Name: 無料のラベル画像の単一蛋白質細胞から分泌される生活 iSCAT 顕微鏡を介して (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: 学ぶiSCAT顕微鏡を用いたラベルフリー単一タンパク質検出法。生細胞から分泌されるタンパク質をリアルタイムで観察し、分子レベルの生物学的プロセスを解析する強力な手法です。

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この作品は、ドイツ研究振興協会 (CRC 1181)、アレクサンダー ・ フォン ・ フンボルト教授、マックス ・ プランク協会によって支えられました。Laz388 細胞を提供して役に立つ議論のため Universitätsklinikum エアランゲン ステファニー · シェーファーに感謝しますテクニカル サポート、MPL でシモーネ ・ Ihloff とマクシム ・ シュワブに感謝します。

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役に立つ iSCAT データを入手する最も重要な側面の 1 つは coverslip 表面と、さらに正しい焦点位置を見つけることができる時間の長い期間のためのこの位置を保持します。これを行うに失敗した拡大 Psf、弱い iSCAT 信号および動力学解析にドリフト関連成果物になります。きれいな、裸 coverslip の焦点面を見つけること表面がない簡単な作業表面の特徴は大規模な参照ビーム背景表示されないが分かった (図 4 dを参照)。
生 iSCAT 画像は、励起ソースの波面不純物から生じる、正しい画像平面を見つけるための能力を妨げることができるバック グラウンド信号によってしばしば隠されています。アクティブな波面減算は、この問題を回避し、その後測定16中 iSCAT フォーカスを監視する便利な方法です。これを実現する方法の 1 つは、spatial サンプル変調を通じてです。簡単に言えば、関数発生器は、50 Hz の方形波を適用周波数 (290 nm 振幅) で空間サンプルの変調の結果、ピエゾ ステージの外部制御ポートに適用されます。同期カメラ買収は、同じソースからと、ロックの原理、波面補償画像14,16の結果を組み合わせる場合にトリガーされます。結果のイメージは、通常カバーガラス (図 4e) の表面粗さを示しています。洗浄後のガラスに残って小さな機能を使用して、焦点に顕微鏡を持って来ることができます。このアクティブな背景減算ステップに使用されるパラメーターは、フレーム レート、露出時間、またはハードウェアにより変更もあり。
前述のように、iSCAT セットアップ (ステップ 1.2.1。) の高品質ビーム ・ スプリッターの使用を推奨すると、ゴーストのような工芸品を画像としてまたは薄い平面ビームスプリッターから生じる干渉が画像に影響を与えるし、測定を妨げます。高品質と低品質のビームスプリッターの比較を図 7に示します。両方生 iSCAT 画像は、いくつかの残留粒子を含む coverslip の同じ領域を示しています。両方の画像をキャプチャする使用された同じ iSCAT セットアップ、ビームスプリッターのみが交換されました。図 7aはカメラの厚い (5 mm) の使用によって形成されたイメージを示しています AR コーティングとくさびのビームスプリッター。くさびの設計のためにビームスプリッターの裏面からの反射光は反射面に起因する反平行と客観的に入ることはありません。工芸品の干渉は発生しません。図 7 bのサンプルにビューの同じフィールドを示していますが、この時間薄く (1 mm) 平面ビームスプリッターを使用しました。ビームスプリッターの前面と背面の面から 2 つの反射は平行し、カメラに伝達します。干渉の工芸品が明確に表示されます。
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58486/58486fig7.jpg"> 図 7: iSCAT 画像の比較生産高と低品質のビームスプリッター 。(a) 5 mm 厚、AR コーティングおよびくさびのビーム ・ スプリッターを使用しての結果生 iSCAT イメージ。(b)結果生 iSCAT 画像 1 mm 厚い平面のビームスプリッターを使用して同じ領域の。両方のビームスプリッター同じ分割比率 (50% 反射、50% 透過) があります。フレネル反射に起因する干渉の工芸品が 1 mm 厚い平面ビームスプリッターで生成したイメージにはっきりしています。スケール バー: 2 μ m.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58486/58486fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
このプロトコルでは、実現するために簡単に高速広域14上並列センシングが可能と、iSCAT の広視野照明スキームをについて説明します。音響光学偏向器 (AODs) を使用してサンプル12,17間で共焦点のビームをスキャンする一般的な方法です。この方法は高品質波面の必要があるが、従来の広視野イメージングよりもっと実験的複雑。さらに、共焦点光の速度は、AODs のによって制限されます。目的の実験的パラメーターに応じてどちら共焦点または広視野照明方式、原則として、利用できる生きている細胞から分泌される単一のタンパク質を検出します。
プロトコルで説明したように、顕微鏡の試料ステージで横方向の機械的変動を最小限に抑えることが不可欠です。サンプルの位置でもナノメートル偏差は、連続カメラ フレームの変化につながるし、差分画像で重要な余分なノイズを誘発することができます。したがって、機械的に安定したステージと減衰光学テーブル (手順 1.1.1。) を使用して (手順 3.5。) 実験中に光のカーテンやパネルを使用してセットアップをカバーするために勧めはします。
長期的な測定のため、アクティブなフォーカス安定化スキームが考え。このアプローチで 2 番目のレーザーは内部全反射 (TIR) 配置で顕微鏡に組み込まれて、その後象限フォト ダイオード上にイメージを作成します。システムのフォーカスの変更は、ピエゾ ステージ26の z 軸を制御するアクティブなフィードバック ループに使用することができるは、象限ダイオード上のスポットの TIR レーザーの水平変位に変換します。長期的な垂直ドリフト効果は従って除去します。
いくつかの変更と拡張機能は、アドレス特定実験ニーズに紹介したテクニックに適用できます。たとえば、商業顕微鏡ステージ インキュベーターがありますそれは iSCAT 顕微鏡細胞の長期的なイメージングのために容易に組み込むことが。ISCAT イメージングなどを補完するために他の技術を実装することも共焦点または TIR 蛍光顕微鏡17。ISCAT 分泌測定はを DMEM など DPBS、他の携帯メディアで実施することができる調査の下でシステムに適応するには、ただし、pH インジケーター フェノールレッド避けるべきであるそれはレーザ光の吸収による実験を邪魔することができます。さらに、牛胎児血清 (FCS) やひと血小板ライセート (hPL) のようなサプリメントは、iSCAT 検出と干渉するかもしれない蛋白質を含んでいます。実験の目的の感度に応じて、これらのサプリメントは、顕微鏡媒体から除外すべき。
iSCAT は散乱光に検体の能力に依存している-すべての蛋白質に本質的なプロパティ-はこうして本質的に非特異的なと。それにもかかわらず、特異性のある程度はタンパク質質量14,27,28直線 iSCAT 信号スケールとして可能です。ウシ血清アルブミン (BSA)、フィブリノーゲン14,27,28などの標準的なタンパク質試料を用いた iSCAT システムの校正が可能になります。実際には、非常に最近、若いら28 Piliarik &amp; に対する14の仕事が拡張されていてその iSCAT はストレプトアビジン (53 kDa) のような小さなタンパク質の分子量 19 kDa の質量分解能と約 5 kDa の精度を決定する使用ことができますを示しています。いくつかの従来のアプローチは、特異性の余分なレベルを提供することによって iSCAT をさらに補完できます。例、酵素抗体法 (ELISA)、他の表面改質と標的タンパク質のみが検出された16タンパク質バインディング イベントを制限します。
このプロトコルで iSCAT 顕微鏡を使用してサブ時間分解能16タンパク質 1 分子レベルで細胞の分泌物を調査する方法について述べる。技術は一般的であり、任意の商用または自作顕微鏡に実装できます。単一分子蛍光のアプローチと対照をなして退色からメソッドを受けないまたは点滅効果が、それまだ単一蛋白質の感度を実現します。これらの機能は、iSCAT バイオセンシングと顕微鏡の分野で強力なツールを作る。将来のアプリケーションは免疫反応の刺激や細胞間コミュニケーションなど複雑な細胞間相互作用の解明に焦点を当てます。

分泌されるタンパク質は、様々 な生理的過程1で重要な役割を果たします。このため、彼らは日常的に集団アンサンブル (プロテオミクス)、または個々 のエンティティ2,3として研究されています。プロテオミクスは伝統的など酵素抗体法 (ELISA), フローサイトメトリー、または質量4,5を経由して特定の生物学的システムで現在の蛋白質の全体のセットを調査します。 6。単一蛋白質、他の一方で、さまざまな蛍光7、8プラズモニクス9,10、または極低温電子11に基づく手法を使用して場合は検出されます一般的に々糸。これらすべての技法は複雑な商品、ラベル、またはその両方を使用して、動的情報に欠ける調査の下でシステムの長期的な情報のみを配信。
ここでサブ秒時間分解能14意味個々 分泌蛋白質 iSCAT12,13顕微鏡を使用します。重要なは、技術は蛋白質12,14日ごとに組み込み弱い散乱信号を検出します。その分極率と小さな bioparticle 散乱光の量をスケーリングします。蛋白質の形によって近似できます、効果的な散乱球14,15,16, と異なると仮定すると蛋白質がある屈折率とよく似て、計測された信号を直接することができます。タンパク質の分子量 (MW) に接続されています。参照による分子量対iSCAT コントラストの経験的な校正サイズの異なる蛋白質を区別することができます。iSCAT 実験は興味14のあらゆる蛋白質の特定の検出を実現する蛍光または散乱のラベルと同様、蛍光顕微鏡17,18、抗体試薬によって容易に補完ことができます。,17,19。
原則として、iSCAT はセカンダリ参照波と干渉の混合による蛋白質の弱い散乱光を増幅することによって機能します。検出された強度 (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq1.jpg">)、iSCAT 顕微鏡によって記述されます
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq2.jpg">
どこ<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq3.jpg">入射強度<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq4.jpg">参照波の貢献のための係数は、<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq5.jpg">研究の下でのナノ物質の散乱強度を示すと<img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq6.jpg">、散乱の位相差は、参照波14。いずれか、透過または反射入射光参照波として各場合で用い<img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq7.jpg">それぞれの透過率や反射率サンプル室のアカウントします。言葉<img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq8.jpg">蛋白質の散乱断面に比例しクロスの用語と比較して無視することができます。したがって、設定<img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq9.jpg">完全な破壊的な干渉の検出された光によって与えられる<img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq10.jpg">、<img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq11.jpg">参照強度と<img alt="Equation 12" src="/files/ftp_upload/58486/58486eq12.jpg">干渉強度です。
iSCAT 顕微鏡では、分子レベルで生物学的過程を研究するための優れた方法を提供しています。Laz388 細胞を調べた例として-エプスタイン ・ バール ウイルス (EBV) 変換 B のリンパ球のセル行20,21 -と彼らは IgG 抗体16等のタンパク質を分泌します。ただし、メソッドは汎用的で、様々 な他の生物系に適用することができます。iSCAT は本質的に特定し、任意のタンパク質を検出することができます。 または特定のまたは多重検出一般的な表面機能化法でナノ粒子またはそれを拡張できます。そのシンプルさと蛍光顕微鏡などの他の光学技術と組み合わせることは、貴重な補完ツール iSCAT を作る、細胞生物学。

<table><tbody><tr><td>アイテム/デバイス</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100x / 1.46 NA対物レンズ</td><td>Zeiss</td><td>420792-9800-000</td><td>alpha Plan Apochromat 油浸</td></tr><tr><td>20x / 0.4 NA 対物</td>レンズ <td>ライカ</td><td>566049</td><td>N Plan</td></tr><tr><td>Piezo Stage</td><td>PI</td><td>P-517k020</td><td>3軸ステージ、100x100x10&micro;m範囲</td></tr><tr><td>ダイオード レーザー (445 nm)</td><td>Lasertack</td><td>PD-01236</td><td></td></tr><tr><td>光学/オプトメカニクス</td><td>Thorlabs/Newport-lenses</td><td></td><td>、ミラー、ポスト、マウント</td></tr><tr><td>ピンホール</td><td>Thorlabs</td><td>P30H</td><td></td></tr><tr><td>LED 光源</td><td>Thorlabs</td><td>MCWHL5</td><td></td></tr><tr><td>ショートパス フィルター (580 nm)</td><td>オメガ オプティカル</td><td>580SP</td><td>の LED のスペクトルを変更します蛍光励起</td></tr><tr><td>ロングパスフィルター(500 nm)</td><td>Thorlabs</td><td>FEL0500</td>蛍光<td>励起</td></tr><tr><td>70R / 30Tビームスプリ</td><td>ッターNewport</td><td>20Q20BS.1</td><td></td></tr><tr><td>エコノミービームスプリ</td><td>ッターThorlabs</td><td>EBS1</td>は<td>、フリンジ効果の比較に使用されます</td></tr><tr><td>ウェッジプレートビームスプリ</td><td>ッターThorlabs</td><td>BSW26</td><td>の比較に使用されますフリンジ効果</td></tr><tr><td>ショートパス ダイクロイック ミラー (550 nm)</td><td>エドモンド オプティクス</td><td>66249</td><td></td></tr><tr><td>8R/92T ビーム スプリッター</td><td>Thorlabs</td><td>BP108</td><td></td></tr><tr><td>CMOS カメラ</td><td>Photonfocus</td><td>MV1-D1024E-160-CL</td><td>iSCAT 取得</td></tr><tr><td>用 CMOS カメラ</td><td>Mightex</td><td>SCE-B013-U</td><td>明視野/蛍光取得用</td></tr><tr><td>ロングパス フィルター (600 nm)</td><td>Thorlabs</td><td></td><td></td>FELH0600</tr><tr><td>Computer</td><td>Fujitsu Siemens&nbsp;</td><td>-</td><td>Core i7プロセッサ、16 GB RAM、SSD</td></tr><tr><td>取得ソフトウェア</td><td>LabVIEW-LabVIEW</td><td></td> <td>2016 スイート</td></tr><tr><td>分析ソフトウェア</td><td>Matlab-Matlab</td><td></td> <td>2014 スイート</td></tr><tr><td>プラズマクリーナー</td><td>ディーナー</td><td>ディーナー ピコ</td><td></td></tr><tr><td>インキュベータ</td><td>ー バインダー</td><td>モデル CB</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>エッペンドルフ</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td><ストロング>試薬/材料</強力></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640培地</td> フェ<td>ノールレッド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPESバッファー溶液なし11835063 Gibco (1M)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>59205C</td><td></td></tr><tr><td>カバースライド</td><td>マリエンフェルド107052</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ガラス底培養皿</td><td>同上</td><td>81158</td><td></td></tr><tr><td>蛍光マイクロスフィア</td><td>Invitrogen</td><td>校正に使用される</td><td>F8821</td></tr><tr><td>Immersol浸漬油</td><td>Zeiss</td><td>444960</td><td></td></tr><tr><td>ヨウ化プロピジウム染色</td><td>Invitrogen</td><td>R37108</td><td></td></tr><tr><td>小型ピペットチップ</td><td>エッペンドルフ</td><td>30075005</td><td></td></tr><tr><td>フレキシブルピペットチップ</td><td>エッペンドルフ</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>エタノール、99.8%</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>E/0650DF/15</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム、ペレット</td><td>Sigma Aldrich</td><td>221465</td><td>0.2M NaOH溶液調製用</td></tr></tbody></table>

無料のラベル画像の単一蛋白質細胞から分泌される生活 iscat 顕微鏡を介して

Label-Free Imaging of Single Proteins Secreted from Living Cells via iSCAT Microscopy

干渉散乱 (iSCAT) 顕微鏡、リアルタイムで個々 の生きている細胞から分泌される単一のラベルのない蛋白質を検出することができる方法を紹介します。このプロトコルでは、iSCAT 顕微鏡を実現し、調査の下で細胞の生存率を監視する追加画像チャンネルとそれを補完する基本的な手順を取り上げます。次に、彼らは我々 を不死化 B 細胞ライン (Laz388) を示す細胞から分泌されるように単一蛋白質のリアルタイム検出メソッドを使用します。顕微鏡やサンプルの準備だけでなく、記録されたデータの分析に関する必要な手順を説明します。ビデオ プロトコルを示しますその iSCAT 顕微鏡単一分子レベルでの分泌を調査する簡単な方法を提供しています。

ISCAT 顕微鏡の模式図を図 4 aに示します。代表的な明るいフィールド、蛍光、および raw iSCAT 画像、図 4 b 4 c 4 d、それぞれ16のとおりです。図 4 eと4 階背景除去と差分のポスト処理の結果を表示します。2 つの吸着タンパク質が図 4 階で回折限界のスポットとして表示されます。図 6 125 にわたって検出された蛋白質のヒストグラムを示しています s。これらのデータは、ピークを求めるアルゴリズムをバインディング イベントをカウントし、そのコントラスト16のカタログ撮影した画像に適用することによって得られました。総数 503 タンパク質が検出されました。
次に、分泌された種は精製タンパク質溶液、または機能性ガラス面14,16追加測定実施参照の測定との比較による識別されます。ISCAT データしたがって、直接サブ スケール16細胞分泌動態を可視化します。例としては、以前、IgG 抗体 Laz388 secretome の主要な一部分であるし、2 番目16あたり約 100 分子の割合で細胞から解放されることを発見しました。さらに、100 kDa - 1000 kDa の範囲にわたる他の粒子は16セルによって分泌されます。説明メソッドのさらに採用など分泌物、16セルの周囲の空間の濃度勾配を調査したり細胞換散16のダイナミクスを確認できます。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58486/58486fig6.jpg"> 図 6: 単一 Laz388 細胞から分泌されるタンパク質の定量化します。ヒストグラムは、125 s. コントラスト値は 1 × 10-4コントラスト箱 (青い棒) の蓄積の期間中に検出された蛋白質を示しています。503 個々 の蛋白質の合計は、この測定値の中に数えられました。実験と同様の結果 10 回を繰り返した。この図は、マクドナルド、m. p.らから適応されています。16. 著作権 2018年アメリカの化学社会。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58486/58486fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

彼らは生きた細胞から分泌される、単一ラベルのない蛋白質のリアルタイム光検出のためのプロトコルを提案します。これは干渉散乱 (iSCAT) 顕微鏡は、様々 な異なる生物学的システムや構成に適用することができますに基づいています。

無料のラベル画像の単一蛋白質細胞から分泌される生活 iSCAT 顕微鏡を介して

We demonstrate interferometric scattering (iSCAT) microscopy, a method capable of detecting single unlabeled proteins secreted from individual living ...

金ナノ粒子の検出と分光法の文脈で、2004年に初めてiSCATを発表しました。その後の10年間で、ウイルスや小タンパク質などの生体ナノ粒子の検出と追跡のために、この技術をさらに開発しました。技術の本質は、どんなに小さくても、どんな物質物体でも有限の絶滅断面を有するということです。この手法の主な利点は、ラベルなしの検出です。これは、十分に敏感であれば、単一細胞から分泌されるタンパク質やエキソソームなど、何でも検出できることを意味します。注意しなければならない問題は、散乱背景をどのように扱うかです。iSCAT顕微鏡の大きな利点は、それが完全に家に建てることができ、既存の商業用顕微鏡に追加することができるということです。これは、蛍光などの他の光学技術と簡単に組み合わせることができることを意味し、これは多くのグループが現在iSCATおよび関連技術を採用している理由の1つです。ここでは、LUZ細胞をモデルシステムとして利用し、個々の分泌タンパク質の検出を示します。しかし、この方法は、分子レベルでのほぼすべての生物学的プロセスをプローブするためにも適用することができる。安定した顕微鏡を実現するには、減衰した光学表とサンプルステージ用の剛性の大きなブロックから始めます。高い数値開口の目的と、横方向のサンプル翻訳と目的の焦点位置の変更を可能にする翻訳単位を組み込んだ顕微鏡サンプルステージを構築します。45度の垂直カップリングミラーと50センチメートルの焦点距離一重レンズを使用して、波長445ナノメートルのダイオードレーザーの光を目的の背面焦点面に焦点を合わせます。この広視野レンズは、iSCAT照明源となる目的の前方焦点にコリメートビームを作成します。液浸油の液滴を目的に塗布し、顕微鏡ステージのサンプルプレーンにガラスカバースリップを配置します。これにより、撮像目的を通して反射するビームが得られます。撮像経路を設定するには、入射ビームに対して45度の角度で、広視野レンズの約10センチメートル後に反射被覆ビームスプリッターを導入します。反射防止コーティングがレーザー光源を指していることを確認します。レーザーが目的にまっすぐに入らないように、厚いビームスプリッターが重要なビーム変位をもたらすので注意してください。必要に応じて、レーザービームパスをビームスプリッターの前に再調整して、目的を通して正しい伝播を確実にします。サンプルプレーンとカメラがパーフォーカルであることを確認するには、入射ビームパスの広視野レンズの後の5センチメートルの位置に45センチメートルの負の焦点距離の凹型レンズを配置して開始します。これにより、コリメートされたビームが目的の背面開口に入ります。画面を干渉計の反射アームに配置して、目標を垂直方向に移動して、粗い焦点位置を見つけます。目的は、画面に当たるビームがコリメートされたときに焦点を合わせられます。粗焦点が完了したら、負の焦点レンズと画面の両方を取り外します。2つ目の50センチメートルの焦点距離一重レンズを追加して、散乱光を焦点を合わせ、反射光をコリメートします。レンズが目的のバック焦点面から50センチメートル配置され、送信されたレーザー光が再びコリメートされるようにします。iSCAT セットアップアセンブリを完成するには、CMOS カメラを 50 センチメートルの焦点距離レンズから 50 cm 離れた場所に置き、ビームをチップの中央に直接配置します。追加のイメージングチャンネルを設定するには、LED光源の出力を長距離の目標に結合します。LED出力の焦点を合わせ、サンプルに横位置を設定できる、サンプルチャンバの上に機械部品を取り付けます。上の目標を横方向に移動して、上幅フィールドの目標と下側の iSCAT 目標が共線型になるようにします。これは、低い目標の下に画面を配置し、画面上の送信LEDライトの強度を最大化することによって決定されます。次に、550ナノメートルのショートパス二色鏡を設置し、iSCATレーザー経路から送信されたLED光を分割します。このビームを、8%の反射、92%の透過性ビームスプリッタを備えた2つのチャネルに分割します。92%のパスは蛍光チャネルで、8パーセントのパスは明視野イメージングに使用されます。5センチメートルの焦点距離の同色性のダブレットレンズを使用して、CMOSカメラに明視野チャネルをイメージします。5センチメートルの焦点距離の同色性の倍田レンズを使用して、別のCMOSカメラに蛍光チャネルを画像化します。また、600ナノメートルのロングパスフィルタを使用して励起光を遮断します。コンピュータとソフトウェアをセットアップするには、すべてのカメラをコンピュータに接続します。完全に組み立てられた設定では、CMOSカメラのiSCAT画像を観察し、ガラスカバースリップに残りのほこりや汚れの粒子を見つけることによって、それが焦点であることを確認します。パーティクルの画像が円対称点広がり関数であることを確認します。レーザービームがわずかな角度で顕微鏡の目的に入った場合、点広がり関数は円形を持たない。これは、45度ミラーのわずかな調整によって、目的への直線結合を確実にすることによって修正することができる。明視野と蛍光チャネルのカメラ画像を比較します。両方が焦点を合わせ、蛍光ビーズまたは細胞サンプルをイメージングして同じ領域を表示します。iSCATレーザーの位置が画像の中心に近い位置であることを確認し、後で参照できるようにその位置をメモします。明視野と蛍光チャネルの位置と視野を変更するには、焦点を合わせるレンズに対してテーブル上のカメラを動かします。テキスト プロトコルで説明されているように、実験の準備をします。これには、細胞および顕微鏡検査媒体の調製、ならびに顕微鏡サンプルキュベットが含まれる。細胞が直接iSCATレーザー光にさらされるのを防ぐために、レーザー光が遮断されていることを確認してください。調製したセルサンプルの約3マイクロリットルをサンプルキュベットにわずかに中心から外して注入します。ピペットチップをカバースリップにそっと触れ、ゆっくりとセル溶液を注入します。セルがカバースリップに落ち着くようにします。iSCATレーザーに近いセルの数を確認します。セル数が少なすぎる場合は、十分な数が使用可能になるまでこの手順を繰り返します。細胞の被覆が高すぎる場合は、約20マイクロリットルの追加顕微鏡媒体を注入して、カバースリップ全体に細胞を分散させます。圧電変換段階を使用して、サンプルを横に動かして、iSCAT視野に近いセルを配置します。445ナノメートルのレーザー光への直接暴露は細胞にとって有害である可能性があるため、細胞がiSCAT視野に入らないようにしてください。iSCATレーザービームのブロックを解除し、カバースリップ面が焦点を合わせ続けていることを確認します。周囲からのドリフトと音響結合を最小限に抑えるために、分離テーブルを囲みます。iSCAT、明視野カメラ、蛍光カメラから画像を取得して測定を開始します。定期的に細胞の生存率とシステムのフォーカスをチェックします。ここでは、カメラ画像を表示するために自己記述顕微鏡ソフトウェアを使用する。ここで、微分イメージングは、連続したフレームの減算によってリアルタイムに行われ、タンパク質結合を可視化する。これにより、フィルター処理された画像が、生のカメライメージと共に画面に表示されます。iSCATを用いて行った細胞分泌実験の代表的な結果を以下に示す。ビデオは、2分間にわたってLAZセルの分泌物を示しています。左の微分iSCAT画像は、カバーグラスへの単一のタンパク質の吸収を可視化します。右側の明視野画像と蛍光チャネルは、細胞の生存率を監視するために使用されます。このヒストグラムは、検出されたタンパク質とそのコントラスト範囲を、その 2 分間の期間内に示しています。データは、カスタムピークシークアルゴリズムを使用して、iSCATビデオデータの各フレーム内の個々のバインディングイベントを分析することによって収集されました。ISCAT顕微鏡は、ナノオブジェクトの標識のない検出をリアルタイムで可能にするため、バイオセンシングだけでなく顕微鏡でも強力なツールです。特に、タンパク質の拡散や輸送などの様々なプロセスに適用することができる。光散乱に対する絶妙な感度により、iSCATは視野の任意のタンパク質またはエンティティを検出することができます。もちろん、これは蛍光がもたらす特異性を欠いていることを意味しますが、この問題を回避するために、表面官能化のような追加の方法を適用して目的の特定のタンパク質を検出することができます。レーザーを使用すると危険な作業が可能であり、顕微鏡を組み立てて調整する際には、適切な眼保護を常に着用する必要があります。分泌物のリアルタイム検出は非常にエキサイティングであり、現在ははるかに長い時間を必要とし、単一のタンパク質感受性から非常に遠い医療診断の大きな飛躍です。メソッドのパフォーマンスを向上させ、そのアプリケーションを拡張するための十分な余地がまだあります。だから私たちは、このビデオは、他のグループがこのエキサイティングな努力に参加するのに役立つことを願っています.

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