Name: シールドとターゲットの遺伝物質と化学キャプシドのアデノ ウイルスを用いた遺伝子導入ベクターの変更を組み合わせる (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: 学ぶアデノウイルスカプシドの化学修飾法。遺伝子治療・オncolysis・遺伝子ワクチン開発に向け、ベクターと宿主の相互作用を理解・制御する手法です。293細胞を用いた効率的なベクター生産と90%以上の修飾成功率を実現します。

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<ol><li>Benko, M., Harrach, B. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/chapter/10.1007/978-3-662-05597-7_1">Molecular evolution of adenoviruses.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. , 3-35 (2003).</li>
<li>Davison, A. J., Benko, M., Harrach, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+content+and+evolution+of+adenoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Genetic+Virology%22%5BJournal%5D)">Genetic content and evolution of adenoviruses.</a> Journal of Genetic Virology. 84, 2895-2908 (2003).</li>
<li>Rowe, W. P., Huebner, R. J., Gilmore, L. K., Parrott, R. H., Ward, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+cytopathogenic+agent+from+human+adenoids+undergoing+spontaneous+degeneration+in+tissue+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Society+for+Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Isolation of a cytopathogenic agent from human adenoids undergoing spontaneous degeneration in tissue culture.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 84, New York, N.Y. 570-573 (1953).</li>
<li>van Oostrum, J., Burnett, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+composition+of+the+adenovirus+type+2+virion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Molecular composition of the adenovirus type 2 virion.</a> Journal of Virology. 56, 439-448 (1985).</li>
<li>Stewart, P. L., Fuller, S. D., Burnett, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Difference+imaging+of+adenovirus%3A+bridging+the+resolution+gap+between+X-ray+crystallography+and+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22TheEMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Difference imaging of adenovirus: bridging the resolution gap between X-ray crystallography and electron microscopy.</a> TheEMBO Journal. 12, 2589-2599 (1993).</li>
<li>Stewart, P. L., Burnett, R. M., Cyrklaff, M., Fuller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+reconstruction+reveals+the+complex+molecular+organization+of+adenovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Image reconstruction reveals the complex molecular organization of adenovirus.</a> Cell. 67, 145-154 (1991).</li>
<li>Meier, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus+triggers+macropinocytosis+and+endosomal+leakage+together+with+its+clathrin-mediated+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Adenovirus triggers macropinocytosis and endosomal leakage together with its clathrin-mediated uptake.</a> Journal of Cellular Biology. 158, 1119-1131 (2002).</li>
<li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coagulation+factor+X+shields+adenovirus+type+5+from+attack+by+natural+antibodies+and+complement%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Coagulation factor X shields adenovirus type 5 from attack by natural antibodies and complement.</a> Nature Medicine. 19, 452-457 (2013).</li>
<li>Qiu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+natural+IgM+concentration+on+gene+therapy+with+adenovirus+type+5+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Impact of natural IgM concentration on gene therapy with adenovirus type 5 vectors.</a> Journal of Virology. 89, 3412-3416 (2015).</li>
<li>Alemany, R., Suzuki, K., Curiel, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+clearance+rates+of+adenovirus+type+5+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Genetic+Virology%22%5BJournal%5D)">Blood clearance rates of adenovirus type 5 in mice.</a> Journal of Genetic Virology. 81, 2605-2609 (2000).</li>
<li>Smith, J. S., Xu, Z., Tian, J., Stevenson, S. C., Byrnes, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+systemically+delivered+adenovirus+vectors+with+Kupffer+cells+in+mouse+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Interaction of systemically delivered adenovirus vectors with Kupffer cells in mouse liver.</a> Human Gene Therapy. 19, 547-554 (2008).</li>
<li>Schiedner, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hemodynamic+response+to+intravenous+adenovirus+vector+particles+is+caused+by+systemic+Kupffer+cell-mediated+activation+of+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">A hemodynamic response to intravenous adenovirus vector particles is caused by systemic Kupffer cell-mediated activation of endothelial cells.</a> Human Gene Therapy. 14, 1631-1641 (2003).</li>
<li>Xu, Z., Tian, J., Smith, J. S., Byrnes, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+adenovirus+by+Kupffer+cells+is+mediated+by+scavenger+receptors%2C+natural+antibodies%2C+and+complement%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Clearance of adenovirus by Kupffer cells is mediated by scavenger receptors, natural antibodies, and complement.</a> Journal of Virology. 82, 11705-11713 (2008).</li>
<li>Khare, R., Reddy, V. S., Nemerow, G. R., Barry, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+adenovirus+serotype+5+hexon+regions+that+interact+with+scavenger+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Identification of adenovirus serotype 5 hexon regions that interact with scavenger receptors.</a> Journal of Virology. 86, 2293-2301 (2012).</li>
<li>Piccolo, P., Annunziata, P., Mithbaokar, P., Brunetti-Pierri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SR-A+and+SREC-I+binding+peptides+increase+HDAd-mediated+liver+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">SR-A and SREC-I binding peptides increase HDAd-mediated liver transduction.</a> Gene Therapy. 21, 950-957 (2014).</li>
<li>Plüddemann, A., Neyen, C., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+scavenger+receptors+and+host-derived+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+%28San+Diego%2C+Calif%29%22%5BJournal%5D)">Macrophage scavenger receptors and host-derived ligands.</a> Methods (San Diego, Calif). 43, 207-217 (2007).</li>
<li>Ganesan, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+clearance+of+blood-borne+virus+by+liver+sinusoidal+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogen%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient clearance of blood-borne virus by liver sinusoidal endothelium.</a> PLoS Pathogen. 7, e1002281(2011).</li>
<li>Cichon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Titer+determination+of+Ad5+in+blood%3A+a+cautionary+note%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Titer determination of Ad5 in blood: a cautionary note.</a> Gene Therapy. 10, 1012-1017 (2003).</li>
<li>Carlisle, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+erythrocytes+bind+and+inactivate+type+5+adenovirus+by+presenting+Coxsackie+virus-adenovirus+receptor+and+complement+receptor+1%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human erythrocytes bind and inactivate type 5 adenovirus by presenting Coxsackie virus-adenovirus receptor and complement receptor 1.</a> Blood. 113, 1909-1918 (2009).</li>
<li>Waddington, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus+serotype+5+hexon+mediates+liver+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Adenovirus serotype 5 hexon mediates liver gene transfer.</a> Cell. 132, 397-409 (2008).</li>
<li>Kalyuzhniy, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus+serotype+5+hexon+is+critical+for+virus+infection+of+hepatocytes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Adenovirus serotype 5 hexon is critical for virus infection of hepatocytes in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 105, 5483-5488 (2008).</li>
<li>Vigant, F., et al. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1525001616322833">Substitution of hexon hypervariable region 5 of adenovirus serotype 5 abrogates blood factor binding and limits gene transfer to liver. Molecular Therapy.</a> The Journal of the American Society of Gene Therapy. 16, 1474-1480 (2008).</li>
<li>Jonsson, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coagulation+factors+IX+and+X+enhance+binding+and+infection+of+adenovirus+types+5+and+31+in+human+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Coagulation factors IX and X enhance binding and infection of adenovirus types 5 and 31 in human epithelial cells.</a> Journal of Virology. 83, 3816-3825 (2009).</li>
<li>Bradshaw, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirements+for+receptor+engagement+during+infection+by+adenovirus+complexed+with+blood+coagulation+factor+X%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogen%22%5BJournal%5D)">Requirements for receptor engagement during infection by adenovirus complexed with blood coagulation factor X.</a> PLoS Pathogen. 6, e1001142(2010).</li>
<li>Duffy, M. R., Bradshaw, A. C., Parker, A. L., McVey, J. H., Baker, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cluster+of+basic+amino+acids+in+the+factor+X+serine+protease+mediates+surface+attachment+of+adenovirus%2FFX+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">A cluster of basic amino acids in the factor X serine protease mediates surface attachment of adenovirus/FX complexes.</a> Journal of Virology. 85, 10914-10919 (2011).</li>
<li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coagulation+factor+X+shields+adenovirus+type+5+from+attack+by+natural+antibodies+and+complement%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Coagulation factor X shields adenovirus type 5 from attack by natural antibodies and complement.</a> Nature Medicine. 19, 452-457 (2013).</li>
<li>Prill, J. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modifications+of+adenovirus+hexon+allow+for+either+hepatocyte+detargeting+or+targeting+with+potential+evasion+from+Kupffer+cells.+Molecular+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+the+American+Society+of+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Modifications of adenovirus hexon allow for either hepatocyte detargeting or targeting with potential evasion from Kupffer cells. Molecular Therapy.</a> The Journal of the American Society of Gene Therapy. 19, 83-92 (2011).</li>
<li>Zaiss, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte+Heparan+Sulfate+Is+Required+for+Adeno-Associated+Virus+2+but+Dispensable+for+Adenovirus+5+Liver+Transduction+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte Heparan Sulfate Is Required for Adeno-Associated Virus 2 but Dispensable for Adenovirus 5 Liver Transduction In Vivo.</a> Journal of Virology. 90, 412-420 (2015).</li>
<li>Delgado, C., Francis, G. E., Fisher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+uses+and+properties+of+PEG-linked+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Therapeutic+Drug+Carrier+Systems%22%5BJournal%5D)">The uses and properties of PEG-linked proteins.</a> Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems. 9, 249-304 (1992).</li>
<li>Parveen, S., Sahoo, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomedicine%3A+clinical+applications+of+polyethylene+glycol+conjugated+proteins+and+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Pharmacokinet%22%5BJournal%5D)">Nanomedicine: clinical applications of polyethylene glycol conjugated proteins and drugs.</a> Clin. Pharmacokinet. 45, 965-988 (2006).</li>
<li>O'Riordan, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEGylation+of+adenovirus+with+retention+of+infectivity+and+protection+from+neutralizing+antibody+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">PEGylation of adenovirus with retention of infectivity and protection from neutralizing antibody in vitro and in vivo.</a> Human Gene Therapy. 10, 1349-1358 (1999).</li>
<li>Subr, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coating+of+adenovirus+type+5+with+polymers+containing+quaternary+amines+prevents+binding+to+blood+components%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Coating of adenovirus type 5 with polymers containing quaternary amines prevents binding to blood components.</a> Journal of Controlled Release. 135, 152-158 (2009).</li>
<li>Kreppel, F., Gackowski, J., Schmidt, E., Kochanek, S. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1525001605001012">Combined genetic and chemical capsid modifications enable flexible and efficient de- and retargeting of adenovirus vectors. Molecular Therapy.</a> The Journal of the American Society of Gene Therapy. 12, 107-117 (2005).</li>
<li>Corjon, S., et al. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S152500161632679X">Targeting of adenovirus vectors to the LRP receptor family with the high-affinity ligand RAP via combined genetic and chemical modification of the pIX capsomere.</a> Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 16 (11), 1813-1824 (2008).</li>
<li>Prill, J. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modifications+of+adenovirus+hexon+allow+for+either+hepatocyte+detargeting+or+targeting+with+potential+evasion+from+Kupffer+cells.+Molecular+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+the+American+Society+of+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Modifications of adenovirus hexon allow for either hepatocyte detargeting or targeting with potential evasion from Kupffer cells. Molecular Therapy.</a> The Journal of the American Society of Gene Therapy. 19, 83-92 (2011).</li>
<li>Krutzke, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substitution+of+blood+coagulation+factor+X-binding+to+Ad5+by+position-specific+PEGylation%3A+Preventing+vector+clearance+and+preserving+infectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Substitution of blood coagulation factor X-binding to Ad5 by position-specific PEGylation: Preventing vector clearance and preserving infectivity.</a> Journal of Controlled Release. 235, 379-392 (2016).</li>
<li>Prill, J. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traceless+bioresponsive+shielding+of+adenovirus+hexon+with+HPMA+copolymers+maintains+transduction+capacity+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Traceless bioresponsive shielding of adenovirus hexon with HPMA copolymers maintains transduction capacity in vitro and in vivo.</a> PloS One. 9, e82716(2014).</li>
<li>Kratzer, R. F., Kreppel, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production%2C+Purification%2C+and+Titration+of+First-Generation+Adenovirus+Vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Production, Purification, and Titration of First-Generation Adenovirus Vectors.</a> Methods in Molecular Biology. , Clifton, NJ. 377-388 (2017).</li>
<li>Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/elps.1150080203">Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels.</a> ELECTROPHORESIS. 8, 93-99 (1987).</li>
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効率で遺伝子導入されたシステインを化学的に変更できますが通常 80-99% と、この効率に影響を与える特定の変数。まず、それは遺伝子導入のシステインに早期酸化が行われていないことが重要です。プロデューサー細胞の還元環境で、セキュリティで保護しながら、ベクトル粒子化学修飾の間に、プロデューサー細胞を解放した後非酸化的環境を提供するためには必須です。このため、濃度 0.1 〜 10 ミリメートルで使用できる還元剤、チオール グループは、マレイミド活性化合物と容易に反応するだろうかを含まない還元試薬を使用する必要があります。第二に、マレイミド活性化合物を使用する場合カップリング反応中に pH を超えない 7.35、pH 7.4 は、反応の特異性を減らすことができるより大きいの以来。第三に、いずれの場合も、アミン無料バッファー (例えばHEPES、PBS) は、反応に使用する必要があります。注記のうち、システイン軸受ベクトル粒子はダブル CsCl として記述されていた、[HEPES/10% グリセロール化学変更前のストアド バンディングによって精製できます。この場合、0.1-1 mM TCEP がする必要があります使用される還...

アデノ ウイルス (Ad)、アデノ ウイルス、家族のメンバーは、エンベロープを持たない DNA ウイルスの 70 以上の種類の識別 (http://hadvwg.gmu.edu) がこれまでされています。Hemaglutination プロパティ、ゲノム構造および結果を配列する、に応じて 70年広告の種類は 7 種 (人間のアデノ ウィルス A g)1,2に分割できます。ヒトゲノム広告サイズ 38 kb し、正二十面体のヌクレオキャプシド3によってカプセル化されました。その豊富なのためのキャプシド蛋白質ヘクソン、ペントン ベース、および繊維すべてと呼ばれます主要キャプシド蛋白質。最も豊かで、最も大きいキャプシド蛋白質ヘクソンを形作る 20 キャプシドの面があり、それぞれ 12 ヘクソン homotrimers4,5で構成されます。ペントン、正二十面体の辺 (頂点) があるはペントン ベースのポリアクリルアミドゲルから成り、糖繊維スチレンダイマー5,6の組み込まれている頂点スパイク ベースを表します。ネイティブの広告のセルの入力は基本的に 2 つの主要な手順で構成されます。最初に、繊維ノブはプライマリの受容体に結合します。これは、広告の種類は、A、C、E、および F の種から、コクサッキー、アデノ ウイルス受容体 (車) です。この相互作用は、これにより細胞のインテグリンと RGD モチーフのペントンの基本とその結果誘導細胞応答の相互作用を促進する、細胞表面の空間的近接性に virion をもたらします。第二に、細胞骨格の変化は、ウイルス粒子とエンドソーム7への輸送の内面化に します。Virion のリリース、エンドソームの部分的な分解は、時に細胞質に und は最終的にレプリケーションのための核に移動します。
広告をローカルに配信することができますしながら (e.g。、遺伝的のワクチン接種のため)、新規 virotherapy の必要に応じて、血流を介して全身配信いくつかの障壁に直面しています。血流に循環しながら注入された粒子は宿主の免疫系、ウイルスのベクトルの高速中和に至ると広告ベースのベクトルを全身用に非常に非効率的なレンダリングの防衛システムを発生します。さらに、広告の自然 hepatotropism 全身配信と干渉し、広告をその新しい標的細胞にリダイレクトするのには解決する必要があります。
自然免疫系の自然な IgM 抗体を生殖エンコードは急速に認識し、ウイルス粒子8,9の表面に反復性の高い構造をバインドします。これらの免疫の複合体は、ウイルス粒子8の大部分の高速補体を介した中和に至る、補体系の古典と非古典的経路をアクティブにします。広告ウイルス粒子の主要除去 2 番目の経路はマクロファージ10によって媒介され、急性毒性と血行動態の副作用11,12に関連付けられています。広告の場合特に、クッパー細胞、肝臓に存在するのにバインドし、それにより特定スカベン ジャー受容広告ウイルス粒子を介してを取る phagocytically それらを排除し血液13,報14,15 から.特定のスカベン ジャー受容体は、肝類洞内皮細胞 (LSE 細胞)16、識別されているし、LSE 細胞はまた貢献するベクトル除去17がどの程度、まだ説明が必要みたい。さらに、いくつかの広告の種類とその派生の媒介はひと赤血球18 を介して車または補体受容体 CR119結合するによって効率的に隔離します。注記のうち、ひと赤血球とは対照的ようにマウス モデルにおけるこの隔離メカニズムを検討することはできません、マウス赤血球は車を表現しないでください。
または全身用で最初の配信後に広告のいずれかにより、広告に以前感染症への暴露後免疫システムによって生成された特定のアンチ広告抗体を上げる広告ベクトルの有効活用にさらにバリアとで回避する必要があります。効率的に全身配信。
最後に、深刻な広告種類 (Ad5 を含む) の強い hepatotropism は、全身療法で広告のアプリケーションを妨げています。この親和性肝細胞伝達の結果は、血液凝固因子 X (FX) FX 広告ヘクソン タンパク質20,21,22との相互作用によって仲介する広告 virion の親和性の高さによるものです。FX は、ヘパリン硫酸糖鎖 (HSPGs) 肝細胞20,23,24,25面上に virion を橋します。この相互作用のための重要な要因は、他の細胞型の HSPGs とは異なるである肝細胞24HSPGs の N- と O-硫酸化の特定の範囲をするようです。この FX を介した経路に加えて、最近の研究は、さらに経路がまだ肝細胞26,27,28の Ad 変換の結果を識別を示唆します。
最近では、それによって示されている FX は、のみ、広告の肝細胞の情報伝達に関与していないが、virion シールド中性化に対するウイルス粒子のバインディングによっても補完システム26。FX の結合を防止することにより肝細胞伝達の減少したがって、だろう作成広告中和を介して増加の望ましくない副作用生得の免疫組織。
ベクトルおよびホストの有機体間の複雑な相互作用の深遠な知識に全身のアプリケーション ホストの有機体によって課された障害物を回避するためのより効率的なベクトルを開発が必要です。
治療用タンパク質もともと使用されている方法の 1 つは、少なくとも部分的に上記の記述の障壁を克服するために広告のベクトルに適応されています。抗原性と免疫原性治療用タンパク質化合物は、ポリエチレング リコール (PEG)29,30に結合によって削減できた。したがって、ペグなどポリ [n-(2-ヒドロキシプロピル) methacrylamid] ポリマーの共有カップリング (pHPMA) キャプシドに表面シールド不要なベクトル ホスト相互作用からベクトル。一般的に、高分子カップリングはキャプシド表面にランダムに配布される側のリジン残基の ε-アミン グループを対象します。ベクトル粒子溶液、添付のポリマーの親水性の性質のため免疫細胞認識や酵素分解のリスクを低減する安定した水シェルに囲まれています。また、ペグインターフェロン広告ベクトルは反ヘクソン抗体の in vitroとあらかじめ免疫マウス生体内で31で中性化を回避するために示されていた。遺伝キャプシドの変更と対照をなして生産と精製、従来プロデューサー細胞と高価ベクトル株式はまたの生産の使用のためだけではなくを同時にできるように後ポリマーの化学結合が実行されます。カプシドの表面にアミノ酸の何千もの変更。ただし、シールド アミン監督は、全体キャプシドの表面に、高い不均質媒質中の結果、特定の capsomers の変更を許可しない中でランダムに生じる。さらに、有益な効果に必要な大きいポリマー鎖は、ウイルス活性32を損ないます。
これらの制限は、Kreppelらを克服。33は、ベクトル re-とターゲット解除の geneti 化学概念を導入しました。システインは、繊維こんにちループ33、タンパク質 IX34、ヘクソン35,36などの溶媒露出位置ウイルス キャプシドに遺伝子導入されました。ただし、正常細胞の高価でない自然発生する、システインを含む広告ベクトルを生成できます。重要なは、特定の capsomers、1 つの capsomer 内の異なる位置のシステインの挿入チオール グループ反応鎖の非常に特定の変更ことができます。この geneti 化学的アプローチは、広告ベクター デザインで多数の障害を克服するために示されています。Detargeting、こんにちはループが正常に再ターゲットする車欠損細胞33広告ベクトルを変更証明されている繊維ノブにトランスフェリンのチオール系カップリングのアミン系 peg 修飾操作の組み合わせです。ヘクソンは (中和抗体、血液凝固因子 FX) 最も望ましくない相互作用に関与しているので、チオール ベースの変更戦略もヘクソンに適用されました。大規模な PEG 鎖増加肝細胞伝達14,35へと skov 氏 - FX の存在下で細胞を変換する Ad ベクトル粒子を防ぐヘクソンの HVR5 に小さな PEG 鎖を結合します。広告ベクトル粒子の突然変異を運ぶ車の結合を阻害する繊維ノブと FX (と peg 修飾操作位置固有の HVR1 で挿入軸受システイン) の HVR7 抑制結合抗体と補体の中性化を回避するために示されていた感染性を失うことがなくスカベン ジャー受容体を介したの取り込み。興味深いことに、にもかかわらず自然 FX シールドの欠如、peg 修飾操作再び改善肝細胞の伝達ペグのサイズ36の機能として。ただし、共有結合性シールド、細胞内輸送プロセスに影響があるにが示されました。プリルら。pHPMA に基づいており、シールドも共重合体の料金のどちらのモードはセルの入力に影響を与えたが、粒子が核に人身売買に影響を与えるかを実証のための生体機能盾と不可逆的な比較。ベクトルの in vitroとin vivoの37の正荷電の pHPMA 共重合体の粒子が広告の高い伝達効率を維持する核に人身売買の許可のための生体機能のシールドを採用します。
要約すると、これらのデータすべてベクトル ホスト間相互作用が知られているし、見なすことの仮定の下でも、過剰なキャプシド表面改質、全身・ ベクターに関連付けられているハードルを克服するために必要なことを示します。
ここでは、シールドやアデノ ウイルスのベクトル粒子やアデノ ウイルスによる腫瘍溶解性ウイルスの再ターゲットのためのアデノ ウイルスのベクトルのカプシドの部位特異的化学修飾を実行するためのプロトコルを提供します。この技術のコンセプトは、図 1の通りです。それは、合成高分子のキャラクタリゼーション キャプシドの特定の領域の不要なやりとりからシールドができます。同時に、それはまた配位子を接続し、シールドとターゲットを結合するための手段を提供します。単純な化学を使用すると、実験者は共有結合ペプチドやタンパク質、炭水化物、脂質などの分子および他の小さい分子の多種多様なアデノ ウイルスのベクトル表面を変更することができます。さらに、プロトコルは、生物学的整合性と活動の維持の下で生物学的にアクティブなウイルス由来ベクトルの化学修飾の一般的な概念を提供します。

<table><tbody><tr><td>ベクター精製と化学修飾</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>アルゴンガス</td><td>エアリキード</td><td>ローカルガスディーラー</td><td></td></tr><tr><td>液体窒素エアリ</td><td>キード</td><td>ローカルガスディーラー</td><td></td></tr><tr><td>500 mL遠心分離チューブ</td><td>コーニング</td><td>431123</td><td></td></tr><tr><td>ステリカップエクスプレスプラス0.22 &micro;m</td><td>Millipore</td><td>SCGPU02RE</td><td></td></tr><tr><td>Tris(2-carboxyethyl) phosphine (TCEP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4706-10g</td><td></td></tr><tr><td>2 mL (3mL) Norm Ject (syringes)</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4020.000V0</td><td></td></tr><tr><td>Fine-Ject needles for single use (yellow 0.9 x 40 mm)</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4710009040</td><td></td></tr><tr><td>Caesium chloride 99.999% Ultra Quality</td><td>Roth</td><td>8627.1</td><td></td></tr><tr><td>シリカゲルビーズ</td><td>Applichem</td><td>A4569.2500</td><td></td></tr><tr><td>メトキシポリエチレングリコールマレイミド - 750 (PEG mal-750)</td><td>アイリス</td><td></td>バイオテクノロジー<td>ストア -80 >C</td></tr><tr><td>13.2 mL 超透明超遠心チューブ</td><td>ベックマン・コールター</td><td>344059</td><td>フード</td></tr><tr><td>PD-10 サイズ排除クロマトグラフィーカラム</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0851-01</td><td>で 4 °C のみのオープン。C</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>AppliChem</td><td>A1069.1000</td><td></td></tr><tr><td>SDS Ultrapure</td><td>AppliChem</td><td>A1112,0500</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>AppliChem</td><td>A1123.1000</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>カタログ番号</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>細胞培養用材料</強力></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-03590</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン/EDTA</td><td>PAN Biotech</td><td>P10-0231SP</td><td></td></tr><tr><td>FBS Good</td><td>PAN Biotech</td><td>P40-37500</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>PAN Biotech</td><td>P06-07100</td><td></td></tr><tr><td>バイオスフィアフィルターチップ(各種サイズ)</td><td>ザルスタット</td><td></td><td></td></tr><tr><td>血清ピペット(各種サイズ)</td><td>ザルスタット</td><td></td><td></td></tr><tr><td>反応チューブ(各種サイズ)</td><td>ザルスタット</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TCプレート 15cm ザルスタットTCプレート 15cm</td><td>ザルスタット</td><td>83.3903</td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社名</td><td>カタログ番号</strong</td><td>>コメント</td></tr><tr><td>材料 銀染色プロトコル</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>J.T.Baker</td><td>8045</td><td></td></tr><tr><td>エタノール絶対</td><td>AppliChem</td><td>1613,2500PE</td><td></td></tr><tr><td>酢酸</td><td>AppliChem</td><td>A0820,2500PE</td><td></td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド 37%</td><td>AppliChem</td><td>A0877、0250</td><td></td></tr><tr><td>エタノール絶対</td><td>AppliChem</td><td>A1613,2500PE</td><td></td></tr>チ<tr><td>オ硫酸ナトリウム</td><td>AppliChem</td><td>1,418,791,210</td><td></td></tr><tr><td>硝酸銀</td><td>AppliChem</td><td>A3944.0025</td><td></td></tr><tr><td>炭酸ナトリウム</td><td>AppliChem</td><td>A3900,0500</td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Special Lab Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>デシケーター</td><td>Nalgene</td><td>5311-0250</td><td></td></tr><tr><td>Megafuge 40</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roter for Megafuge TX750 + Adapter andLlids for 500 mL tubes</td><td>ヘレウス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td>従来の</td><td></td><td></td></tr><tr><td>超遠心分離機例:Optima XPN-80</td><td>ベックマン・コールター</td><td></td><td></td></tr><tr><td>適切な超zentrifuge ローター例:><ベ</td><td>ックマン・コールター</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH メーター</td> クランプ付き<td>従来型</td><td></td><td></td></tr><tr><td>スタンド</td><td>従来型</td><td></td><td></td></tr><tr><td>グースネックランプ</td><td>従来型</td><td></td><td></td></tr><tr><td>オーバーヘッドローター</td><td>Conventional</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermal Block</td><td>Conventional Photometer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(OD 260)</td><td>Conventional</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

シールドとターゲットの遺伝物質と化学キャプシドのアデノ ウイルスを用いた遺伝子導入ベクターの変更を組み合わせる

Combined Genetic and Chemical Capsid Modifications of Adenovirus-Based Gene Transfer Vectors for Shielding and Targeting

アデノウイルスベクターは、遺伝的のワクチン接種と腫瘍溶解性 virotherapy の強力なツールです。しかし、彼らは体内納入後特に複数の好ましくないベクトル ホスト相互作用しやすいです。ベクトル表面の定義の変更が実行される場合、望ましくないベクトル ホスト相互作用によって課された制限できるだけコンセンサスを克服します。これらの変更には、不要なやりとりから粒子のシールドと、新しい配位子の導入によってターゲットが含まれます。ここで提示されたプロトコルの目標を生成するリーダーを有効にするのにはシールドし、必要な場合に再ターゲット ヒト アデノ ウイルス遺伝子の転送ベクトルまたは腫瘍溶解性ウイルス。プロトコルは、研究者が合成ポリマー、炭水化物、脂質、または他の生物学的または化学鎖の特定の化学吸着によるアデノ ウイルス ベクター カプシドの表面を変更する有効になります。アデノウイルスベクターの生体内での配信のための障壁の克服と理解を容易にするために示されている結合された遺伝物質と化学キャプシドの変更の最先端の技術を説明します。生物学的活性のウイルスやウイルス由来のベクトルで特定の化学反応を実行するための重要なステップの詳細とコメントの説明が提供されます。プロトコルに記載されている技術 (当然欠席) システインの遺伝子の導入に基づいているアデノ ウィルス由来のベクターの溶媒露出ループに残留。これらのシステイン残基が高価にベクトルの生産後、ベクトルにさまざまな物質のクラスから分子の共有結合化学結合を特定性の効率的な悪用されることができます、特定の化学反応性を提供します。粒子。重要なは、このプロトコルは、さまざまな異なるアデノ ウイルス ベクター カプシドの (非チオール ベースの) の化学修飾を行う簡単に適合できます。最後に、それは可能性が高いそのエンベロープを持たないウイルス遺伝子の転送ベクトル以外、アデノ ウイルスは、このプロトコルの基本から変更できます。

図 2は、成功ベクトル生産を示します 293 の (HEK 293) 細胞の細胞変性効果 (CPE) の例を示します。セル型ウイルスベクター接種後 40 〜 48 時間形態 (図 2) が表示されます。収穫のための右の timepoint は、セル換散によってウイルス粒子を失っていないと遺伝子導入のチオール基の酸化を防止するため重要です。ベクトル粒子は、セル換散によって媒体に公開された場合、導入したチオール、すぐに酸化と浄化し、化学的に変更することは困難となります。
図 3は、模範的な CsCl バンドを示しています。化学修飾は、ウイルスの粒子から細胞の残骸を削除する前に、不連続 CsCl バンディングの目的。その後、改変自体は CsCl で起こることができます。化学修飾の後...

ここで説明したプロトコル具体的に単純な化学によって選定されたサイトでアデノ ウイルスのカプシドを変更することも可能。 にします。シールド アデノ ウイルス粒子のベクトルし、ターゲット遺伝子の転送ベクトルを生成することができます、ベクトル ホストの相互作用を学ぶことができます。

Adenovirus vectors are potent tools for genetic vaccination and oncolytic virotherapy. However, they are prone to multiple undesired vector-host ...

この方法は、遺伝子治療、腫瘍症および遺伝子ワクチン接種の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。これは、アデノウイルス遺伝子導入ベクターのベクターホスト相互作用の理解と調節を容易にし、臨床試験で最も頻繁に使用されるベクタータイプを最新の状態にします。この技術の主な利点は、アデノウイルスのカプレートが、選択した位置で、そして単純な化学を用いて、特定の範囲で高度に定義された方法で特異的に修飾することができるということです。ベクターホスト修飾は分析のみではなく、患者指向の方法で変調されるため、この技術の意味は治療にまで及びます。この方法は、特定のベクター宿主相互作用に関する洞察を提供するが、マウスなどの生物におけるウイルス粒子の標識および追跡にも使用され得る。一般的に、この方法に新しい個人は、両方の分野からの実用的な知識を必要とするウイルス学と有機化学のユニークな組み合わせに苦労します。この技術の特別なデモンストレーションは、ここで有機化学の方法が細胞生物学とウイルス学の方法(フィールド固有の処理トリックを含む)を満たすので重要です。この手順を開始するには、テキスト プロトコルで説明されているとおりに、すべてのバッファを準備します。各勾配バッファーの 1 ミリリットルの重量を量って、密度を確認します。すべてのバッファーを殺菌した後、TCEP の酸化を防ぐために、アルゴンガスで TCEP を含むバッファーを約 30 秒間スパージします。固体粉末結合部分を含むバイアルを大きなチューブに保管し、それぞれがシリカゲルビーズのクッションで満たされ、バイアルを解凍する際に凝縮水の蓄積を防ぎます。これらのチューブをデシケータに入れる。デシケータの空気を取り除き、アルゴンガスに交換します。その後、各チューブをしっかりと閉じ、シリカゲルビーズでより大きな容器に移します。すべてのチューブが移動されたら、容器を閉じます。容器は、使用できる状態になるまで摂氏80度で保管してください。解凍する準備ができたら、デシケータのシリカビーズの層に容器を入れます。容器を室温までゆっくりと温め、容器を開けます。細胞が最適な細胞変性影響に達したら、プレートを削り取り、上清を遠心管に移して回収します。細胞懸濁液をGの400倍に10分間回転させる。次に、10ミリモルTCEPを含むAdバッファーの4ミリリットルで細胞ペレットを再懸濁し、得られた溶液を滅菌50ミリリットルチューブに移す。液体窒素で溶液を凍結し、摂氏37度の水浴で解凍します。この凍結融解サイクルを3回繰り返してベクターを救出します。5000Gで遠心分離機、摂氏4度で10分間。遠心分離機は2つの超遠心チューブを設定し、2つの等しいセシウム塩化物ステップ勾配の準備を開始しました。これらのチューブのそれぞれに低相の3ミリリットルを追加します。上部のフェーズをロードする前に、チューブの下のフェーズのレベルをマークします。その後、慎重に下のフェーズに上相の5ミリリットルを積み重ね、チューブの壁に沿って非常にゆっくりとピペットします。勾配が準備され、遠心が完了すると、サンプルから上清が 2 つの勾配に均等にロードされます。各勾配チューブの残りのスペースを、10ミリモルTCEPを含むAdバッファで埋め、チューブを一番上まで満たしてください。反対のチューブの重量をゼロの重量差に調整します。そして、176000倍Gと摂氏4度の遠心分離機を2時間変更します。この後、クランプを使用して1つの超遠心チューブをスタンドに固定します。下のフェーズ レベルの周辺に、アクセス可能とマークを付けておくようにします。グースネックランプをチューブの上に置きます。マークの周り、下側と上の段階の境界で、明確なバンドが表示されるはずです。チューブを針で穿刺し、ベクターバンドを注射器に吸引してベクターを採取する。収集したベクタービロンを15ミリリットルのチューブに移し、テキストプロトコルで概説されているように必要な結合基板の量を計算します。次に、ベクター溶液を適切なサイズのチューブに移す。そして、カップリング化合物ストック溶液の計算量を。室温で1時間、頭上回転で軽く混ぜます。次に、広告バッファーを追加して、ベクター溶液の総体積を 6 ミリリットルに調整します。テキストプロトコルで概説されているように、第2のセシウム塩化物結合ステップを使用して未反応の結合部分からベクターを精製する。針でチューブを穿刺し、ベクターバンドを注射器に吸引する。収集したベクターを15ミリリットルのチューブに移します。両方の勾配管から結合された結合が2.5ミリリットル未満の場合は、Adバッファを追加して2.5ミリリットルに音量を調整します。結合されたビロンを同じアップグレードされたPd列にロードし、フローを破棄します。次に、3 ミリリットルの Ad バッファを列に追加し、フローを収集します。収集した流れに333マイクロリットルのグリセロールを加え、10%の最終濃度を得る。これらを適切なアリコートに分割します。OD 260測定によるより厳しい判定のために20マイクロリットルのアリコートを含むようにする。ベクター溶液を摂氏80度で保存して、使用できる状態にします。293細胞に対する効果の代表的な結果は、ベクター産生が成功したことを示す。細胞は、ウイルスベクターを接種してから40〜48時間後に形態を示すべきである。銀染色SDSファージは、次いで、カップリング効率を評価するために使用されます。ヘクソンを修飾し、変更されていない両方のカプソームペントンベースに導入されたシステインを有するベクターが実行されます。ヘクソンバンドは、キャプシド当たりモノマーの90%以上の変更に成功したことを示すシフトを示す。この手順を試みる間、非モドフィドベクター粒子の還元環境を確保することが重要である。修飾後、規則的な雰囲気が適している。正確なドキュメンタリー計算は、すべてのベクトル粒子の定量的な修正を確実にする必要があります。この技術の開発は、ベクターデリバリーのための安全で不十分な戦略をさらに探求するために、遺伝子治療の分野での研究に役立ちます。この手順に従って、標識のためのリガンドまたは蛍光色素のカップリングのような他の方法は、受容体の使用法および生体分布のような追加の質問に答えるために行うことができる。現地のGMOおよび労働安全規則に従ってください。

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Research

JoVE Journal

Biology

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