Name: エシェリヒア属大腸菌のウイロイド派生システムを使用して円形の足場に組換え Rna の大量生産 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: 学ぶ、エシェリヒア属大腸菌を用いてウイロイド由来の円形足場システムで組換えRNAを大量生産する方法です。植物tRNAリガーゼによる環状化とイオン交換クロマトグラフィー精製により、均一なRNAを効率的に得られます。

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この作品は、助成金 BIO2017-83184-R とスペイン Ministerio デ サイエンス、Innovación y Universidades (協調融資・ フェダー資金) から BIO2017 91865 経験によって支持されました。

1. プラスミド構築
<ol><li>
逆転写 PCR RNA テンプレートから始める場合 (または) pcr 法による増幅 cDNA 発現プラスミドにアセンブリを許可する 5' 拡張子のプライマーを使用して興味の RNA に対応します。望ましくない突然変異を避けるため、ハイファイ DNA ポリメラーゼを使用します。
	<ol>
<li>ギブソン アセンブリ20によって、発現プラスミドの cDNA を挿入する次の 5' 拡張子を PCR のプライマーに追加: 前方、5'-tctccccctcccaggtactatccccttXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3';逆、5'-ccctcctagggaacacatccttgaXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3';X は、関心の RNA のターミナルの両端に核酸の相同性を表します。</li>
		<li>30 間インキュベート 98 ° c、s に続いて 10 の 30 サイクル 98 ° c、30 秒 55 ° C と 30 s 72 ° C、72 ° c. で 10 分の最終的な拡張で s</li>
	</ol>
</li>
	<li>プラスミド pLELVd-IIS 型制限酵素Bpiの 10 U BZB のダイジェスト 100 ng 0.5 mL に 20 μ L 反応で 37 ° C で 1 時間私は G (10 mM pH 7.5、10 mM MgCl2、50 mM NaCl トリス塩酸バッファー内チューブします。、0.1 mg/mL BSA)。 注:すべてのプラスミドの対応する著者にリクエストも承ります。Bpi私は、掲示板に相当私。</li>
	<li>TAE バッファー (40 mM 20 mM 酢酸、1 ミリメートルの EDTA、pH 7.2 トリス) の 1% の agarose のゲルの電気泳動で PCR および消化製品を区切ります。0.5 μ G/ml エチジウム ブロマイドの 200 mL の振動による 15 分のためのゲルを染色します。UV transilluminator を用いた DNA を視覚化し、 Bpi私消化プラスミド (2046 bp) メス刃を使用して増幅 cDNA に対応するバンドを切断します。 注:Bpi私 pLELVd BZB の消化も LacZ 青白記者に対応する 528 bp 製品をリリースします。</li>
	<li>(ゲルの材料表で DNA の回復キット) シリカゲル カラムを使用してゲル片から Dna を溶出して吸光光度分析法による DNA 濃度を定量化します。</li>
	<li>アセンブリのギブソン反応増幅 cDNA と消化のプラスミドを使用して設定します。ベクター20対挿入の 3 倍モル超過分を使用します。50 ° C で 1 時間インキュベートし、(DNA クリーン &テーブルの材料にコンセントレーター キット) シリカゲル カラムを用いた反応生成物を浄化します。</li>
	<li>
Electroporate 主務にギブソン アセンブリ反応の精製品を使用大腸菌 DH5α 。次の設定を適用 1 mm エレクトロポレーション キュベットを使用して、: 1,500 V と 5 さん加温カタボライト抑制と超最適化されたスープで 37 ° C で 1 時間 (SOC; 20 g/L トリプトン 5 g/L 酵母エキス、0.5 g/L の NaCl、KCl、2.5 mM 10 mM MgCl2、20 mM グルコース、pH 7.0) 液体培地とルリア ベルターニカミラを広めにして (LB; 10 g/L トリプトン 5 g/L 酵母エキス、塩化ナトリウム 10 g/L) 寒天 (1.5%) を含む 50 μ G/ml アンピシリン プレートします。
	<ol>
<li>変換されたエシェリヒア属大腸菌に対応するコロニーのための画面に挿入、electroporated 細胞をメッキする前に 15 分を組み込む可能性が高いクローンを広める 50 mg/mL の 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal) 30 μ Lジメチルホルムアミド。37 ° C で一晩版を孵化させなさい</li>
	</ol>
</li>
	<li>いくつか白人の植民地をピックアップし、37 ° c 液体の LB 媒体で一晩成長します。浄化、miniprep を用いたプラスミド キット (材料の表を参照) とそのサイズを TAE バッファーに 1% の agarose のゲルの電気泳動によって分析します。</li>
	<li>PLELVd BZB コントロールと比較して電気泳動の移行に基づいて最も可能性の高い組換えプラスミドを選択します。3 を使用してプライマー 5'-CCTTTTTCAATATTATTGAAGC - シーケンスで選択したプラスミドのシーケンスを確認 ' と 5'-GATGCTCGTCAGGGGGGCGGAG-3' pLELVd BZB カセット式全逃げ。 注:興味の cDNA に置き換えられます LacZ マーカーで 528 bp polylinker がこのプラスミドに含まれていることに注意してください。制限のマップ右のプラスミドを選択に役立ちます。</li>
</ol>2. RNA 発現
<ol><li>Co electroporate (1.6 の条件を参照してください) 選択した大腸菌ひずみ (大腸菌BL21 または BL21 派生物) 共同を表現する興味およびプラスミド p15LtRnlSm の RNA に対応する cDNA を含む pLELVd-BZB-微分と、ナスの tRNA のリガーゼ。領域の長い二重鎖 Rna を表現するのにエシェリヒア属大腸菌RNase III21が不足している、HT115(DE3) を使用します。 注: RNA 両方エシェリヒア属大腸菌の RNA ポリメラーゼによる転写、mRNA の関心と tRNA のリガーゼ。この lysogen の存在は有害な影響を与えませんが、大腸菌の菌株で特急の T7 RNA ポリメラーゼ DE3 lysogen する必要はありません。</li>
	<li>SOC 液体培地で 37 ° C で 1 時間培養後 electroporated 50 μ G/ml アンピシリンと 34 μ G/ml クロラムフェニ コールを含む LB 固体培地で細菌をプレートします。37 ° C で一晩インキュベートします。</li>
	<li>コロニーをピックアップし、1 L を接種する液体の素晴らしいスープ (TB) 媒体の 250 mL で三角フラスコを困惑 (12 g/L トリプトン 24 g/L 酵母エキス、0.4% のグリセロール、0.17 M KH2PO4、および 0.72 M K2HPO4)、50 μ g/mL アンピシリンを含む34 μ G/ml クロラムフェニ コール。180 回転/分 (rpm) で活発な動揺と 37 ° C で孵化させなさい。文化接種後 12 と 16 h の間の細菌を収穫します。</li>
</ol>3. RNA の抽出・精製
<ol><li>
分析の目的のため必要な時点で文化の 2 mL 因数を取る 14,000 x gで 2 分間破棄上清の遠心分離機し、ボルテックスで TE バッファー (10 mM トリス-HCl、pH 8.0、および 1 mM EDTA) の 50 μ L で細胞を再懸濁します。
	<ol>
<li>フェノール (水で飽和し、トリス-HCl、pH 8.0、8.0 ph 平衡) の 1:1 (v/v) ミックスの 1 つのボリューム (50 μ L) を追加およびクロロホルム。積極的なボルテックスしてセルを解除し、14,000 x gで 5 分間遠心分離して水溶液と有機相を分離します。</li>
		<li>総細菌 RNA を含む水性相 (上側) を注意深く回復します。 注: 準備は、その後の分析のための-20 ° C で保存できます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>分取用 250 mL 遠心ボトルと 14,000 × g 10 分破棄上清のために細胞をスピンに文化を注ぐ。30 mL の水で再によってセルを洗浄します。遠心管に移し、再び同じ条件下で細胞をスピンします。</li>
	<li>上澄みを廃棄し、ボルテックスで 10 mL のクロマトグラフィー バッファー (50 mM トリス-HCl、pH 6.5, 150 mM の NaCl、0.2 mM EDTA) の細胞を再懸濁します。 注:この時、他の瞬間に浄化を続行する-20 ° C で細胞を固定できます。</li>
	<li>新鮮なまたは解凍細菌の準備を使用して、1 ボリューム (10 mL) を追加することによりフェノール: クロロホルムの細胞を破る (3.2 を参照) とボルテックス精力的に。</li>
	<li>12,000 × gで 10 分間遠心、水性相を回復し、再 1 ボリューム (10 mL) の同じ条件の下でクロロホルムで抽出します。 注:RNA の準備は、-20 ° C でこの時点で保存できます。</li>
	<li>
さらに陰イオン交換クロマトグラフィーによる総細菌 RNA を浄化します。45 μ m シリンジ フィルターと 1 mL ジエチルエタノールアミン (DEAE) 列の負荷によって RNA の準備をフィルター処理します。
	<ol>
<li>クロマトグラフィーの浄化のためには、1 mL/min の流速で液体クロマトグラフィー システムを使用します。サンプルの読み込みの前に 10 mL のクロマトグラフィー バッファーとコラムを平衡させ (手順 3.3 構成を参照してください)。</li>
		<li>サンプルをロードし、10 mL のクロマトグラフィー バッファーを洗い流します。20 ml の溶出バッファー (50 mM トリス-HCl、pH 6.5 では、1 M の NaCl、0.2 mM EDTA) の RNA を溶出し、1 ml を収集します。 注: RNA はすぐに初期の分数でた。列はさらに精製再利用することができます。このため、10 mL の水を洗い流すし、20% エタノールで 4 ° C で保存します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>組換え RNA 蓄積大腸菌で円形のフォームの大部分は、以降このプロパティは均質性12に浄化のため利益することができます。二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (2 D ページ) 非変性と変性 (8 M 尿素) 条件12,22の組み合わせによるリニア電源から円形の Rna を分離します。</li>
</ol>4. RNA 解析
<ol><li>5% のポリアクリルアミドゲルを準備 (37.5:1 acrylamyde:N, N'- methylenebisacrylamide、質量比) TBE バッファー (89 mM トリス、89 mM ホウ酸、2 ミリメートルの EDTA) 含む 8 M 尿素で。</li>
	<li>RNA 調剤のバッファー (98% ホルムアミド、10 mM トリス-HCl、pH 8.0、1 mM EDTA、0.0025% ブロモフェノール ブルーと 0.0025% キシレンシアノール) 1 巻 (20 μ L) とのミックス 20 μ L 95 ° c 加熱ブロックで 1.5 分間インキュベートし、クールな氷の上。</li>
	<li>ポリアクリルアミドゲルのサンプルをロードし、(例えば200 V で 2.5 h 2 mm ジェル x 130 x 140 を実行) のゲル寸法に応じて適切な条件で電気泳動を実行します。0.5 μ G/ml エチジウム ブロマイドで 15 分間ゲルを染色、水で洗浄し、紫外線の下で RNA を視覚化します。</li>
</ol>

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</ol>

著者はこのプロトコルで記述されている技術がされていることを宣言 (米国特許番号特許を取得PCT/EP2015/060912 EP14382177.5)。

ELVd シーケンスとナスの tRNA のリガーゼによって認識に関与する構造の要件を研究している間我々 は円形化ウイロイドの予期しない大規模な蓄積につながった非宿主大腸菌の両方の分子を共発現に気づいた細菌細胞19の形態。エシェリヒア属大腸菌の RNA ウイロイドの大きい蓄積最もおそらく比較的小さいなど、安定性の高い RNA 分子の共発現の結果であったことがわかった (333 nt)、高基・ ペア、円形化ウイロイドとこのタンパク質特定のウイロイド親和性の高さが表示されます。ELVd RNA は、感染した植物17のレプリケーション中に、環状を仲介するホスト tRNA のリガーゼを募集する必要があります。両方の分子形成リボ核蛋白質エシェリヒア属大腸菌細菌の 1 リットル当たり 150 mg の顕著な濃度に達することができますと、ウイロイドを安定にさらに複雑なことを期待して実験的確認を持っていない私たちが高度を上回る Rrna12などの内因性 Rna...

DNA やタンパク質と対照をなして、簡単、効率的でコスト効果の高い生産多量の RNA のためのプロトコルは豊富ではないです。ただし、彼らのユニークな生物学的特性の1を調査するまたはで使用されるこれらの生体分子の量を増やす研究と産業の需要が特異性の高いアプタマーとして彼らの使用を含むバイオ テクノロジー アプリケーションを洗練された2、治療薬3、または選択的な殺虫剤4。生体外のトランスクリプションと化学合成の研究では、RNA を生成するが使用されます。ただし、これらのメソッドは、大量の製品が必要な場合の重要な制限を伴います。論理の代替は、細胞の仲間から関心の Rna を分離する精製プロセスに続いて、生きた細胞の内因性転写機械を使用することです。この戦略は、次の研究室向けなど、細菌の細胞における組換え Rna を生成する手法が開発されたエシェリヒア属大腸菌5または、海洋紫光合成アルファ-proteobacterium Rhodovolum sulfidophilum6。 細菌における遺伝子組換え RNA を生成するほとんどのメソッドはネイティブの非常に安定した RNA の足場の式に依存、tRNA または、rRNA、関心の RNA が、挿入7のようです。余分な RNA の存在が下位アプリケーション8の問題の場合、これはキメラ分子から関心の RNA の要否を課しています。組換え RNA バイオ テクノロジーのもう一つの概念は、製品自体がありますまたは関心9、RNA の安定性を高める保護戦略として使用する組換えリボ核蛋白質複合体の生産 10。同様に、円形の Rna の生産より安定した製品11を生成するための戦略として提案されています。
我々 は最近多量の上記の概念の 3 つに参加するエシェリヒア属大腸菌の組換え RNA を生成する新しい方法を開発した: 非常に安定した円形 RNA 足場への関心の RNA との共発現の挿入、遺伝子組換えの RNA 相互作用の蛋白質を持つ可能性が高い安定したリボ核蛋白質の複雑なを生成する細菌の顕著な量の蓄積は細胞12です。以前の開発と対照をなして完全にエシェリヒア属大腸菌、すなわちウイロイドに外国人、RNA 足場を使用しました。ウイロイドは非常に特定のタイプのみによって構成され、比較的小さい (246 401 nt) 高等植物の病原菌の円形の RNA の高いベース対13。興味深いことに、ウイロイドが非コード Rna と、独自のタンパク質からヘルプはありません、彼らが感染したホスト14で複雑な感染サイクルを完了することができます。これらのサイクルは、核や葉緑体、ウイロイド家族によって RNA を複製-PospiviroidaeまたはAvsunviroidae、それぞれ、感染した植物と宿主の防御的な応答の回避運動。ウイロイドは裸円形 RNA、感染植物細胞の敵対的な環境で生き残るために持っていることの結果として、本質的に最も安定した Rna にランクする必要があります。このプロパティは、バイオ テクノロジーの手法で組換え RNA を安定させるために足場として特に適してウイロイドをすることができます。さらに、新しいメソッドは、相互作用の植物蛋白質を持つウイロイド足場の共発現に基づいています。ウイロイドは、ホスト プロセスの別のステップを触媒する酵素を募集してローリング サークル メカニズムを介して複製されます。特にいくつかウイロイド、具体的に家族のAvsunviroidae15に属するものには、リボザイムもレプリケーションに関与しているが含まれています。ウイロイド種に応じてウイロイド Rna の転写は RNA ポリメラーゼ II のホストまたはクロロプ ラストのエンコードされた核 RNA ポリメラーゼ (NEP) によって媒介されます。ウイロイド処理ホストにより触媒されると思われる III 型 RNase オリゴマーの RNA をリボザイムとウイロイドの中間体は自己複製中に切断が。最後に、結果のウイロイド モノマーが円形、ウイロイド家族によってホスト DNA リガーゼ 1 または tRNA のリガーゼ16,17のクロロプ ラストのアイソ フォームで。この最後の酵素は、ナスの潜在ウイロイド(ELVd)18などの家族Avsunviroidaeウイロイドの単量体の形態の結紮に関与しています。
ナス (ナスl.) によって認識を決定する ELVd のシーケンスと構造的要件を分析する作業の過程で tRNA のリガーゼ、エシェリヒア属大腸菌の両方の分子の共発現に基づく実験システムを設定19. 単位よりも長い ELVd 成績証明書は、自己効率的に埋め込まれたハンマー ヘッド型リボザイムによるエシェリヒア属大腸菌のセルでクリーブ、結果ウイロイドの単量体 5'-水酸基と 2'、3'-リン酸ジエステル テルミニいた私たちは気づいた共発現ナス tRNA のリガーゼによって効率的に円形。さらに、生じる円形ウイロイド RNA は、内因性 Rrna12を越えるエシェリヒア属大腸菌、予期しない高濃度に達した。複製中間体の不在では、これらの細菌細胞の ELVd RNA を増幅の欠如が示されます。興味深いことに、ウイロイド分子の特定の位置における異種 Rna の挿入は、円形のウイロイド由来 Rna12の蓄積でそれなりの効果を持っていた。これらの観測では、大量の組換え細菌における Rna を生成する方法を想像できた。この方法で ELVd cDNA に関心の Rna に対応する Cdna が挿入されます、結果の想像上の RNA は強力な構成のプロモーターを介して, 大腸菌で発現します。動作するようにシステムの大腸菌はナスの tRNA のリガーゼを表現するプラスミッドの共同変換しなければなりません。ELVd 派生ユニットよりも長くトラン スクリプトが埋め込まれたハンマー ヘッド型リボザイムによって処理され、適切なテルミニを結果として得られるモノマーを認識し、共発現の tRNA のリガーゼによって円形します。このように、関心の RNA はウイロイド円形分子から成る非常に安定した円形の足場に挿入されます。この組換え想像上の RNA はおそらく更にエシェリヒア属大腸菌の細胞内のリボ核蛋白質 tRNA のリガーゼとの相互作用を介して複雑な形成による安定化します。このメソッドを使用して (以下のプロトコルを見なさい)、RNA アプタマー、ヘアピン Rna とその他の構造化された Rna 簡単に万人通常の実験室の条件で大腸菌文化の 1 リットルあたりミリグラムの量で生産され撮影の同質性に浄化されました。真円度12の利点。

<table><tbody><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA ポリメラーゼ</td><td>Thermo Scientific</td><td>F530S</td><td></td></tr><tr><td>Bpi I</td><td>Thermo Scientific</td><td>ER1011</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Conda</td><td>8010</td><td>D1 low EEO</td></tr><tr><td>Tris</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A1086,1000</td><td></td></tr><tr><td>酢酸</td><td>PanReac AppliChem</td><td>131008.1214</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134-500G</td><td></td></tr><tr><td>臭化エチジウム</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A1152,0025</td><td>1%</td></tr><tr><td>Zymoclean ゲル DNA 回収</td><td>Zymo Research</td><td>D4001</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND-3300</td><td></td></tr><tr><td>NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td><td>New England BioLabs</td><td>E2621S</td><td></td></tr><tr><td>DNA Clean &コンセントレーター</td><td>Zymo Research</td><td>D4003</td><td></td></tr><tr><td>エポレーター</td> エ<td>ッペンドルフ</td><td>4309000019</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli DH5&alpha;</td><td>Invitrogen</td><td>18265-017</td><td></td></tr><tr><td>トリプトン</td><td>イントロン バイオテクノロジー</td><td>Ba2014</td><td></td></tr><tr><td>酵母抽出物</td><td>イントロン バイオテクノロジー</td><td>48045</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>PanReac AppliChem</td><td>131659.1211</td><td></td></tr><tr><td>寒天</td><td>イントロン バイオテクノロジー</td><td>25999</td><td></td></tr><tr><td>アンピシリン</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A0839,0010</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>Duchefa</td><td>X1402.1000</td><td></td></tr><tr><td>N,N-ジメチルホルムアミド</td><td>PanReac AppliChem</td><td>131785.1611</td><td></td></tr><tr><td>NucloSpin Plasmid</td><td>Macherey-Nagel</td><td>22740588.250</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli BL21(DE3)</td><td>Novagen</td><td>69387-3</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli HT115(DE3)</td><td></td><td></td><td>Ref. Timmons et al., 2001</td></tr><tr><td>クロラムフェニコール</td><td>Duchefa</td><td>C 0113.0025</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>PanReacアプリケーションケム</td><td>122329.1211</td><td>87%</td></tr><tr><td>KH<サブ>2</サブ>PO<サブ>4</サブ></td><td>PanReacアプリケーションケム</td><td>131509.1210</td><td></td></tr><tr><td>K<サブ>2</サブ>HPO<サブ>4</サブ></td><td>PanReacアプリケーションケム</td><td>122333.1211HCl</td><td></td></tr><tr><td></td><td>パンレアックアプリケーションケム</td><td>131020.1211</td><td></td></tr><tr><td>フェノール</td><td>シャルラウ</td><td></td><td>FE04791000 90%</td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A3691,1000</td><td></td></tr><tr><td>Filtropur S 0.2</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826.001</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap DEAE セファロース FF カラム</td><td>GE ヘルスケア ライフサイエンス</td><td>17-5055-01</td><td></td></tr><tr><td>&Auml;KTAprime plus 液体クロマトグラフィーシステム</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>11001313</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamyde</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A1089,1000</td><td>2K</td></tr><tr><td>N,N'-メチレンビスアクリルアミド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7279-100G</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>PanReac AppliChem</td><td>146392.1211</td><td></td></tr><tr><td>ホウ酸</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A2940,1000</td><td></td></tr><tr><td>ホルムアミド</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A0937,2500</td><td></td></tr><tr><td>ブロモフェノールブルー</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8026-5G</td><td></td></tr><tr><td>キシレンシアノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X4126-10G</td><td></td></tr><tr><td>N,N&prime;-ビス(アクリロイル)シスタミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4929-5G</td><td></td></tr></tbody></table>

エシェリヒア属大腸菌のウイロイド派生システムを使用して円形の足場に組換え rna の大量生産

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

RNA 生物学とバイオ テクノロジーの高度なアプリケーションで RNA 分子の使用の関心の高まり、大量の組換え Rna を生成する方法が制限されます。ここでは、多量のウイロイド足場や植物に興味の RNA を含むキメラ分子の共発現による大腸菌の組換え RNA を生成するプロトコルについて述べる tRNA のリガーゼ。ウイロイドは、高等植物の感染性は比較的小さく、非コーディング、高いベース対の円形 Rna です。ホスト植物 tRNA リガーゼ ウイロイド レプリケーション中に RNA 環状を仲介するAvsunviroidae、ナスの潜在ウイロイド(ELVd) などの家族に属しているウイロイドによって募集される酵素であります。ELVd が大腸菌では複製されませんが、ELVd 前駆体が効率的にエシェリヒア属大腸菌の RNA ポリメラーゼによる転写し細菌のセルに埋め込まれたハンマー ヘッド型リボザイムによって処理し、結果モノマーによって円形が、共発現 tRNA のリガーゼ顕著な濃度に達する。ELVd 足場に関心の RNA の挿入組換え RNA 標準実験室の条件で細菌培養のリットル当たりのミリグラムの数十のことができます。RNA 製品の主要な割合は円形で、仮想の同質性に組換え RNA の精製を容易にする機能。このプロトコルでは関心の RNA に対応する相補的 DNA (cDNA) が、共同ナスの tRNA のリガーゼを表現するプラスミッドに沿って変換するためE. 大腸菌発現プラスミドの ELVd cDNA の特定の位置に挿入されます。強い構成プロモーターの制御の下で両方の分子の共発現は、多量の組換え RNA の生産に します。組換え RNA を細菌の細胞から抽出した、その循環を利用して細菌の Rna の大部分から分離することができます。

ELVd 派生システム12を使用してE. 大腸菌の組換え RNA を生産するには、目的の RNA は ELVd RNA 足場に移植しました。この想像上の RNA が共発現大腸菌でナスの tRNA のリガーゼに沿って。そこから関心の RNA が突出している、想像上の円形の RNA が可能性が高いリボ核タンパク質 (の細菌の細胞の顕著な濃度に達すると共発現ナス酵素との複合体を形成する処理、切断、円形、図 1)。したがって、このシステムを用いて組換え RNA を生成する最初のステップ ELVd cDNA、ELVd シーケンス バリアント AJ536613 で T245 T246 の特定の位置に関心の RNA に対応する cDNA を挿入することで構成されます。2 Bpiとプラスミド pLELVd-BZB この polylinker を含む位置 I 認識サイトや LacZ の青/白のマーカー遺伝子の非常に効率的なギブソン...

ウイロイド足場や植物に興味の RNA を含むキメラ RNA の共発現による大腸菌の組換え RNA の大量に生産するためのプロトコルを提案するここでは、tRNA のリガーゼ。主な製品は、同質性に浄化を促進する円形分子です。

エシェリヒア属大腸菌のウイロイド派生システムを使用して円形の足場に組換え Rna の大量生産

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

この方法は、研究や産業での応用に関心のある組換えRNAを大量に生成するのに役立ちます。主な利点は、組み換えRNAが簡単にスケールアップすることができる安価なプロセスで大腸菌で生成されることです。重要なことに、RNAは円形のRNA足場で生産され、均質性への精製を容易にします。DNAやタンパク質とは対照的に、目的のRNAは、このような大腸菌培養物などのバイオファクトリー系において大量に産生されにくい。我々の方法は、非常に安定した円形足場に挿入された目的のRNAの共発現とRNAの循環を媒介するリガーゼを適用することに基づいている。円形RNA足場は特許を取られたビロイドから派生する。ビロイドは比較的小さく、非コイリング、高塩基対円形RNAであり、いくつかの高い植物に感染する。我々は、通常の実験室の条件で細菌培養のリットル当たり組換えRNAの数十ミリグラムを生成することができます。この手順を開始するには、テキストプロトコルで概説されているように、PCRによってcDNAを増幅します。次に、プラスミドpLELVd-BZBの100ナノグラムを0.5ミリリットルのチューブに加えます。タイプIIS制限酵素BpiIの10Uと十分な緩衝液Gを加え、20マイクロリットル反応を起用する。プラスミドを消化するために摂氏37度で1時間インキュベートします。この後、TAEバッファー内の1%アガロースゲルでの電気泳動によりPCRと消化産物を分離します。1ミリリットル当たり0.5マイクログラムの濃度で200ミリリットルの臭化エチジウムで振ってゲルを汚す。UVトランスイルミニューエータを使用して、DNAを可視化します。メスを使用して、増幅されたcDNAとBpiI消化プラスミドに対応するバンドを切り取ります。シリカゲルカラムを使用して、ゲルフラグメントからDNAを溶出する。分光光度分析によりDNAの濃度を定量化します。増幅されたcDNAと消化されたプラスミドを使用してギブソンアセンブリの反応を設定します。摂氏50度で1時間インキュベートします。次いで、シリカゲルカラムを用いて反応を精製する。有能な大腸菌DH5-アルファ細胞を電気ポレートした後、いくつかの白いコロニーを選び、液体LB培地に移します。摂氏37度で一晩コロニーを成長させます。次に、miniprepキットを使用してプラスミドを精製し、TAEバッファー内の1%アガロースゲルで電気泳動によってそのサイズを分析します。まず、選択した大腸菌株を、目的のRNAに対応するcDNAとプラスミドP15LTRNISMを含むpLELVd-BZB誘導体の両方と共に電気ポポレートし、ナスtRNAリガーゼを共発現させる。SOC液培地をエレクトロポレーションキュベットに移して細胞を回収し、摂氏37度で1時間インキュベートする。次に、1ミリリットルアンピシリンあたり50マイクログラム、1ミリリットルクロラムフェニコールあたり34マイクログラムを含むLB固体培地に細菌をプレートします。一晩摂氏37度でインキュベートします。翌日、1リットルのバッフルアーレンマイヤーフラスコに、1ミリリットルアンピシリンあたり50マイクログラム、ミリリットルクロラムフェニコールあたり34マイクログラムを含む液体結核培地を250ミリリットル加える。インキュベートされた大腸菌を取り出し、コロニーを摘み取り、フラスコ中の培地を接種する。180 RPMで12~16時間激しく揺れ、37°Cでインキュベートしてから、細菌を収穫します。収穫した大腸菌培養物を250ミリリットルの遠心分離機ボトルに注ぎ、14,000 Gで10分間細胞を回転させます。上清を捨て、30ミリリットルの水で細胞を再懸濁します。この懸濁液を遠心管に移し、前の条件を使用して再び細胞を回転させます。上清を捨て、細胞ペレットにクロマトグラフィーバッファーを10ミリリットル加えます。渦は、バッファー内の細胞を再中断する。フェノールの1つのボリュームを追加:クロロホルムと渦を激しく細胞を壊すために。その後、12,000Gで遠心分離機を10分間行う。水相を回収し、クロロホルムの1つのボリュームを加え、渦を激しく加えます。遠心分離機は12,000Gで10分間行う。この後、45マイクロメートルのシリンジフィルターを介してRNA調製物をフィルター処理します。液体クロマトグラフィーシステムに接続された1ミリリットルのジエチルエタノールアミンカラムを使用してRNAを精製します。1分間に1ミリリットルの流量を調整し、10ミリリットルのクロマトグラフィーバッファーでカラムを平衡化します。その後、サンプルをロードし、10ミリリットルのクロマトグラフィーバッファーでカラムを洗浄します。溶出バッファーの 20 ミリリットルで RNA をエルプし、1 ミリリットルのアリコートを収集します。二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用して、円形RNAを直線的なRNAと分離します。まず、TBEバッファーに5%のポリアクリルアミドゲルを調製し、テキストプロトコルで概説されているように8つの臼歯尿素を含む。20マイクロリットルのRNA調製物を1体積のローディングバッファと混合します。暖房ブロックで摂氏95度で1.5分間インキュベートし、氷の上でスナップクールします。ポリアクリルアミドゲルにサンプルをロードし、ゲル次元に適した条件で電気泳動を実行します。この後、ゲルを1ミリリットルの臭化エチジウム10マイクログラムで15分間染色する。染色したゲルを水で洗い、UV光の下でRNAを可視化します。異なるcDNAが挿入されたいくつかの組換えプラスミドの電気泳動分析は、pLELVd-BZBと比較して異なるマイグレーションを示す。pLELVd-BZBにはlacZマーカーが含まれており、これは目的のRNAに対応するcDNAに置き換えられるため、移行は挿入されたcDNAのサイズに依存しますが、組換えプラスミドは通常、コントロールプラスミドよりも速く移行します。共エレクトロポレートされた細菌培養における組換えRNAの産生は、細胞を破壊し、変性PAGEによってRNAを分析することによって監視される。強いバンドは、目的の異なるRNAが挿入された空のELVdおよびキメラELVd形態に対応して見ることができます。興味深いことに、組換えRNAの主要な部分は円形の形態として見られる。主分画の円形度は、高いイオン強度と低イオン強度で変性条件下で2つのPAGEを組み合わせて使用することによって観察される。RNA製剤は、アニオン交換クロマトグラフィーによりさらに精製することができる。ここで見られるように、大腸菌RNAは、低イオン強度で効率的に保持され、その後高いイオン強度で溶出し、RNAのほとんどが画分2と3で収集されています。組換えRNAは、さらに2次元電気泳動により均質に精製することができる。このプロトコルは、エシェリヒア・コリでの大量の組換えRNAの生産を容易にし、最終製品の循環性のおかげで均質性への精製を可能にする。目的のRNA結果は、植物のビロイドに由来する円形のRNA足場に埋め込まれていることを覚えておいてください。両方の部分を分離したい場合は、リボザイム、DNAzymes、RNase H.このプロトコルの収量は、小さなRNAがより大きなRNAよりも高い量で生成される可能性が高いため、関心のある特定のRNAに依存する標準的な戦略を使用する必要があります。より大きなスケールの表現では、細菌を収穫するのに最適な時間は、大腸菌株、培養培地、成長条件を含む多くの要因に依存することを考慮に入れてください。お客様の特定の条件で最適な生産期間を見つけるために、予備的な時間コースアッセイをお勧めします。組換えRNAは細菌細胞に一過性に蓄積し、それらは後期成長期に完全に消失することを覚えておいてください。

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学ぶ、エシェリヒア属大腸菌を用いてウイロイド由来の円形足場システムで組換えRNAを大量生産する方法です。植物tRNAリガーゼによる環状化とイオン交換クロマトグラフィー精製により、均一なRNAを効率的に得られます。

エシェリヒア属大腸菌のウイロイド派生システムを使用して円形の足場に組換え Rna の大量生産

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