Name: 膠様質ニューロンの細胞パッチク ランプ記録のため急性脊髄スライスの準備 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-18T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: 学ぶ脊髄スライスを用いた膠様質ニューロンの細胞パッチクランプ記録法。膜特性とシナプス伝達を解析し、慢性疼痛の神経機序を解明する。神経科学・電気生理学の重要手法です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この作品は、中国の国家自然科学基金 (第 81560198、31660289) からの助成金によって支えられました。

説明すべての実験のプロトコルは、動物倫理委員会の南昌大学 (南昌、PR 中国、倫理 No.2017-010) によって承認されました。すべての努力は、実験動物の苦痛やストレスを最小限に抑えるため行われました。ここで実行される電気生理学的記録は、常温 (RT、22-25 ° C) を実施しました。
1. 動物
<ol><li>どちらの性別の Sprague-dawley ラット (3-5 週齢) を使用します。12 時間の明暗周期下動物の家し、十分な食糧や水に自由にアクセスします。</li>
</ol>2. ソリューションおよび材料の準備
<ol><li>ソリューション<ol>
<li>(MM) における人工髄液 (アプライド) を準備: 3.6 117 塩化ナトリウム、KCl、1.2 NaH2PO4·2H2O、2.5 CaCl2·2H2O、1.2 MgCl2·6H2O、25 NaHCO3、11 D グルコース、0.4 アスコルビン酸 2ピルビン酸ナトリウム。表 1を参照してください。</li>
		<li>(MM) のショ糖アプライドの準備: 240 ショ糖、2.5 KCl、1.25 NaH2PO4·2H2O、0.5 CaCl2·2H2O、3.5 MgCl2·6H2O、25 NaHCO3、0.4 のアスコルビン酸、ピルビン酸 2 ナトリウム。表 2を参照してください。</li>
		<li>K+を準備-ベース (mM) の細胞内のソリューション: グルコン酸 K 130-5 KCl、10 Na2-0.5 グリコールエーテルジアミン四酢酸、10 HEPES はクレアチンリン酸 4 Mg ATP と 0.3 李 GTP。表 3を参照してください。</li>
		<li>Cs+を準備-ベース (mM) の細胞内のソリューション: 92 CsMeSO4、43 CsCl 10 Na2-クレアチンリン酸、5 テトラエチル アンモニウム (茶) - Cl、0.5 グリコールエーテルジアミン四酢酸、10 HEPES、4 Mg - ATP と 0.3 李 GTP。表 4を参照してください。 注: すべてのソリューションは、蒸留水を使用して準備する必要があります。アプライドとショ糖アプライド約 7.4 の最適な pH を維持するために使用する前に carbogenated (95% O2と 5% CO2の混合物) をする必要があります、これらの 2 つの溶液の浸透圧は 300-310 mOsm に調整必要があります。アスコルビン酸は、カルシウム チャネルに影響を与えることができるので 1 つはカルシウム電流を記録したい場合このエージェントを省略する必要があります。浸透圧と細胞内の溶液の pH を測定し、それぞれ 290 – 300 mOsm と 7.2-7.3 に調整ください。0.2 μ m フィルターで細胞内のソリューションをフィルター処理し、-20 ° C で 1 mL 因数としてソリューションを格納お勧めCs+と紅茶の Cs+適用-ベースのアンプを使用して潜在的な膜を保持するために助長されているブロック カリウム チャネルに細胞内ソリューション 0 で安定した mV 抑制性シナプス電流 (Ips) を記録するとき。</li>
		<li>0.05% neurobiotin 488 ソリューションを準備します。K+の neurobiotin 4 で 488 mL の 2 mg を溶解-ベースの細胞内のソリューションと、蒸留水またはサッカロースを使用して必要な場合、290 – 300 mOsm に浸透圧を調整します。 メモ: ショ糖の 1 mM は 1 mOsm で浸透圧を増加します。</li>
		<li>ブロックとして脊髄の 3% 寒天培地を準備します。ガラス ビーカーに精製水 250 mL の寒天の 7.5 g を溶解し、沸騰するまで加熱し、オフに電子レンジを使用します。ソリューションを旋回、17.5 cm × 10.5 cm × 1.8 cm 凝固後のプラスチックの箱に混合物を注ぐ。使用前に 4 ° C で寒天をしてください。</li>
		<li>4% パラホルムアルデヒド (PFA) を免疫組織化学的処理に備えます。ミックス 40 g 〜 800 mL に PFA 粉体の加熱 (約 60 ° C) PBS ソリューション (130 mM NaCl、Na2HPO4、7 mM 3 mM NaH2PO4) x 1。ゆっくりと PFA パウダーが完全に溶けるまで 1 N 水酸化ナトリウム滴を追加することで、pH を調整します。解決策は明らかになった、一度 1x PBS で 1 L に容量を調整します。7.2-7.4 1 N の hcl 4 %pfa ソリューションをフィルター処理し、使用するまで-20 ° C で保管して、必要なときに pH を調整してください。 注: PFA は有毒、マスク、手袋、保護メガネを着用する必要があるのでです。4% を準備するプロセスを行う換気フード内部 PFA。粉体 PFA は、pH 約 9-10 で完全に溶解することができます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
楽器
	<ol>
<li>典型的な電気生理学的システム、赤外線微分干渉コントラスト (IR DIC) と高解像度水の液浸対物レンズ、CCD/CMOS カメラ、パッチ ・ クランプ アンプ、ピペット ホルダーを搭載した直立した顕微鏡を使用し、マニピュレーター ピペット位置の細かい調整が可能です。XY ステージも顕微鏡を移動する必要です。</li>
		<li>ファラデーケージに囲まれた振動アイソレーション テーブル上のすべての機器をマウントします。神経細胞を観察し、マイクロ ピペットを視覚化するビデオカメラにビデオ モニターを接続します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
マイクロ ピペット
	<ol>
<li>ホウケイ酸ガラス管をマイクロ ピペットの引き手を使用してから記録電極を作る。典型的なピペット抵抗の範囲は、3-6 MΩ ときに細胞内液でいっぱいです。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
寒天ブロック
	<ol>
<li>1.2 cm × 1.5 cm × 2.0 cm 寒天ブロックを準備します。必要に応じて、図 1に示す形にブロックをトリムします。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 急性脊髄スライス標本
注: 横断または傍脊髄スライス説明18,19,20以前として調理されます。
<ol><li>Transcardial 血流と脊髄抽出前、~ 500 mL スクロース-アプライド 95% O2と 5% CO2平衡を準備し、クール冷たいへの解決策 (0-4 ° C)。</li>
	<li>氷の上のすべての郭清のツールは (例えばはさみ、アイリスはさみ、歯の鉗子、微細鉗子、カーブタイプ鉗子を解剖) を冷やします。急性脊髄スライスの準備の図を図 1に示します。</li>
	<li>Transcardial 血流<ol>
<li>ウレタン (1.5 g/kg) の単一の注入 (腹腔内、i. p.) 後、2-3 分待つし、つま先や尾のピンチの応答をテストすることによってラットの麻酔深度を評価します。麻酔外科平面を維持すると、一度は、仰臥位で砕いた氷にラットを配置します。 注: 開胸の中に深い麻酔痛み感十分の生産、あなたのローカル IACUC のガイドラインに従ってください。</li>
		<li>鎖骨、剣状突起から皮膚を切開 (3-4 cm) を確認し、剣状突起の下に横切開を行います。</li>
		<li>把握し、横隔膜を完全に公開するカーブタイプ鉗子のペアで剣状突起を発生させます。通しダイアフラム、横切開し、胸骨と肋骨胸の空洞を開くには二国間の間胸部を切り取ります。胸郭を固定すると、心臓は十分に公開されているので、剣状突起を把握するのにカーブタイプ鉗子を使用します。</li>
		<li>別のカーブタイプ鉗子で優しく、心を保持し、大動脈弓のベースに左心室を通して 22 G 針を挿入します。</li>
		<li>すぐに高級ハサミで右房をカットし、冷たい、酸素ショ糖アプライド重力システムを介しての灌流を開始します。 注: 冷たいショ糖アプライドで迅速かつ十分な transcardial 血流低ナトリウムとカルシウム濃度が興奮性毒性を緩和し、神経機能を守るために役立つかもしれないが、脊髄の急速な冷却を促進できます。さらに、赤色の血液細胞をクリア形態学的研究を実行するときに、背景の染色 biocytin の削減のために有益でしょう。灌流は右心房を出る流体はラットの肝臓と足の色が淡い、明確な限り十分なと満足するいると見なされます。22 G 針の先端は心臓や大動脈の破裂を避けるために鈍である必要があります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>脊髄の解剖とスライス<ol>
<li>灌流の状態で両側胸部の背骨と肋骨の間を切って、吻側に尾から背中肌に縦切開 (5 cm) を確認します。</li>
		<li>背骨の尾側端でカットをする、はさみを使用して、周囲の組織を切り取る、脊椎の腰仙部セグメントを急速に分離します。</li>
		<li>腰仙部のセグメントを冷たいショ糖ベース アプライドを含んでいるガラス皿に転送します。腹側を上向き、左右相称椎骨の椎弓根を切って、脊髄を慎重に公開する高級はさみを使用します。2 cm 長い脊髄腰仙部拡大 (L1-S3) とを分離し、脊髄のセクションを満ちている冷たいショ糖アプライド別ガラス皿に転送します。</li>
		<li>髄膜と解剖顕微鏡の下でクモ膜膜を削除します。できるだけ早く離れてすべての腹と背根をカットします。</li>
		<li>以前トリミング寒天ブロックに脊髄を配置します。横スライスを準備するには、脊髄の腹側を付ける、寒天、ブレードに向かう背側します。傍矢状洞スライスを準備、図 1に示すように、瞬間接着剤で腹側を垂直方向の寒天に取り付けます。その後、瞬間接着剤と vibratome のプラットフォームに寒天のブロックをマウントします。300-500 μ m の横または 0.025 mm/s と 80 Hz の振動の送り速度と傍矢状洞スライスを準備します。</li>
		<li>プラスチック トリムのピペットを使用すると、記録する前に、少なくとも 30 分のための 32 ° C で継続的に酸素のアプライドを含む貯蔵室でナイロン メッシュの上にスライスを転送します。 注: 削除するとき脳膜と脊髄根特に背側角、脊髄への損傷を避けるために注意してください。脊髄は背腹スライスする必要があります。最良の結果を急速に (15-20 分) 以内のスライスが準備されるべき。脊髄スライスの厚さは、細胞可視性を満たすためにこれ以上より 600 μ m をする必要があります。さらに、上記の方法を利用して水平脊髄スライスが取得される可能性があります。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 細胞のホールセルパッチク ランプ記録
<ol><li>SG ニューロンから全体セル ホールセルパッチク ランプ記録を実施する K+を使用して、-Cs+を適用している間ほとんどの録音の場合、細胞内のソリューションをベース-ベースの抑制性シナプス電流の記録だけにソリューション。</li>
	<li>優しく記録室に脊髄スライスを移動し、それ U 字白金細線を最適なスライスの安定のためにしっかりとナイロン スレッドに接続を維持します。着実に重力システムによって RT でバブルのアプライドでスライスを灌流し、十分な酸素化を達成するために 2-4 mL/分で灌流率を設定します。</li>
	<li>低解像度顕微鏡レンズを使用して SG (半透明バンド) の領域を識別する、ターゲット セルとして高解像度の目的を使用して、健康的なニューロンを選択、ビデオ モニター画面の中央にそれを調整します。</li>
	<li>K+の適切なボリュームでピペットを埋める-基づくまたは Cs+-電極ホルダーにマイクロ ピペットを挿入し、細胞内のソリューション内銀線に連絡していることを確認、必要に応じて、細胞内のソリューションをベース、ホルダーです。</li>
	<li>焦点にマイクロ ピペットをもたらすと、マニュピュレーターを使用してアプライドに没頭し、穏やかな肯定的な圧力 (~ 1 psi 圧力計で測定した場合) に適用任意の汚れや破片からピペットを強制します。</li>
	<li>対象となるニューロンに向けてマイクロ ピペットを徐々 に移動します。ピペット、gigaseal を形成する神経細胞の膜にニューロンおよび非常に小さいディンプル フォームに近づく一度肯定的な圧力をリリースします。</li>
	<li>-70 に潜在的な保有物の変更は、生理学的に近い膜電位を休んで (RMP) セルの mV。膜を破裂し、良い全体セル構成を作成するマイクロ ピペットに過渡的で穏やかな吸引を適用します。 メモ: スライスを記録室に編入、スライス表面上の破片をクリアする、少なくとも 5 分の安定した血流を確保します。それは、健康と不健康な/デッド ニューロン間を区別する能力が良いシーリングと安定した記録の最も重要は注目に値するです。不健康な/デッド ニューロンいます腫れ、または縮められた外観、目に見える大きな核と共に健康的なニューロンは、明るいと滑らかな膜を 3 次元 (3 D) の形状によって特徴付けられる、その核は表示されません。全体セル構成を達成するためには、必要な場合に段階的な高速または低容量を補うために不可欠です。常温では、液絡部の潜在的な計算、15.1-15.2 mV と k+4.3-4.4 mV-ベースと Cs+-細胞内のソリューションをそれぞれベースします。私たちの研究では、記録されたデータが液間電位の修正されません。</li>
	<li>本質的な膜特性の録音<ol>
<li>本質的な膜特性を記録: 直ちにレコード RMP (20 内 s) で休憩後。電流クランプ モードで RMP で脱分極電流を電圧応答 (10 pA、500 ms) を測定することによって神経の入力抵抗を決定します。</li>
		<li>発火特性記録: 1 のシリーズで電流クランプの各ニューロンの発火パターンをテスト脱分極電流パルス (25-150 pA 25 pA の増分で) RMP で s。しきい値、振幅およびオフラインに単一活動電位の半分幅を測定します。</li>
		<li>サブスレッショルド電流を記録: 不定サブスレッショルド電流を評価するために開催膜電位-50 mV 電圧クランプ モードで。-60 から 1 時間の電圧パルス過分のシリーズを適用して-120 mV mV、10 mV デクリメントします。</li>
		<li>興奮性シナプス電流 (工) を記録: k+レコード工-ベースの-70 の開催可能性でクランプ電圧モードで細胞内ソリューション mV。</li>
		<li>レコード Ips: 適用 Cs+-ベースの Ips を記録するため細胞内のソリューション。全体セル構成が確立されると、膜電位で保持-70 mV、0 に潜在的な保有物を変更し 〜 5 分 mV 徐々 に。安定化は、数分待ってから、IPSC のイベントを記録するために開始します。 注:-50 mV と表示のオーバー シュートでは未満、RMP の唯一のニューロンはさらなる研究のため選択する必要があります。本研究ではシリーズ抵抗は 10-30 MΩ では通常、直列抵抗が 20% 以上変更記録を除外すべき。工は 50 μ m APV 風呂アプリケーションで確認できると 20 μ M CNQX、10 μ M ビククリンにより 1 μ M ストリキニーネと Ips を確認可能性があります。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 形態学的研究
<ol><li>形態実験用 K+-0.05% neurobiotin 488 を含む細胞内の溶液を用いた。</li>
	<li>少なくとも 20 分記録電気生理学的安定を維持し後、ゆっくりと再シールし、脊髄スライスを 4% を入れた容器に転送する細胞膜を許可するように上向き方向にマイクロ ピペットを削除 PFA。4% で、スライスを修正する PFA 常温 1 時間放置、4 ° C 一晩。</li>
	<li>Pbs は、スライスをすすいで、その後 30 分間 50% エタノールに浸ってください。PBS で洗浄 3 つの別の後、メディアをマウントをスライド上に、元の厚さのスライスをマウントします。</li>
	<li>共焦点顕微鏡を使用 (材料表参照) 画像の獲得および神経細胞の 3次元再構成のため。1.5 μ m の z スタック 20 X レンズを通してニューロンをスキャンします。</li>
</ol>

<ol><li>Todd, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+circuitry+for+pain+processing+in+the+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (12), 823-836 (2010).</li>
<li>Yoshimura, M., Nishi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blind+patch-clamp+recordings+from+substantia+gelatinosa+neurons+in+adult+rat+spinal+cord+slices%3A+pharmacological+properties+of+synaptic+currents%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Blind patch-clamp recordings from substantia gelatinosa neurons in adult rat spinal cord slices: pharmacological properties of synaptic currents.</a> Neuroscience. 53 (2), 519-526 (1993).</li>
<li>Maxwell, D. J., Belle, M. D., Cheunsuang, O., Stewart, A., Morris, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+of+inhibitory+and+excitatory+interneurons+in+superficial+laminae+of+the+rat+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology.+584+%28Pt%22%5BJournal%5D)">Morphology of inhibitory and excitatory interneurons in superficial laminae of the rat dorsal horn.</a> The Journal of Physiology. 584 (Pt. 2, 521-533 (2007).</li>
<li>Grudt, T. J., Perl, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlations+between+neuronal+morphology+and+electrophysiological+features+in+the+rodent+superficial+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Correlations between neuronal morphology and electrophysiological features in the rodent superficial dorsal horn.</a> The Journal of Physiology. 540 (Pt 1), 189-207 (2002).</li>
<li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+feed-forward+spinal+cord+glycinergic+neural+circuit+gates+mechanical+allodynia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">A feed-forward spinal cord glycinergic neural circuit gates mechanical allodynia.</a> Journal of Clinical Investigation. 123 (9), 4050-4062 (2013).</li>
<li>Zheng, J., Lu, Y., Perl, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+neurones+of+the+spinal+substantia+gelatinosa+mediate+interaction+of+signals+from+primary+afferents%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Inhibitory neurones of the spinal substantia gelatinosa mediate interaction of signals from primary afferents.</a> The Journal of Physiology. 588 (Pt 12), 2065-2075 (2010).</li>
<li>Balasubramanyan, S., Stemkowski, P. L., Stebbing, M. J., Smith, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sciatic+chronic+constriction+injury+produces+cell-type-specific+changes+in+the+electrophysiological+properties+of+rat+substantia+gelatinosa+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Sciatic chronic constriction injury produces cell-type-specific changes in the electrophysiological properties of rat substantia gelatinosa neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 96 (2), 579-590 (2006).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+signal-regulated+kinase+%28ERK%29+activation+is+required+for+itch+sensation+in+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Brain%22%5BJournal%5D)">Extracellular signal-regulated kinase (ERK) activation is required for itch sensation in the spinal cord.</a> Molecular Brain. 7, 25(2014).</li>
<li>Kopach, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+alters+trafficking+of+extrasynaptic+AMPA+receptors+in+tonically+firing+lamina+II+neurons+of+the+rat+spinal+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Inflammation alters trafficking of extrasynaptic AMPA receptors in tonically firing lamina II neurons of the rat spinal dorsal horn.</a> Pain. 152 (4), 912-923 (2011).</li>
<li>Takasu, K., Ono, H., Tanabe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+hyperpolarization-activated+cyclic+nucleotide-gated+cation+channels+at+primary+afferent+terminals+contribute+to+chronic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Spinal hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated cation channels at primary afferent terminals contribute to chronic pain.</a> Pain. 151 (1), 87-96 (2010).</li>
<li>Iura, A., Takahashi, A., Hakata, S., Mashimo, T., Fujino, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reductions+in+tonic+GABAergic+current+in+substantia+gelatinosa+neurons+and+GABAA+receptor+delta+subunit+expression+after+chronic+constriction+injury+of+the+sciatic+nerve+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pain%22%5BJournal%5D)">Reductions in tonic GABAergic current in substantia gelatinosa neurons and GABAA receptor delta subunit expression after chronic constriction injury of the sciatic nerve in mice.</a> European Journal of Pain. 20 (10), 1678-1688 (2016).</li>
<li>Alles, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+nerve+injury+increases+contribution+of+L-type+calcium+channels+to+synaptic+transmission+in+spinal+lamina+II%3A+Role+of+alpha2delta-1+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pain%22%5BJournal%5D)">Peripheral nerve injury increases contribution of L-type calcium channels to synaptic transmission in spinal lamina II: Role of alpha2delta-1 subunits.</a> Molecular Pain. 14, 1-12 (2018).</li>
<li>Santos, S. F., Rebelo, S., Derkach, V. A., Safronov, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitatory+interneurons+dominate+sensory+processing+in+the+spinal+substantia+gelatinosa+of+rat%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Excitatory interneurons dominate sensory processing in the spinal substantia gelatinosa of rat.</a> The Journal of Physiology. 581 (Pt 1), 241-254 (2007).</li>
<li>Lu, Y., Perl, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+organization+of+excitatory+circuits+between+neurons+of+the+spinal+superficial+dorsal+horn+%28laminae+I+and+II%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modular organization of excitatory circuits between neurons of the spinal superficial dorsal horn (laminae I and II).</a> The Journal of Neuroscience. 25 (15), 3900-3907 (2005).</li>
<li>Hantman, A. W., van den Pol, A. N., Perl, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+physiological+features+of+a+set+of+spinal+substantia+gelatinosa+neurons+defined+by+green+fluorescent+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Morphological and physiological features of a set of spinal substantia gelatinosa neurons defined by green fluorescent protein expression.</a> The Journal of Neuroscience. 24 (4), 836-842 (2004).</li>
<li>Yasaka, T., Tiong, S. Y., Hughes, D. I., Riddell, J. S., Todd, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Populations+of+inhibitory+and+excitatory+interneurons+in+lamina+II+of+the+adult+rat+spinal+dorsal+horn+revealed+by+a+combined+electrophysiological+and+anatomical+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Populations of inhibitory and excitatory interneurons in lamina II of the adult rat spinal dorsal horn revealed by a combined electrophysiological and anatomical approach.</a> Pain. 151 (2), 475-488 (2010).</li>
<li>Yin, H., Park, S. A., Han, S. K., Park, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+5-hydroxytryptamine+on+substantia+gelatinosa+neurons+of+the+trigeminal+subnucleus+caudalis+in+immature+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Effects of 5-hydroxytryptamine on substantia gelatinosa neurons of the trigeminal subnucleus caudalis in immature mice.</a> Brain Research. 1368, 91-101 (2011).</li>
<li>Hu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lidocaine+Inhibits+HCN+Currents+in+Rat+Spinal+Substantia+Gelatinosa+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesia+and+Analgesia%22%5BJournal%5D)">Lidocaine Inhibits HCN Currents in Rat Spinal Substantia Gelatinosa Neurons.</a> Anesthesia and Analgesia. 122 (4), 1048-1059 (2016).</li>
<li>Peng, H. Z., Ma, L. X., Lv, M. H., Hu, T., Liu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minocycline+enhances+inhibitory+transmission+to+substantia+gelatinosa+neurons+of+the+rat+spinal+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Minocycline enhances inhibitory transmission to substantia gelatinosa neurons of the rat spinal dorsal horn.</a> Neuroscience. 319, 183-193 (2016).</li>
<li>Peng, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+presynaptic+HCN+channels+to+excitatory+inputs+of+spinal+substantia+gelatinosa+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Contribution of presynaptic HCN channels to excitatory inputs of spinal substantia gelatinosa neurons.</a> Neuroscience. 358, 146-157 (2017).</li>
<li>Liu, N., Zhang, D., Zhu, M., Luo, S., Liu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minocycline+inhibits+hyperpolarization-activated+currents+in+rat+substantia+gelatinosa+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Minocycline inhibits hyperpolarization-activated currents in rat substantia gelatinosa neurons.</a> Neuropharmacology. 95, 110-120 (2015).</li>
<li>Brown, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+whole-cell+recording+from+visually+preselected+neurons+of+perirhinal+cortex+in+brain+slices+from+young+and+aging+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Methods for whole-cell recording from visually preselected neurons of perirhinal cortex in brain slices from young and aging rats.</a> Journal of Neuroscience Methods. 86 (1), 35-54 (1998).</li>
<li>Rothman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neurotoxicity+of+excitatory+amino+acids+is+produced+by+passive+chloride+influx%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The neurotoxicity of excitatory amino acids is produced by passive chloride influx.</a> The Journal of Neuroscience. 5 (6), 1483-1489 (1985).</li>
<li>Rice, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+ascorbate+in+the+preparation+and+maintenance+of+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Use of ascorbate in the preparation and maintenance of brain slices.</a> Methods. 18 (2), 144-149 (1999).</li>
<li>Takasu, K., Ogawa, K., Minami, K., Shinohara, S., Kato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injury-specific+functional+alteration+of+N-type+voltage-gated+calcium+channels+in+synaptic+transmission+of+primary+afferent+C-fibers+in+the+rat+spinal+superficial+dorsal+horn%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Injury-specific functional alteration of N-type voltage-gated calcium channels in synaptic transmission of primary afferent C-fibers in the rat spinal superficial dorsal horn.</a> European Journal of Pharmacology. 772, 11-21 (2016).</li>
<li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitatory+synaptic+transmission+in+the+spinal+substantia+gelatinosa+is+under+an+inhibitory+tone+of+endogenous+adenosine%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Excitatory synaptic transmission in the spinal substantia gelatinosa is under an inhibitory tone of endogenous adenosine.</a> Neuroscience Letters. 477 (1), 28-32 (2010).</li>
<li>Funai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+dexmedetomidine+augments+inhibitory+synaptic+transmission+in+the+superficial+dorsal+horn+through+activation+of+descending+noradrenergic+control%3A+an+in+vivo+patch-clamp+analysis+of+analgesic+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Systemic dexmedetomidine augments inhibitory synaptic transmission in the superficial dorsal horn through activation of descending noradrenergic control: an in vivo patch-clamp analysis of analgesic mechanisms.</a> Pain. 155 (3), 617-628 (2014).</li>
<li>Yamasaki, H., Funai, Y., Funao, T., Mori, T., Nishikawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+tramadol+on+substantia+gelatinosa+neurons+in+the+rat+spinal+cord%3A+an+in+vivo+patch-clamp+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Effects of tramadol on substantia gelatinosa neurons in the rat spinal cord: an in vivo patch-clamp analysis.</a> PLoS One. 10 (5), e0125147(2015).</li>
<li>Furue, H., Narikawa, K., Kumamoto, E., Yoshimura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responsiveness+of+rat+substantia+gelatinosa+neurones+to+mechanical+but+not+thermal+stimuli+revealed+by+in+vivo+patch-clamp+recording%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Responsiveness of rat substantia gelatinosa neurones to mechanical but not thermal stimuli revealed by in vivo patch-clamp recording.</a> The Journal of Physiology. 521 (Pt 2), 529-535 (1999).</li>
<li>Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+brain+slice+methods+for+adult+and+aging+animals%3A+application+of+targeted+patch+clamp+analysis+and+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics.</a> Methods in Molecular Biology. 1183, 221-242 (2014).</li>
<li>Ting, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Acute+Brain+Slices+Using+an+Optimized+N-Methyl-D-glucamine+Protective+Recovery+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), e53825(2018).</li>
<li>Li, J., Baccei, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+Tissue+Damage+Promotes+Spike+Timing-Dependent+Synaptic+Long-Term+Potentiation+in+Adult+Spinal+Projection+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neonatal Tissue Damage Promotes Spike Timing-Dependent Synaptic Long-Term Potentiation in Adult Spinal Projection Neurons.</a> The Journal of Neuroscience. 36 (19), 5405-5416 (2016).</li>
<li>Ford, N. C., Ren, D., Baccei, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NALCN+channels+enhance+the+intrinsic+excitability+of+spinal+projection+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">NALCN channels enhance the intrinsic excitability of spinal projection neurons.</a> Pain. , (2018).</li>
<li>Cui, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+synaptic+transmission+from+primary+afferents+to+spinal+substantia+gelatinosa+neurons+by+group+III+mGluRs+in+GAD65-EGFP+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Modulation of synaptic transmission from primary afferents to spinal substantia gelatinosa neurons by group III mGluRs in GAD65-EGFP transgenic mice.</a> Journal of Neurophysiology. 105 (3), 1102-1111 (2011).</li>
<li>Yang, K., Ma, R., Wang, Q., Jiang, P., Li, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optoactivation+of+parvalbumin+neurons+in+the+spinal+dorsal+horn+evokes+GABA+release+that+is+regulated+by+presynaptic+GABAB+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Optoactivation of parvalbumin neurons in the spinal dorsal horn evokes GABA release that is regulated by presynaptic GABAB receptors.</a> Neuroscience Letters. , 55-59 (2015).</li>
</ol>

著者は利益相反を宣言しません。

このプロトコルの詳細 SG ニューロン18,19,20,21の全細胞パッチク ランプ-実験を行う際、我々 は正常に使用している脊髄スライスを準備するための手順。このメソッドを実装すると、我々 は最近報告ミノサイクリン、テトラサイクリンの第二世代は著しく19SG ニューロンのシナプス メカニズムを介して抑制性シナプス伝達を高めることができます。さらに、このエージェントがh私の振幅を減少でき、さらに21SG ニューロンの興奮性を抑制します。これらを支援する公開データと我々 表示ここでは、現在この方法は電気生理学的研究の広い範囲での使用に適した代表的な結果。
前述のとおり、transcardial 潅流は健康的な試料を...

膠 (SG、ラミナの脊髄後角 II) は送信および感覚情報を規制する議論の余地なく重要な中継センターです。一次求心性線維、ローカル介在ニューロンと内因性下行抑制系1から入力を受ける興奮性と抑制性の介在ニューロン、それで構成されます。最近十年間の急性脊髄スライス標本の開発と全細胞パッチク ランプ記録の出現 SG ニューロン2,の本質的な電気生理学的および形態学的特性の様々 な研究が可能にします。3,SG5,6の局所神経回路の研究と同様、 4 。また、体外脊髄スライス標本を使用して、研究者は、神経 excitabilities7,8の変化を解釈できる、9,10チャンネルはイオンの機能と各種病態下でシナプス活動11,12 。これらの研究は深めた SG ニューロンが開発に果たす役割の理解や慢性的な痛みや神経因性のかゆみのメンテナンスです。
基本的に、神経相馬や急性脊髄スライスを使用して理想的な全細胞パッチ適用の明確に可視化を達成するために重要な前提条件は、健康とパッチ適用可能な細胞を得ることができるので、スライスの優れた品質を確保するためです。しかし、脊髄スライスの準備と、腹側椎弓切除術を実行する、健康的なスライスの取得の障害となるクモ膜膜の削除など、いくつかの手順が含まれます。脊髄スライスを準備するは簡単じゃないがいくつかの利点があります脊髄スライス上の in vitro録音を実行します。細胞培養の準備と比較して、脊髄スライス部分的に関連する生理学的条件は、固有のシナプス接続を保持できます。さらに、脊髄スライスを使用して録音全細胞パッチクは二重パッチ クランプ13,14、形態学的研究15,16シングルセル RT-PCR 法などの他の手法と組み合わせることができます。17します。 したがって、この手法は、特定地域内で解剖学的および遺伝的多様性の特性に関する詳細と局所神経回路の構成の調査では。
ここでは、急性脊髄スライスの準備及び SG ニューロンから全体セル ホールセル記録手法の基本と詳細な説明を提供します。

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td>ACSFおよびPBSの調製に使用</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>60130</td><td>ACSF、スクロース-ACSF、およびK+ベースの細胞内溶液</td></tr><tr><td>NaH2PO4&middot;2H2O</td><td>Sigma</td><td>71500</td><td>ACSF、ショ糖-ACSFおよびPBS</td></tr><tr><td>CaCl2&middot;2H2O</td><td>Sigma</td><td>C5080</td><td>ACSFおよびスクロース-ACSF</td></tr><tr><td>MgCl2&middot;6H2O</td><td>Sigma</td><td>M2670</td><td>ACSFおよびスクロース-ACSFの調製に使用</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>ACSFおよびスクロース-ACSF</td></tr><tr><td>D-グルコース</td>の調製に使用 <td>Sigma</td><td>G7021</td><td>ACSFの調製に使用</td></tr><tr><td>アスコルビン酸</td><td>シグマ</td><td>P5280</td><td>ACSFおよびスクロース-ACSF</td></tr><tr><td>の調製に使用ピルビン酸ナトリウム</td><td>Σ</td><td>A7631</td><td>ACSFおよびスクロースACSFの調製に使用</td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>Sigma</td><td>S7903</td><td>ショ糖ACSFの調製に使用</td></tr><tr><td></td><td>和光</td><td>169-11835</td><td>K+ベースの細胞内溶液の調製に使用</td></tr><tr><td>Na2-Phosphocreatine</td><td>Σ</td><td>P1937</td><td>細胞内溶液の調製に使用</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>シグマ</td><td>E3889</td><td>細胞内溶液の調製に使用</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>シグマ</td><td>H4034</td><td>細胞内溶液の調製に使用</td></tr><tr><td>Mg-ATP</td><td>シグマ</td><td>A9187</td><td>細胞内溶液の調製に使用</td></tr><tr><td>Li-GTP</td><td>シグマ</td><td>G5884</td><td>の調製に使用細胞内溶液</td></tr><tr><td>CsMeSO4</td><td>Sigma</td><td>C1426</td><td>Cs+細胞内溶液の調製に使用</td></tr><tr><td>CsCl</td><td>Sigma</td><td>C3011</td><td>Cs+ベースの細胞内溶液の調製に使用</td></tr><tr><td>TEA-Cl</td><td>Sigma</td><td>T2265</td><td>Cs+細胞内溶液の調製に使用溶液</td></tr><tr><td>ニューロビオチン 488</td><td>ベクター</td><td>SP-1145</td><td>0.05% ニューロビオチン 488 形態学的研究に使用できる</td></tr><tr><td>寒天</td><td>シグマ</td><td>A7002</td><td>3% 寒天ブロックがプロトコルで使用されました</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>シグマ</td><td>P6148</td><td>4% パラホルムアルデヒドは免疫組織化学処理に使用されました</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Hengxing Chemical</td><td>PBS</td>マウントの調製に使用される試薬 <td></td></tr><tr>カバー<td>スリッピング 媒体</td><td>Polyscience</td><td>18606</td><td></td></tr><tr><td>ウレタン</td><td>国立食品医薬品管理研究所</td><td>30191228</td><td>1.5 g/kg, i.p.</td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラス毛細血管</td><td>ワールド精密機器</td><td>TW150F-4</td><td>外径1.5mm、内径1.12mm</td></tr><tr><td>マイクロピペットプーラー</td><td>サッター機器</td><td>P-97</td><td>マイクロピペットの準備に使用</td></tr><tr><td>ビブラトーム</td><td>ライカ</td><td>VT1000S</td><td></td></tr><tr><td>防振テーブル</td><td>テクニカルマニュファクチャリングコーポレーション</td><td>63544</td><td></td></tr><tr><td>赤外線CCDカメラ</td><td>Dage-MIT</td><td>IR-1000</td><td></td></tr><tr><td>パッチクランプアンプ</td><td>HEKA</td><td>EPC-10</td><td></td></tr><tr><td>マイクロマニピュレーター</td><td>サッター装置</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>X-Y ステージ</td><td>Burleigh</td><td>GIBRALTAR X-Y</td><td></td></tr><tr><td>直立顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>BX51WI</td><td></td></tr><tr><td>浸透圧計</td><td>Advanced</td><td>FISKE 210</td><td></td></tr><tr><td>PH meter</td><td>メトラートレド</td><td>FE20</td><td></td></tr><tr><td>コンフォコール顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td>LSM 700</td><td></td></tr></tbody></table>

膠様質ニューロンの細胞パッチク ランプ記録のため急性脊髄スライスの準備

Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons

膠 (SG) ニューロンからの最近の全細胞パッチク ランプ-研究は、膨大な感覚伝達、侵害受容規制と慢性的な痛みやかゆみの開発の基礎となる脊髄のメカニズムについての情報を提供しています。急性脊髄スライスの効用に基づく形態学的研究と電気生理学的記録の実装は、神経膜特性の理解と SG の局所回路の構成にさらに改善しています。脊髄スライスとショー代表全細胞記録の形態の調製のための詳しく、実用的なガイドを紹介します。このプロトコルは、理想的な神経の保存を許可し、生体内である程度条件を模倣することができます。要約すると、脊髄スライス培養準備を取得できる安定した電流、電圧クランプ録音を有効にしたがって局所神経回路の組み込み膜プロパティに詳細な調査を促進する可能性があり、様々 な実験的アプローチによる神経の構造。

急性脊髄スライスは、図 1に示す図に従って調製しました。スライスと回復後、脊髄スライスは、記録室に移されました。健康的なニューロンは、IR DIC 顕微鏡を用いた相馬外観に基づいて識別されました。次に、SG ニューロンの活動電位が脱分極電流パルス (1 時間) のシリーズによって誘発されるときのニューロンは、RMP で開催されました。に示すよう図 2、発火パターン SG ニューロンが含まれている強壮剤焼成、遅延発火で観察されたギャップ焼成初期バースト、一過性破裂、単一スパイク、消極的焼成前の調査によって分類や記載されています。
この準備を実装すると、我々 にも記録サブスレッショルド電流と自発的に現われる電流電圧クランプ。サブスレッショルド電流、電流の過分極反応活性化の代表的な痕跡 (私h)、T 型カルシウム電流 ...

ここでは、脊髄スライス培養における膠 (SG) ニューロンから作られた全細胞パッチク録音のために不可欠な手順について述べる。このメソッドでは、組み込みの膜特性、シナプス伝達、調査される SG ニューロンの形態的特性をことができます。

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms ...

この方法は、感覚伝達、ノシシ化調節および慢性疼痛または痛みの発達の基礎となる脊髄機構を明らかにするのに役立つこの技術の主な利点は、理想的な神経保存を可能にし、ある程度インビボ状態を模倣できることである。キャピラリープーラーを使用して、ホウケイ酸ガラスマイクロキャピラリから記録電極を引っ張ることによって開始します。次に、溶融寒天で金型を充填し、1.2センチメートル、1.5センチメートル、2.0センチメートル寒天ブロックを調製します。横断断面を計画する場合は、ブロックをトリムして中央チャネルを作成します。またはパラサジタルセクションのためのブロックの端を持つチャネル肉。経心筋拡散および脊髄抽出に先立ち、ショ糖ベースのACSFを500ミリリットル調製する。氷冷に溶液を冷却し、95%O2と5%CO2で平衡化します。氷の上のすべての解剖ツールを冷却します。尾口から鼻の皮膚に長手方向の5センチの切開を行います。その後、両側の背骨と肋骨の間の肋骨ケージを切り取ります。はさみを使って背骨の尾端で切り傷を作ります。その後、周囲の組織を切り取り、脊椎の腰仙セグメントを素早く分離します。氷冷ショ糖ベースのACSFを含むガラス皿に腰部セグメントを移します。腹側を上向きに、細かいはさみを使用して椎骨のペディクルを両側で切断し、脊髄を慎重に露出させます。腰部肥大で脊髄の2センチメートルの長い部分を分離し、冷たいショ糖ACSFで満たされた別のガラス皿に脊髄セクションを移す。解剖顕微鏡で、髄膜とピアくも膜を除去する。すべての腹側と裏側の根をできるだけ早く切り取ります。髄膜や脊髄を取り除くときに脊髄、特に後角の損傷を避けるように注意してください。以前にトリミングした寒天ブロックに脊髄を置きます。横切りスライスを準備するには、脊髄の腹側をブレードに向かって背骨側で寒天に取り付けます。パラサジタルスライスを準備するには、腹側にスーパーグルーを付けて寒天を垂直方向に取り付けます。その後、スーパーグルーでビブラートメのプラットフォームに寒天ブロックをマウントします。そして、毎秒0.025ミリメートルの高度な速度と80ヘルツの振動周波数で300〜500ミクロン横またはパラサジタルスライスを調製します。脊髄はドーソ腹腔内にスライスする必要があります。最良の結果を得るには、スライスを15〜20分以内に準備する必要があります。細胞の可視性を満たすために、脊髄スライスの厚さは600ミクロン以下でなければなりません。プラスチック製のトリミングされたピペットを使用して、32°Cで連続的に酸素化されたACSFを含む貯蔵室のナイロンメッシュにスライスを移します。実質的なゼラチン系またはSGニューロンからの全細胞パッチクランプ記録を行うために、シナプス後の抑制電流の記録に限り、セシウムカチオンベースの溶液を適用しながら、記録用のカリウムイオンベースの細胞内溶液を使用します。脊髄スライスを記録チャンバーにそっと動かします。そして、最適なスライス安定性のためにナイロン糸を持つU字型のプラチナワイヤーでしっかりと安定させます。室温で気泡したACSFでスライスを着実に使い過ぎ、十分な酸素化を達成するために1分間に2〜4ミリリットルの拡散速度を設定します。次に、低解像度の顕微鏡レンズを用いて、SGニューロンの領域を半透明帯として同定する。高解像度の目的を使用して、ターゲットセルとして明るく滑らかな膜を持つ3次元形状を特徴とする健全なニューロンを選択し、ビデオモニタ画面の中央に合わせて調整します。マイクロピペットに適切な量のカリウムイオンベースまたはセシウムイオンベースの細胞内溶液を充填します。次に、マイクロピペットを電極ホルダーに挿入し、細胞内溶液がホルダーの内側の銀線に接触していることを確認します。マイクロピペットを焦点に持ち込み、マイクロマニピュレータを使用してACSFに浸します。汚れや破片を強制的に取り除くために、穏やかな陽圧を適用します。徐々に標的ニューロンに向かってマイクロピペットを移動します。ピペットがニューロンに近づき、ニューロン膜上の非常に小さなディンプルが形成されたら、正圧を放出してギガシールを形成します。細胞の生理学的な静置膜電位に近いマイナス70ミリボルトに保持電位を変更します。その後、膜を破裂し、良好な全細胞構成を作成するために、マイクロピペットに一過性で穏やかな吸引を適用します。静止膜電位で25ピコアンプインクリメントを有する25〜150ピコアンプの一連の1秒の脱分極電流パルスを有する電流クランプ内の各ニューロンの発火パターンをテストすることによって、発射特性を記録する。体細胞サブしきい値電流を記録するには、電圧クランプモードで膜電位をマイナス50ミリボルトで保持し、10ミリボルトのデクリメントでマイナス60ミリボルトからマイナス120ミリボルトまでの一連の超分極電圧パルスを1秒の持続時間に適用します。マイナス70ミリボルトの保持電位で、電圧クランプモードでカリウムイオンベースの細胞内溶液を用いた興奮性シナプス後電流を記録します。IPSCを記録するために、セルニア細胞内ソリューションを使用してIPSCを記録します。膜電位をマイナス70ミリボルトで約5分間保持した後、徐々に保持電位をゼロミリボルトに変更する。安定化を待ってから、IPSC イベントの記録を開始します。一連の1秒の脱分極電流パルスを静止膜電位でSGニューロンに注入することによって決定される発火パターンは、強壮性焼成、遅延焼成、ギャップ焼成、初期バースト、フェジックバースト、単一スパイクおよび消極的な発火に分類され得る。この図は、電圧クランプのサブしきい値電流の呼び出しプロトコルを示しています。これらの代表的なトレースは、IH、IAおよびITに分類される過分極電流注入に対する応答を示す。これは、50マイクロモルAPVおよび20マイクロモルCNQXの不在および存在下でマイナス70ミリボルトでSGニューロンから記録されたSEPSCの代表的な痕跡である。このトレースは、拡張タイムスケールに APV および CNQX が追加される前に記録された SEPC を示しています。この手順に従って、ペアパッチクランプ記録や光遺伝学のような方法は、実質的なゼラチン系における特定の神経微小回路の特徴付けのような追加の質問に答えるために行うことができる。

preparation-acute-spinal-cord-slices-for-whole-cell-patch-clamp

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

このビデオでは、樹状膜表面からのパッチクランプ記録の手法を示しています。これは、ドーパミン作動性ニューロンの樹状突起とその下にある電位依存性イオンチャネルの電気的特性を直接調べるのに役立ちます。...

脳スライスにおけるドーパミン作動性ニューロンの樹状突起からのパッチクランプ記録

このビデオは、全細胞パッチクランプ技術を使用してニューロンの発火パターンを分析するために、脊髄切片のゼラチノーサ(SG)ニューロンで電気生理学的記録を実行する手順を示しています。この方法により、脊髄のSGニューロンの刺激に対する神経応答の研究が可能になります。...

脊髄切片のゼラチノーサニューロンにおける全細胞パッチクランプ記録

シナプス前放出面膜でのCa2+電流の記録は、Ca2+の侵入と神経伝達物質の放出を正確に理解するための鍵となります。ヤツメウナギの脊髄の急性解離を示し、機能的な孤立した細網脊髄軸索を生成し、個々のシナプス前末端の放出面膜から直接記録できるようにします。...

ヤツメウナギ網様体軸索の急性解離は、個別の機能シナプス前終末のリリース顔膜から録音を有効にする方法

急性脳切片におけるシナプス結合ニューロンのパッチクランプ記録と同時細胞内バイオサイトン充填により、それらの構造的および機能的特性の相関分析が可能になります。このプロトコルの目的は、ニューロンのマイクロ回路からの電気生理学的記録とその後の形態学的分析の本質的な技術的ステップを説明することです。...

急性脳スライスにおけるニューロンマイクロ回路の電気生理学的および形態学的特徴は、ペアパッチクランプ記録を使用して、

ここでは、光反応性の非天然アミノ酸を遺伝子的にコード化することにより、短い光パルスでニューロンタンパク質を選択的に活性化する手順を、培養中または生体内でニューロンで発現するニューロンに提示します。...

ニューロンに遺伝的にコードされた非天然アミノ酸を用いた神経タンパク質の光制御

このプロトコルは、最適化されたNの実装方法を示します-メチル-D-glucamine (NMDG) 保護回復法脳スライス標本。1 つのメディアの定式化は、確実にあらゆる年齢層の様々...

最適化されたNを使用して急性脳スライスの準備-メチル-D-glucamine 保護回復法

このプロトコルは、全細胞パッチクランプ記録を実行するための基本的な処理手順を説明します。この技術は、神経細胞の電気的挙動の研究を可能にし、脳スライスに行ったときに、まだ比較的よく保存脳の回路に集積されているニューロンからの様々な神経機能の評価を可能にします。...

脳スライスにおける全細胞パッチクランプ記録

若いマウスで脊髄の斜めスライスを準備する方法を示します。この調製により、腹根の刺激が可能になります。...

前根刺激のための斜め脊髄スライスの調製

細胞内パッチクランプ記録は、樹状突起の機能的特性を調査する可能性を提供します。しかし、これらの微細な構造物は、直径が小さいため、簡単にはアクセスできません。ここで説明するプロトコルは、in...

黒質ドーパミンニューロンの細胞体樹状突起のドメインからの亜細胞パッチクランプ記録

マウスの下-中間海馬からの急性スライスを調製するためのプロトコルを提示する。この横断的な準備を、記録の質と記録されたニューロンの形態学的特徴の保存の観点からコロナスライスと比較する。...

成体マウスのデンテート・ジラスにおける全細胞記録と神経再建のための、逆海馬からの急性スライスの作製

このプロトコルは研究者が脊髄を分け、細胞生存率を同時に維持することの彼らの技術を改善するのを助けることができる高い時空間決断の脊髄の刺激(SCS)への運動ニューロンの電気応答を調査するのにパッチ・クランプを使用して方法を記述する。...

脊髄刺激時の運動ニューロンにおける全細胞パッチクランプ記録のための脊髄スライスの ex vivo 調製

学ぶ脊髄スライスを用いた膠様質ニューロンの細胞パッチクランプ記録法。膜特性とシナプス伝達を解析し、慢性疼痛の神経機序を解明する。神経科学・電気生理学の重要手法です。

膠様質ニューロンの細胞パッチクランプ記録のため急性脊髄スライスの準備

さらに動画を探す

膠様質ニューロンの細胞パッチク ランプ記録のため急性脊髄スライスの準備

さらに動画を探す

膠様質ニューロンの細胞パッチクランプ記録のため急性脊髄スライスの準備