Β アミロイド誘起分光と電子顕微鏡によるフィブリン血栓構造異常の解析
2018年11月30日
フィブリン凝固組織に及ぼす β-アミロイドを分析する個別にまたは組み合わせて使用することができます 2 つの方法は、ここで紹介します。続いて、体外フィブリン血栓を作成する血栓濁度及び走査電子顕微鏡法に含まれている、プロトコルです。
このプレートベースの濁度アッセイの主な利点は、迅速であり、洗練されたセットアップや要件なしに一度にスクリーニングされるいくつかのアミロイド-βフィブリノーゲン相互作用阻害剤を可能にすることです。フィブリン濁度アッセイにあるヘッド化合物は、走査型電子顕微鏡法で分析したフィブリン血栓中のA-β誘発構造異常を回復させる能力についてさらに評価することができる。スキャン電子顕微鏡分析のための血栓調製の視覚的実証は、製剤の変動が実験結果内の変動に寄与する可能性があるため、極めて重要である。
ここでのデモの焦点は、A-ベータフィブリノーゲン相互作用です。このプロトコルは、他のタンパク質およびフィブリン凝固物との化合物との他の相互作用を分析するために容易に変更することができる。まず、200マイクロリットルの血栓形成バッファーに1.5マイクロモルの血栓形成バッファーを含み、制御ウェルを含み、室温で回転プラットフォーム上でプレートをインキュベートします。
30分後に同時に30マイクロリットルの新しく調製したトロンビン溶液をフィブリノーゲン含有ウェルの中央に直接加えて血栓形成を開始し、350ナノメートルでインビトロ凝固の吸光度を直ちに読み取り、10分間にわたって30〜60秒ごとに測定を繰り返します。フィブリン血栓構造に対するA-βフィブリノーゲン相互作用阻害剤の効果を評価するために、最初に鉗子を使用して清潔に置き、12ミリメートルのシリコン化ガラスサークルカバーが12ウェルプレートの個々の井戸に滑り込み、各カバースリップに80マイクロリットルのフィブリノーゲンを加え、溶液を均等に広げます。血栓形成を開始するために各ウェルにトロンビン溶液の20マイクロリットルを追加します。
プレートを室温で30〜60分間インキュベーションし、各血栓を2ミリリットルの氷冷ナトリウムカコチル酸緩衝液に2分間静かに浸し、室温で2回、1ミリリットルのピペットを使用して洗浄後に慎重にバッファーを取り除きます。最後の洗浄後、カバースリップの血栓形成の状態を確認し、氷冷2%グルタルアルデヒドを氷上で2〜3ミリリットルに30分間固定します。インキュベーションの終わりに、各ウェルからグルタルアルデヒドを静かに取り出し、氷上で実証したように新鮮なカコチル酸ナトリウム緩衝液で血栓を洗います。
空気暴露から保護された血栓を維持するために、水の間のエタノールを完全に除去することなく氷上で5分間の氷冷エタノールの水を通して固定された血栓を水和する。最後の100%エタノール洗浄中に、カバースリップを臨界点乾燥機のサンプルホルダーに移し、各カバースリップの間に少なくとも1つの洗濯機を入れ、ホルダーをエタノールで満たされた臨界点乾燥機室に入れます。30分の乾燥サイクルの後、カーボンテープを使用してカバースリップを個々の走査型電子顕微鏡スタブに取り付け、サンプルを真空スパッタコーターのスパッタコーティング室に移します。
その後、金パラジウムやその他の導電性材料の20ナノメートル未満のスパッタコートを毎秒4つのオングストロームで25秒間サンプルに塗布し、4キロボルトで2つの二次電子検出器を装備した走査型電子顕微鏡でサンプルを画像化します。フィブリン血栓形成は、溶液を通過する光の散乱を引き起こし、読み取り期間の終わりに高原が増加する濁度をもたらす。フィブリノーゲンがA-β42の存在下でインキュベートされると、溶液の濁度は、フィブリノーゲン単独の約半分の最大高さに達する曲線とともに減少する。
A-β 42インタラクションブロッカーの存在下では、β-アミロイドの効果が改善され、濁度はA-β単独でそれよりも高い。化合物は、A-βが存在しない場合にフィブリン血栓濁度を変化しないので、ブロッカーの効果は背景濁りのために現れません。また、GPRPの存在下での血栓形成は、フィブリン重合を妨害することが知られているペプチドであり、阻害剤の不在下でのフィブリン血栓形成と比較して顕著に減少した濁度を示す。
トロンビンと塩化カルシウムの存在下で生成されたフィブリノーゲンは、細長く、より大きな束と同様に、フィブリンの糸とインターカラットされた糸を有するフィブリンメッシュを形成するだけである。A-βが存在すると、フィブリン糸は凝集体に複数の粘着性のある塊を有して薄くなり、A-β誘発構造異常を示す。濁度アッセイ結果と一致して、A-βフィブリノーゲン相互作用ブロッカーの存在下での血塊形成は、この処置でより少ない塊が観察されるように、A-β誘発性変化からフィブリン凝固塊の構造を部分的に復元する。
血栓濁度アッセイおよび走査型電子顕微鏡分析プロトコルは、いくつかのA-βフィブリノーゲン相互作用阻害剤を迅速かつ再現可能な方法で評価するために最適化されています。そしてすぐにデータは、インビトロとインビボの両方のさらなる研究に適用することができるフィブリン血栓形成に関する貴重な情報を提供します。
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概要
本記事では、in vitroにおけるフィブリン凝固プロトコル、凝固物の濁度測定法、および走査電子顕微鏡による観察法を含め、ベータアミロイドがフィブリン凝固構造に及ぼす影響を分析するための手法を提示します。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 生化学
- 細胞生物学
背景
- β-アミロイドは神経変性疾患に関与しています。
- フィブリン血栓はさまざまな生物学的プロセスで役割を果たしています。
- フィブリン血栓の構造を理解することで、疾患メカニズムに関する知見を得ることができます。
- これまでの研究により、Aβによってフィブリン血栓に構造的異常が生じることが示されています。
研究目的
- β-アミロイドがフィブリン凝固物の構造に及ぼす影響を評価すること。
- アミロイドβとフィブリノゲンの相互作用に対する阻害剤をスクリーニングすること。
- 走査電子顕微鏡分析のための凝固物の調製方法を実演すること。
使用した手法
- 迅速なスクリーニングのためのプレートベース濁度アッセイ。
- フィブリノゲンを用いたin vitroフィブリン凝固物の調製。
- 凝固物構造を解析するための走査電子顕微鏡観察。
- 他のタンパク質相互作用を研究するためのプロトコルの修正。
主要な結果
- 構造的完全性を回復させるリード化合物の同定。
- 一貫性を確保するためには、凝固塊調製の視覚的な実演が不可欠である。
- 調製方法の変動が実験結果に影響を及ぼす可能性がある。
- タンパク質相互作用の研究におけるより幅広い応用の可能性。
結論
- 提示された手法は、フィブリン血栓構造の解析に有効です。
- 阻害剤のスクリーニングにより、治療戦略に関する知見が得られます。
- さらなる研究により、他のタンパク質の相互作用について詳しく解明できる可能性があります。
よくある質問
産業界への実用的意義
本プロトコールでは、プレートベースの濁度測定法を用いて、アミロイドβとフィブリノーゲンの相互作用阻害剤を迅速かつ再現性高くスクリーニングすることが可能であり、アルツハイマー病治療薬開発における初期段階のターゲットバリデーションを支援します。本手法により、凝固形成に関する定量的データが得られ、走査電子顕微鏡（SEM）による構造確認が行われるため、A-beta誘導性のフィブリン凝固異常を改善する化合物のヒット・トゥ・リードへの展開が促進されます。濁度測定の結果とSEM画像を統合することで、神経血管を標的とした創薬プログラムにおいて、メカニズム面でのリスク低減と予測精度の向上を実現します。
バイオファーマR&Dにおける戦略的活用
初期発見およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： Aβ-フィブリノゲン相互作用がアルツハイマー病における病理的な血栓形成を促進するという治療仮説を検証します。
- 運用的価値： Aβ-フィブリノゲン結合阻害の直接的なアウトカムとして血栓の濁度を測定することで、機能的なターゲットバリデーションを可能にします。
- 予測的価値： 通常のフィブリン血栓構造を回復させる化合物を特定することで、ターゲットへの結合（ターゲットエンゲージメント）および生物学的リスクの低減を示し、ポートフォリオの優先順位付けを支援します。
スクリーニングおよびアッセイの開発
- アッセイの適格性：最適化された濁度測定アッセイは迅速で再現性が高く、大規模な化合物ライブラリーのスクリーニングに適したマルチウェルプレート形式に対応しています。
- 定量的出力：350 nmにおける吸光度を経時的に測定し、阻害剤の効能をバックグラウンドの影響から区別する凝固形成のキネティクスデータを提供します。
- 構造的確認：濁度スクリーニングで得られたヒット化合物は、SEMを用いてフィブリン凝固塊の構造回復を可視化することで検証され、ヒットがアッセイのアーティファクトではないことを確認します。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 疾患との関連性： A-betaを微小梗塞および脳アミロイドアンギオパチーに関連するフィブリン血栓の異常に結びつけ、アルツハイマー病の病理における脳血管メカニズムをモデル化します。
- トランスレーショナルな連続性： インビトロでのターゲットエンゲージメント（濁度）と表現型としての血栓構造（SEM）を関連付け、インビボでの検証前にメカニズム的なリスク低減をサポートします。
- リスク調整済み進展： 血栓形成遅延の抑制と構造的異常の回復という2つの基準に基づいた、Go/No-go判断を可能にします。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は初期探索の連続的なプロセスに組み込まれており、創薬ターゲットとしてのA-beta-フィブリノゲン相互作用の仮説検証を可能にし、その結果をリード化合物の同定および前臨床検証のワークフローへと反映させます。
- 発見生物学： A-betaがフィブリン血栓の濁度と構造をどのように変化させるかを定量化することで仮説検証をサポートし、神経血管機能不全に関与する経路を明らかにします。
- スクリーニング： 96ウェルプレート形式で、A-beta-フィブリノゲン相互作用阻害剤の高スループット評価に必要なアッセイの準備性と再現性を提供します。
- 分析学： 濁度キネティクスおよびSEMに基づく構造指標を提供し、化合物が血栓の形成と構造に及ぼす影響の比較分析を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ： 標的阻害と表現型的な血栓回復を関連付け、神経血管アルツハイマー病モデルの前臨床的な継続性と整合させます。
- エンタープライズ再利用： 濁度-SEMワークフローは、A-beta以外の他のタンパク質-フィブリノゲン相互作用にも適用可能な再利用可能なプラットフォームであり、幅広い標的検証の取り組みをサポートします。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 生化学的な阻害と構造的な血栓回復を関連付けることで予測の信頼性を高め、ターゲット検証におけるメカニズムの曖昧さを低減します。
- 運用上の価値： 血栓の調製、洗浄、固定化、およびイメージングプロトコルを最適化し、標準化と再現性を確保します。
- 戦略的価値： 機能的検証（濁度）と構造的検証（SEM）の両方を必須とすることで、Go/No-Go判定の質を向上させ、後期の生物学的リスクを低減します。
- ポートフォリオへの影響： 血栓形成の遅延と構造的な病理の両方を改善することが実証された阻害剤について、リスク調整後の優先順位付けを可能にします。
実施上の検討事項
- タンパク質の調製、凝固形成アッセイ、および走査電子顕微鏡（SEM）の試料調製に関する専門知識が必要です。
- 350 nmでのキネティック吸光度測定が可能なプレートリーダーと、SEMイメージング機能を備えた真空スパッタコーターへのアクセスが必要です。
- SEMの解析を妨げる構造的アーティファクトを避けるため、凝固物の固定、脱水、および乾燥工程の標準化が不可欠です。
- 本プロトコルを他のタンパク質-フィブリノゲン相互作用に拡張する場合、特に緩衝液の組成やインキュベーション時間に関する適応上の検討が必要です。
- 新鮮な試薬の調製が必要であることや、空気への暴露や不均一な洗浄による凝固物のばらつきを防ぐための慎重な取り扱いなど、実用上の制限が含まれます。
