Name: 移植組織の細菌付着を勉強する平行平板灌流システムのIn Vitroモデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: 学ぼう、細菌と移植組織の相互作用を解析する平行平板灌流システムを用いたin vitroモデル。感染性心内膜炎の病態理解と治療戦略の開発に貢献する手法です。

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本研究は、RH に与えられた研究基金ルーヴェン (OT/14/097) の助成金によって後援されました。TRV は FWO 研究財団 - フランダース (ベルギー; 博士研究員許可番号 - 12K0916N) と RH は UZ ルーヴェン臨床研究基金でサポートされます。

1.体外研究移植組織の準備
注: 組織の 3 つのタイプは使用された: ウシ心膜パッチ (BP)、凍結保存同種 (CH) および牛の頚静脈移植 (BJV)。BJV 導管、CH (組織処理欧州同種銀行 (エッブ) によって、液体窒素を使用する前に格納されている) の場合は、壁と弁のリーフレットの両方が使用されました。BP パッチと BJV 電線管は、メーカーから購入しました。使用前に次のエッブ指示12CH を解凍します。
<ol><li>0.9 %nacl 前に使用すると、すべての組織をすすいでください。</li>
	<li>使用して使い捨ての皮膚生検組織生検循環組織部分 (直径 10 mm) をカットするパンチを準備します。</li>
	<li>組織のすべてのパッチを使い捨て滅菌メスを使用して同じ高さにカットします。</li>
	<li>グルタルアルデヒド (たとえばBJV 導管) 固定した組織、定着剤を中和するためにアルブミン 200 g/L と 4 ° C で一晩移植作品を孵化させなさい。</li>
	<li>0.9% グルタルアルデヒドの残渣を洗浄マイクロタイター プレートにおける塩化ナトリウム。 1分間に 3 回繰り返します。</li>
</ol>2. 灌流実験用細菌の準備
注: 3 つの細菌分離株を用いて:黄色ブドウ球菌コーワン (ATCC 12598)、ATCC 149900 をS の表皮を、 s. 血統NCTC 7864。黄色ブドウ球菌とsトリプシン大豆スープ (TSB) で 37 ° C で栽培し、, S. 血統ブレインハートインフュー ジョン (BHI) で 5% CO2で 37 ° C で育った。
<ol><li>一晩培養中固体血液寒天培地プレート上を準備します。<ol>
<li>滅菌ループを使用して、冷凍の細菌をこすり、37 ° C で一晩かけて培養のミューラー ・ ヒントン血液寒天培地プレート上に接種します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>一晩かけて血液寒天培地培養からシングル コロニーをピックアップし、37 ° C で一晩 14 mL チューブ文化で TSB の BHI 10 mL に接種する滅菌接種ループを使用してください。</li>
	<li>一晩文化 (g, 4 ° C, 10 分 x 3000) を遠心し、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 10 mL にペレットを再懸濁します。氷の上 14 mL の管を配置します。</li>
	<li>5 (6) - カルボキシ - フルオレセイン N-ヒドロキシ - サクシニミジルエステル (CF) エタノールの 3.7 mg/mL の溶液の因数を準備し、-20 ° C で保存さらに「純水」を使用して 150 μ g/mL CF 株式を希釈します。 注: アルミ箔を使用して光から管を保護し、-20 ° C で保存</li>
	<li>遠心分離機の細菌 (g, 4 ° C, 10 分 x 3000) と 800 μ L の PBS でペレットを再懸濁します 150 μ g/mL CF ソリューション (30 μ G/ml 灌流実験用の最終濃度) を 200 μ l 添加します。アルミ箔を光から保護して管と軌道のシェーカーを使用して 30 分間インキュベートします。</li>
	<li>ラベル付け後に PBS のウシ血清アルブミン (BSA) ソリューションの 2% をブロックし、スピン (3000 x の g, 4 ° C, 10 分間)。10 mL の PBS とペレットの細菌を用いた遠心分離 (3000 x の g, 4 ° C, 10 分) 洗浄ステップに従ってください。</li>
	<li>PBS (CFU)/mL (CFU を頼りにミューラー ・ ヒントン血液寒天培地プレートによって確認される)、107コロニー形成単位を取得する、外径 φ600 (光密度) 0.65 に対応する細菌を希釈します。灌流実験前に氷に暗闇の中にチューブを維持します。 注意してください。外径600測定が細菌のおおよその数を反映して覚えておいてください。効果的な接種量をカウントするには、シリアル希釈法は 3.8 項で説明したように OD を確認する追加の必要なステップが番号をベースです。</li>
</ol>3 平行平板流チャンバーを用いた灌流実験体外。
<ol><li>内面の細菌懸濁液との接触を取得する上向き流れ溜まりに 10 mm の直径と同じ厚さ (1.1 〜 1.5 の手順で準備) の組織生検をマウントします。 メモ: 様々 な移植で同じ組織の厚さは、すべての条件で層流をできるようにチャネルで同じ組織高さに達することを確認します。流れ区域のすべての要素を提示し、図 1に示した。<ol>
<li>プロトコルを開始するには、8 mm 円形穿孔顕微鏡スライドとゴム製のガスケットの間ラウンド組織片を配置します。 注: 顕微鏡のスライドは 8 mm の穴の生成を許可する極薄底フィルムを所有しています。ゴム シートと共にそれは標本と流れる媒体との間の直接の接触を有効に組織を修正し、また実験中に、生検の転位を防ぐ。(小径) の流れにさらされている調査の組織の表面は、鉗子で操作できません。</li>
		<li>商工会議所の下の金属フレームに埋め込まれているガスケット シートに組織のホルダーを挿入します。</li>
		<li>商工会議所の下の部分に対応するガスケット シート上部の金属フレームの以前に挿入されたティッシュ ホルダー付します。その後 8 本のネジで全体の部屋をマウントし、ナットをネジします。商工会議所の高さが常に同じである移植全体を確認します。 注: 商工会議所の高さは、ネジを締める時に常に決まる必要があります。ノギスや定規を使用します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>蠕動ポンプとチューブ流体流れ区域を接続します。</li>
	<li>3 ダイン/cm2 (平方センチメートルの圧力単位ダイン) のせん断応力 107 CFU/mL (CFU カウントと OD600測定に関連によって確認される) の蛍光標識した細菌は PBS での懸濁液と組織を灌流して蠕動ポンプの手段 (流量 4 mL/分) プレート サーモスタット (材料表) を使用して 37 ° C でエアコン 400 mL 細菌貯水池 (社内設計図 1) を使用して 1 時間。</li>
	<li>同じコレクション リザーバーを使用して 100 mL の細菌懸濁液を連続的に循環させます。</li>
	<li>後、グラフトを解放し、3 分間研究所軌道シェーカーを使用して 12 ウェル プレートで PBS の 4 mL で 2 回組織部分を洗浄室を解体します。その後より小さい直径のパンチ皮膚生検を使用して移植片の内側の部分をカットします。</li>
	<li>滅菌の 0.9 %1 mL を含む独立した 14 mL チューブに各組織生検を配置塩化ナトリウム。#1 としてチューブ ラベルを付けます。</li>
	<li>10 分間超音波処理浴を用いた組織から細菌をデタッチ (振幅 = 100% と周波数 = 45 kHz)。 注: パッチ OD600測定に続いて TSB 液体培地で 37 ° C で一晩の培養移植が評価されるべき組織から細菌の完全剥離に比べてパッチ細菌無料溶液で処理を制御します。</li>
	<li>ミューラー ・ ヒントン血液寒天培地プレート上 CFUs をカウントするのにシリアル希釈法を使用します。<ol>
<li>超音波処理後に得られた細菌懸濁液のシリアル希薄を滅菌生理食塩水 10 mL で単一 14 mL のチューブを準備します。第 2 位このチューブ ラベルを付けます。 注: 各組織の実験の 1 つの管 10 ml の 0.9% の塩化ナトリウムは必要です。</li>
		<li>10 mL 滅菌 0.9 %3 14 mL チューブの準備手順 2.7 から初期の細菌懸濁液のシリアル希薄を塩化ナトリウム。チューブ 3 #、4 #、#5 を次のようにラベルを付けます。 注: この手順は、灌流実験用細菌懸濁液に CFU 実数を知っておく必要です。</li>
		<li>渦は、15 s. 渦管にシリアル希薄にする初期の細菌懸濁液と同様、組織生検で各チューブをミックスします。</li>
		<li>3 寒天、組織実験 (細菌の灌流および PBS のコントロール灌流) の 2 つと 3 つ目初期細菌懸濁液 perfusions の使用のための準備します。</li>
		<li>10-410-3次方法 10-1組織実験用プレートごと 3 つのセクターにラベルを付けます。細菌の perfusates で CFUs の数をカウント、する次のようにプレートをラベル: 10-710-5 10-310-1。 注: すべての兆候の寒天プレートなど 10-1, 10-3 CFU/mL の次の日に計算の最後の番号を参照してください。制御板の任意のセクターを必要はありません。使用前に血液寒天培地プレートを層流フードの下に配置し、余分な水分を削除するを開くください。</li>
		<li>シリアルの希薄の準備を続行するには、#2 管にチューブ #1 の 100 μ L を転送し、渦と精力的にミックスします。</li>
		<li>1 と対応するセクター 10-1に #2 チューブの内容の 100 μ L と 10-3寒天プレートを します。同様に、拡散チューブ #2 セクター 10-410 μ L、10 μ L の各ボリュームから 4 別々 の成長を取得するこの手順を 4 回繰り返します。 注: セクター 10-4にめっきに使用される小さなボリューム、ためお勧め栽培 CFUs の平均数を作成する液滴の複数の数を持っています。</li>
		<li>初期の文化のシリアル希薄を準備するには、チューブ #3 ステップ 2.7 からの細菌懸濁液 100 μ L を転送し、渦と精力的にミックスします。#4 管にチューブ #3 の 100 μ L を追加しよく混ぜて、後続管 #5 の手順を繰り返します。</li>
		<li>血液寒天培地プレート 10-1 10-7 10-5セクター 10-3にチューブ #3 #4 #5、調整細菌懸濁液 (ステップ 2.7) の内容の 100 μ L をそれぞれ、 します。</li>
		<li>空気層流フードの血液寒天培地プレートにドライな細菌のスプレッドは、通常は 10 分のために残します。その後、一晩インキュベートの 37 ° C でプレートを配置します。</li>
		<li>一晩インキュベートした後開始細菌懸濁液灌流用 CFUs/mL と同様、組織生検に密着性から生じる CFUs の番号を取得する細菌のコロニーをカウントします。CFU/cm2結果を表現します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 蛍光顕微鏡組織灌流を移植する付着細菌の
<ol><li>灌流、洗い流してティッシュ入りの PBS (ステップ 3.5 を参照) より小さい直径のパンチを使用して移植片の内側の部分をカットします。</li>
	<li>6 ウェル プレートを準備し、メディアをマウント (材料表) の滴を配置します。</li>
	<li>メディアをマウントの一滴に組織灌流表面下方の各部分を置きます。</li>
	<li>蛍光スキャナー (資材表) を使用して板をお読みください。細菌の分類のために使用される蛍光体によると励起と放射の波長のパラメーターを設定します。</li>
</ol>

<ol><li>Que, Y. A., Moreillon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infective+endocarditis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Infective endocarditis.</a> Nature Reviews Cardiology. 8 (6), 322-336 (2011).</li>
<li>Werdan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+infective+endocarditis%3A+pathogen-host+interaction+and+risk+states%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of infective endocarditis: pathogen-host interaction and risk states.</a> Nature Reviews Cardiology. 11 (1), 35-50 (2014).</li>
<li>Moreillon, P., Que, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infective+endocarditis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Infective endocarditis.</a> The Lancet. 363 (9403), 139-149 (2004).</li>
<li>Jalal, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+propensity+of+bovine+jugular+vein+material+to+bacterial+adhesions%3A+An+in+vitro+study%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Selective propensity of bovine jugular vein material to bacterial adhesions: An in vitro study.</a> International Journal of Cardiology. 198, 201-205 (2015).</li>
<li>Sharma, A., Cote, A. T., Hosking, M. C. K., Harris, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Systematic+Review+of+Infective+Endocarditis+in+Patients+With+Bovine+Jugular+Vein+Valves+Compared+With+Other+Valve+Types%5BTitle%5D)+AND+%22JACC+Cardiovascular+Interventions%22%5BJournal%5D)">A Systematic Review of Infective Endocarditis in Patients With Bovine Jugular Vein Valves Compared With Other Valve Types.</a> JACC Cardiovascular Interventions. 10 (14), 1449-1458 (2017).</li>
<li>Malekzadeh-Milani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+and+predictors+of+Melody%28R%29+valve+endocarditis%3A+a+prospective+study%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Cardiovascular+Diseases%22%5BJournal%5D)">Incidence and predictors of Melody(R) valve endocarditis: a prospective study.</a> Archives of Cardiovascular Diseases. 108 (2), 97-106 (2015).</li>
<li>Hill, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+of+prosthetic+valve+infective+endocarditis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Management of prosthetic valve infective endocarditis.</a> American Journal of Cardiology. 101 (8), 1174-1178 (2008).</li>
<li>Claes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clumping+factor+A%2C+von+Willebrand+factor-binding+protein+and+von+Willebrand+factor+anchor+Staphylococcus+aureus+to+the+vessel+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Clumping factor A, von Willebrand factor-binding protein and von Willebrand factor anchor Staphylococcus aureus to the vessel wall.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 15 (5), 1009-1019 (2017).</li>
<li>Fowler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+invasion+by+Staphylococcus+aureus+involves+a+fibronectin+bridge+between+the+bacterial+fibronectin-binding+MSCRAMMs+and+host+cell+beta1+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular invasion by Staphylococcus aureus involves a fibronectin bridge between the bacterial fibronectin-binding MSCRAMMs and host cell beta1 integrins.</a> European Journal of Cell Biology. 79 (10), 672-679 (2000).</li>
<li>Patti, J. M., Hook, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+adhesins+recognizing+extracellular+matrix+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Microbial adhesins recognizing extracellular matrix macromolecules.</a> Current Opinion in Cell Biology. 6 (5), 752-758 (1994).</li>
<li>Massey, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin-binding+protein+A+of+Staphylococcus+aureus+has+multiple%2C+substituting%2C+binding+regions+that+mediate+adherence+to+fibronectin+and+invasion+of+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Fibronectin-binding protein A of Staphylococcus aureus has multiple, substituting, binding regions that mediate adherence to fibronectin and invasion of endothelial cells.</a> Cellular Microbiology. 3 (12), 839-851 (2001).</li>
<li>Jashari, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Belgian+and+European+experience+with+the+European+Homograft+Bank+%28EHB%29+cryopreserved+allograft+valves--assessment+of+a+20+year+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Chirurgica+Belgica%22%5BJournal%5D)">Belgian and European experience with the European Homograft Bank (EHB) cryopreserved allograft valves--assessment of a 20 year activity.</a> Acta Chirurgica Belgica. 110 (3), 280-290 (2010).</li>
<li>Cheatham, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+hemodynamic+outcomes+up+to+7+years+after+transcatheter+pulmonary+valve+replacement+in+the+US+melody+valve+investigational+device+exemption+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Clinical and hemodynamic outcomes up to 7 years after transcatheter pulmonary valve replacement in the US melody valve investigational device exemption trial.</a> Circulation. 131 (22), 1960-1970 (2015).</li>
<li>Que, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrinogen+and+fibronectin+binding+cooperate+for+valve+infection+and+invasion+in+Staphylococcus+aureus+experimental+endocarditis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Fibrinogen and fibronectin binding cooperate for valve infection and invasion in Staphylococcus aureus experimental endocarditis.</a> The Journal of Experimental Medicine. 201 (10), 1627-1635 (2005).</li>
<li>Veloso, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+adherence+to+graft+tissues+in+static+and+flow+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Thoracic+and+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Bacterial adherence to graft tissues in static and flow conditions.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 155 (1), 325-332 (2018).</li>
<li>Liesenborghs, L., Verhamme, P., Vanassche, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus%2C+master+manipulator+of+the+human+hemostatic+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus, master manipulator of the human hemostatic system.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16 (3), 441-454 (2018).</li>
<li>Chiu, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear+stress+increases+ICAM-1+and+decreases+VCAM-1+and+E-selectin+expressions+induced+by+tumor+necrosis+factor-%5Balpha%5D+in+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Artheriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Shear stress increases ICAM-1 and decreases VCAM-1 and E-selectin expressions induced by tumor necrosis factor-[alpha] in endothelial cells.</a> Artheriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 24 (1), 73-79 (2004).</li>
<li>Jockenhoevel, S., Zund, G., Hoerstrup, S. P., Schnell, A., Turina, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiovascular+tissue+engineering%3A+a+new+laminar+flow+chamber+for+in+vitro+improvement+of+mechanical+tissue+properties%5BTitle%5D)+AND+%22ASAIO+Journal%22%5BJournal%5D)">Cardiovascular tissue engineering: a new laminar flow chamber for in vitro improvement of mechanical tissue properties.</a> ASAIO Journal. 48 (1), 8-11 (2002).</li>
<li>Veltrop, M. H. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Species-+and+Strain-Dependent+Induction+of+Tissue+Factor+in+Human+Vascular+Endothelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Bacterial Species- and Strain-Dependent Induction of Tissue Factor in Human Vascular Endothelial Cells.</a> Infection and Immunity. 67 (11), 6130-6138 (1999).</li>
</ol>

最近の臨床所見は、慢性6,13の弁置換術を受けた患者における合併症として IE に特別な意識を与えます。IE で注入弁の機能不全は、広範な炎症と凝血促進反応1,14につながる血管グラフトと細菌の相互作用の結果です。提示された新規の in vitroモデルでは、組織構造および細菌性因子の相違が生体内で使用される移植15の感染症に対する感受性を調節する可能性が高い場合を調査することができました。BJV と CH 移植組織フロー条件下で細菌の募集の方と同様の傾向を示した。したがって、データは、一般に組織と表面構造と同様、特定の細菌の接着性タンパク質自体のソースは初期の細菌付着の主要な決定要因をお勧めします。
一般に、炎症を引き起こす経路、感染した血管内サイ...

黄色ブドウ球菌(黄色ブドウ球菌) は、さまざまな病原性敗血症など重症の血管内感染につながる人間の循環注入生物や非生物の表面を植民地化ホストの免疫の防衛システムを回避する戦略を採用していて、IE1,2,3,4,5。IE のまま患者の IEare の発症に貢献することの個々 の要因がまだ完全に理解6,7人工心臓弁の移植後合併症が重要な治療に関連付けられています。流れの条件の下で細菌が発生せん断力容器壁8に準拠するために克服する必要があります。彼らはより多くの体内の状況を反映して、流れの下で血管内皮細胞や人工弁組織細菌間の相互作用を研究することで、モデル、関心です。
いくつかの特定のメカニズムは、血管内皮細胞 (Ec) へと組織の植民地化と植生、IE9の重要な初期の手順の中の成熟に至る露出内皮下マトリックス (ECM) に細菌の付着を促進します。様々 なブドウ球菌表面蛋白または MSCRAMMs (認識性接着剤マトリックス分子微生物表面部材) が, フィブロネクチンなどの分子との相互作用によって宿主細胞と ECM タンパク質の付着仲介人として記載されています。フィブリノーゲン、コラーゲン、フォン ・ ヴィレブランド因子 (VWF)8,10,11。ただし、大抵静的な条件で研究のいくつかの病原因子の分子内折りたたみの観点からこれらの相互作用の多くは循環血液中血管内感染の異なる関連性にあります。
本稿で、社内に設計された体外平行平板流チャンバー モデル、慢性位置に注入する組織移植のコンテキストで ECM と ECs のさまざまなコンポーネントへの細菌付着の評価を可能にします。この作品で説明されているメソッドの全体的な目的は細菌やよう血液中の病原体の生体内環境に密接に関連の流れの条件の基になる血管内の組織間の相互作用のメカニズムを研究するには黄色ブドウ球菌。この斬新なアプローチは、IE の開発のための潜在的なリスク要因を識別するために細菌の付着を移植組織表面の感受性に焦点を当てています。

<table><tbody><tr><td>ウシ心膜(BP)パッチ、Supple Peri-Guard Clecardium</td><td>Synovis Surgical Innovations、USA</td><td>PC-0404SN</td><td></td></tr><tr><td>ウシ頸静脈コンジット(BJV)</td><td>コンテグラコンジット;Medtronic Inc, USA</td><td>M333105D001</td><td></td></tr><tr><td>CH 凍結保存されたホモグラフト</td><td>European Homograft Bank (EHB)</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Acu-Punch</td><td>Acuderm Inc, USA</td><td>P850 (8 mm);P1050 (10 mm)</td><td></td></tr><tr><td>ヒトアルブミン</td><td>Flexbumin;バクスター、ベルギー</td><td>BE171464 LOT:16G12C</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン大豆ブロス (TSB)</td><td>フルカ、シュタインハイム、ドイツ</td><td>22092-500G</td><td></td></tr><tr><td>心臓注入ブロス (BHI)</td><td>フルカ</td><td>53286-500G</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS).</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>5(6)-カルボキシフルオレセイン N-ヒドロキシスクシンイミドエステル (CF)</td><td>Sigma-Aldrich, ドイツ</td><td>21878-100MG-F</td><td></td></tr><tr><td>蠕動ポンプ (MODEL ISM444B)</td><td>Ismatec BVP-Z Standard;コール・パーマー、ヴェルトハイム、ドイツ</td><td>631942-2</td><td></td></tr><tr><td>超音波浴VWR</td><td>超音波洗浄機;VWR、ラドナー、ペンシルバニア</td><td>州142-6044</td><td>230V / 50 -60Hz 60VA;HF45kHz, 30W</td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade</td><td>Mountant Invitrogen by ThermoFisher</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>InCell Analyzer 2000 (fluorescence scanner)</td><td>GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, Pa</td><td>29027886</td><td></td></tr><tr><td>Arium Pro VF - ultrapure water - H2O</td><td>MilliQ Millipore</td><td>87206462</td><td></td></tr><tr><td>Microscopic slides - Tissue Culture Chambers (1-well)</td><td>Sarstedt</td><td>94.6140.102</td><td></td></tr><tr><td>Lumox の 1 ウェル</td> 取り外し可能な <td>Sarstedt</td><td>94.6150.101</td><td></td></tr><tr><td>ステンレス鋼 - 外科用ブレード</td><td>Swann-Morton</td><td>311</td><td></td></tr><tr><td>Tygon シリコン チューブ、1/8 インチ ID x 1/4 インチ OD</td><td>コール パーマー</td><td>EW-95702-06</td><td>温度範囲: &ndash;80〜200°CC 滅菌:エチレンオキシド、ガンマ線照射、またはオートクレーブで30分間、15psiの圧力</td></tr><tr><td>PharMed BPTチューブ</td><td>サンゴバン</td><td>AY242012</td><td>オートクレーブ可能121°で30分間。C</td></tr><tr><td>Tygon LMT-55チューブ</td><td>サンゴバンパフォーマンスプラスチック&貿易;</td><td></td><td></td>15312022</tr><tr><td>サーモスタット</td><td>BMG BIOMEDIZINTECHNIK</td><td>300-0042</td><td>230V、90VA、50Hz</td></tr></tbody></table>

移植組織の細菌付着を勉強する平行平板灌流システムのin vitroモデル

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

様々 なバルブ付き導管とステントに取り付けられたバルブは、先天性心疾患患者における右室流出路 (慢性) 弁置換に使用されます。しかし補綴用材料を使用して、これらの移植が細菌感染と様々 な宿主反応を受けやすいです。
重要な役割を果たす微生物の血管内付着細菌とホスト因子の同定が重要である感染性心内膜炎 (IE) などの感染症の発症の病態生理を理解し、予防を開発するには戦略。そのため、生理学的せん断条件下で細菌の付着を調査する有能なモデルの開発が必要です。ここでは、新しく設計された体外灌流チャンバー平行平板に基づく移植組織のさまざまなコンポーネントへの細菌付着に関する研究など細胞外マトリックス、内皮細胞および不活性領域を公開することができますの使用について述べる.このメソッドはコロニー形成と組み合わせるユニット (CFU) カウントは移植材の流れの下で細菌の粘着の方の傾向を評価する適切な。さらに、流れ溜まりされる可能性がありますせん断条件下で細菌の付着の血液成分の役割を調査するため。我々 は、組織、形態、および菌種特異性のソースは当社社内に設計された体外灌流モデルを用いた組織を移植への細菌付着の主要な決定要因ではないことを示した。

背後にあるメカニズムを理解するIE の開発、このモデルにより、細菌の評価と感染症発症の体内状況に存在する関連付けられた組織因子。
詳しくは、新規体外アプローチにより、3-10 ダインの生理的な範囲でせん断応力を発揮する組織に蛍光に分類された細菌を灌によって異なる移植組織へのフロー条件で細菌の付着を定量化する/cm2慢性。この作業で 3 ダイン/cm2に相当する 4 mL/min の流量を使用しました。(図 1に示すように) 灌流チェンバ組織のすべてのパッチは、マウントされている接ぎ木と約 39 mm の中型の入口間の距離 0.3 mm の高さを考慮して、十分に発達した層流を保証 (Re = 3.89 です2000 より有意に減少します。入り口の長さ = 0.05 mm が ' 入口-移植 '、適切...

私たちは、社内に設計された体外流れ商工会議所モデル、移植組織の細菌付着の検討を可能にするについて説明します。

移植組織の細菌付着を勉強する平行平板灌流システムのIn Vitroモデル

Various valved conduits and stent-mounted valves are used for right ventricular outflow tract (RVOT) valve replacement in patients with congenital heart ...

この方法は、細菌、血液細胞、筋肉を裏打ちする内皮細胞間の相互作用などの分野を通じて、感染性心内膜炎の病因の主要な質問に答えることができます。この技術の主な利点は、組織移植片が標準化された流れの条件で細菌、血小板、タンパク質などの様々な標的との相互相互作用に直接さらされる可能性があることです。この技術の意味は、重要な分子相互作用と特定の組織の高い感染性を促進する要因を解明することができるので、感染性心内膜炎の治療にも及ぶ。この方法は、植生形成の病因に関する洞察を提供する。血管透過性、細胞移動性、遺伝子細胞発現を調査する研究にも応用可能です。プロトコルを開始するには、以前に調製した組織生検を直径10ミリメートル、顕微鏡スライドと8ミリメートルの円形穿孔の間に同じ厚さと、内面を上に向けたゴム製ガスケットを置き、細菌懸濁液に接触させる。ホルダーに入れたまま組織移植の向きに焦点を合わせます。組織の内面が既に血流面に露出していることを確認し、実験媒体に接触するようにしてください。次に、チャンバーの下部の金属フレームに埋め込まれているガスケットシートに組織を持つホルダーを挿入します。上部の金属フレームと対応するガスケットシートを、以前に挿入した組織ホルダーを使用してチャンバの底部に取り付けます。その後、8本のネジとネジナットでチャンバー全体を取り付けます。キャリパーまたは定規を使用して、チャンバーの高さが常に移植片全体で同じであることを確認します。次に、流れチャンバを蠕動ポンプで接続します。その後、チューブで400ミリリットルの流体貯留層を接続します。蠕動ポンプと細菌貯留層を使用して1時間あたり3回の食事と毎分4ミリリットルの対応する流量の完全なストレスを持つリン酸緩衝生理食塩水の7つの蛍光標識コロニー形成ユニットに100ミリリットルの懸濁液を100ミリリットルの組織を浸透させます。同じ回収槽を使用して100ミリリットルの細菌懸濁液を連続的に再循環させる。灌流後、チャンバーを解体して移植片を放出する。軌道シェーカーを使用して12ウェルプレートで4ミリリットルのPBSで組織片を2回洗浄します。次に、より小さい直径の皮膚生検パンチを使用して移植片の内側部分を切断する。各組織生検を、1ミリリットルの無菌0.9%塩化ナトリウムを含む別々の14ミリリットルチューブに入れる。10分間超音波処理浴を使用して組織から細菌を取り外します。10ミリリットルの無菌0.9%塩化ナトリウムを用いた単一の14ミリリットルチューブを準備し、超音波処理後に得られた細菌懸濁液の連続希釈液を作ります。チューブ番号 2 にラベルを付けます。10ミリリットルの無菌0.9%塩化ナトリウムを用いて、14ミリリットルのチューブを3本用意し、最初の細菌懸濁液を実験に取り込んだ。チューブ番号3、4番、5番にラベルを付けます。次に、3枚の寒天プレートを確保し、1つは細菌灌流用、1つはPBSの制御灌流用、3つ目は灌流に使用される初期細菌懸濁液用に備える。次の方法で組織実験のためのプレートあたり3つのセクターにラベルを付けます:10-1、10-3、および10-4。細菌の浸透中のコロニー形成単位の数を数えるために、次のようにプレートにラベルを付ける:10-1、10-3、10-5、および10-7。各15秒間、組織生検を含むチューブをボルテックスし、連続希釈液を作る。シリアル希釈液を調製するには、チューブ番号1の100マイクロリットルをチューブナンバー2に移し、チューブをボルテックスして溶液を完全に混合します。チューブ番号1とナンバー2の内容物の100マイクロリットルを、寒天板の10-1と10-3の対応するセクターに広げます。その後、セクター10 4にチューブナンバー2の10マイクロリットルを広げます。このステップを4回繰り返して、10マイクロリットルの各体積から4つの別々の成長を得る。初期培養の連続希釈を調製するために、まず15秒間希釈し、100マイクロリットルの細菌懸濁液をチューブ3に移し、渦によって激しく混合した。チューブ番号4にチューブ番号3の100マイクロリットルを追加し、再び混合します。チューブ番号4からチューブ番号5の手順を繰り返します。チューブ番号3、ナンバー4、5、および標識された初期培養物の内容物の100マイクロリットルを、それぞれ血液寒天板の10-3、10-5、10-7、および10-1のセクターに広げる。薄層フードの下に血液寒天プレートを残して、細菌の広がりを空気乾燥させ、通常は10分間乾燥させる。その後、プレートを摂氏37度に置き、一晩のインキュベーションを行います。一晩インキュベーションした後、細菌コロニーを数えてCFUsの数を得る。全くのストレス状態下では、ブドウ球菌および表皮ブドウ球菌感染の両方について、様々な移植片組織にわたる同様の細菌付着が観察された。手順に従って、レンサ球菌サンギニスは、牛の心膜パッチと比較した場合、牛頸静脈壁への付着の有意な減少を示した。3種の細菌を比較すると、サングイニスは、ブドウ球菌およびブドウ球菌表皮症に関連して、牛頸静脈壁への接着性が有意に低い。この手順を試みる間、同じ頭部の正しい組織を準備することを忘れないでください。すべての実験標本で同様の条件を保証し、異なる一連の実験間のデータ変動を最小限に抑えます。その開発後、この技術は、研究者が医学的地位に近い完全な複雑さを構築するために、異なる要素を持つ彼らのインビトロモデルアプローチを豊かにすることによって、段階的に複雑な障害システムを探求することを可能にします。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

微小サイズのチャネル（&lt;30μm）を持つマイクロ流体デバイスの全体の内部の三次元表面全体に文化内皮細胞単層をに方法が記載されています。この...

血液疾患における血管相互作用を研究するためのEndothelializedマイクロフルイディクス

出典:Ditkowski, B. ほか。細菌が移植組織に付着する様子を研究するための平行プレート灌流システムのin vitroモデル。 J. Vis. Exp.

組織生検における細菌の癒着を研究するためのin vitro平行プレートフローモデル

出典:カラタユド・アロヨ、M.ら。In vitro 腸内宿主-微生物界面における合成細菌コンソーシアムの存続可能性の評価。J. Vis. Exp.(2018年)。このビデオでは、細菌の生存可能性を研究するためのin...

細菌の癒着と内部化を評価するためのin vitro腸モデル

Source: Claes, J., et al, In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates a method for studying host-pathogen interactions using a micro-parallel plate flow chamber seeded with human primary endothelial cells. Following endothelial cell activation by an ionophore and perfusion with fluorescently labeled bacteria, the cells release von Willebrand factor (VWF), which binds bacterial adhesins under shear...

Micro-Parallel Plate Flow Chamber Model for Studying Bacterial Adhesion to Human Endothelial Cells

Source: Claes, J., et al, In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates an in vivo method for analyzing shear-dependent bacterial adhesion in a live mouse model. Following surgical preparation and catheterization, the mesenteric vasculature is exposed for real-time imaging under a fluorescence microscope. Perfusion with an ionophore and fluorescently labeled bacteria reveals how shear stress triggers...

An In Vivo Model to Study Shear-Dependent Bacterial Adhesion

髄膜炎菌は、血管に感染するヒト特異的病原体である。このプロトコルでは、ヒト微小血管は、免疫不全マウスにヒト皮膚を移植することによってマウスに導入される。細菌は、典型的には、ヒトの場合に観察紫斑発疹の血管損傷と発展につながる、人間の血管に広く付着する。...

微小血管系を対象に細菌感染を研究するためのヒト化マウスモデル

せん断応力下での細菌と血管との相互作用を研究するために、血管接着に寄与する細菌と宿主因子を解剖することを可能にするフローチャンバーとin vivo腸間膜生体内顕微鏡モデルが説明されています。...

in vitroおよびin vivoモデルでは血管壁の下でフローの状況に細菌付着を研究するために、

炎症時に血管壁の損傷後、白血球は血管細胞と血小板との対話熱心。ここでは、白血球や細胞パートナー間の相互作用の根底にある分子メカニズムを特徴付ける簡単流アッセイについて述べる。...

培養血管細胞と付着性血小板白血球動員を調査する層流に基づく試金

本プロトコルは、患者由来異種移植片(PDX)の拡張in...

浸透マイクロ流体プラットフォームにおける患者由来異種移植片のEx vivo 3Dヒドロゲル培養の生存率の向上

このプロトコルは、灌流中の血管の ex vivo 培養のために、新たに開発された3Dプリントされたバイオリアクターのセットアップと操作を示しています。このシステムは、他のユーザーが簡単に採用できるように設計されており、実用的で手頃な価格で、基礎生物学や薬理学的研究などのさまざまな実験アプリケーションに適応できます。...

Ex Vivo(エクス・ビボ )3Dプリントされたバイオリアクターでの大血管の灌流培養

学ぼう、細菌と移植組織の相互作用を解析する平行平板灌流システムを用いたin vitroモデル。感染性心内膜炎の病態理解と治療戦略の開発に貢献する手法です。

移植組織の細菌付着を勉強する平行平板灌流システムのIn Vitroモデル

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