すると、NMRスペクトルでは広範な線幅が広がり、ピークが消失しますが、変異したエンボプラキンとビメンチンとの間に相互作用がないと、NMRスペクトルではピークが十分に分解されます。...

原子レベルのタンパク質間相互作用を研究するための核磁気共鳴

新しい電子常磁性共鳴（EPR）法、高速走査EPR（RS-EPR）は、従来の連続波（CW）技術に優れており、in vivoイメージングのための新しい会場を開き、2Dスペクトル空間イメージングのために実証されています。結果は、250 MHzで実証されていますが、技術は、任意の周波数においても適用可能です。...

高速走査電子常磁性共鳴イメージング生理学的に重要なパラメータのための新しい道を開きます。<em&gt;インビボ</em

電子常磁性共鳴(ESR)イメージングを使用して、多孔質媒体中のゲスト分子の拡散をin...

電子常磁性共鳴イメージングを使用した多孔質体でゲスト分子の拡散の場の監視で

原子分解能で分子タンパク質複合体の構造は、多様な生命現象で重要な役割のため関連性が高いです。ここで、マジック角回転固体核磁気共鳴分光法 (MAS SSNMR) による不溶性と非晶質高分子タンパク質複合体の高分解能構造解析を実行するためのプロトコルを提案する.

固体核磁気共鳴分光法による高分子アセンブリの原子スケール構造の研究

ここで、安定同位体と核磁気共鳴 (NMR) 分光法とマイクロ スケールを用いたタンパク質間相互作用の後の評価と生産のラベルが付いている蛋白質の浄化のためのプロトコルを紹介します。働く (MST)...

核磁気共鳴分光法 (NMR) とマイクロ働く (MST) による球状と糸状のタンパク質の相互作用を測定

このプロトコルは、シンクロトロンベースのX線吸収分光法実験のために生物学的クライオサンプルを調製するための詳細な手順を提示する。サンプル調製と凍結保存を最適化するために必要なすべてのステップを、がん細胞と植物プランクトン細胞を用いたプロトコルの例で説明します。この方法は、サンプルクライオ調製の普遍的な標準を提供します。...

高分解能X線吸収分光法を用いた極低温でのスペシエーションのための生体試料調製

ここでは、核磁気共鳴(NMR)プローブを回転させる動的核分極(DNP)マジックアングル(DNP)に凍結したサンプルを極低温で伝達するためのプロトコルを紹介します。このプロトコルには、実験前のローター保管の方向と、実験前後の生存率測定の方向が含まれます。...

細胞生存率を維持するマジックアングル回転核磁気共鳴分光計への低温サンプルローディング

固体、液体、ガス、混合物の分子構造とダイナミクスは、多様な科学分野にとって重要な関心事です。高温高圧の高圧のMAS...

高温高圧 in situ マジックアングル回転核磁気共鳴分光法

天然変性タンパク質の弱く一過性の分子間および分子内相互作用を検出するための常磁性緩和増強NMR分光法の適用のためのプロトコルが提示されています。...

天然的に無秩序なタンパク質の自己会合の検出と特性評価のための常磁性緩和増強

学ぶ 生体試料の電子常磁性共鳴（EPR）分光法によるフリーラジカル測定法。スピンプローブを用いた活性酸素種の検出と試料処理プロトコルについて、酸化還元生物学研究への応用を含めて解説します。

周囲温度、77 K で生体試料の電子常磁性共鳴の使用

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