リアルタイム可視化と完全にそのままマウス軟骨外植片の機械的荷重により軟骨損傷の解析

この方法は、異なる機械的負荷レジメン、環境条件、または軟骨変性の段階が、関節軟骨細胞の脆弱性に及ぼす影響の調査を可能にする。物理的な力。他の技術とは異なり、これらの測定は、ネイティブ境界条件を損なうことなく、リアルタイムで完全に無傷の軟骨で行われます。

この技術のもう一つの利点は、マウスモデルを使用して、特定の遺伝子が機械的損傷におけるその部位軟骨細胞の感受性にどの程度影響するかをテストできるようにすることです。遠位大腿骨の解剖のために、マウスを膝の位置に置き、膝の前部に5ミリメートルの皮膚切開を行う。膝の周りまで切開を伸ばします。

そして、膝関節と脚の筋肉を露出させるために皮膚を引き戻します。大腿骨の近位端から始めて、数11のメスの刃を使用して骨に沿って遠位方向に切断する。四頭筋腱部と大腿骨シャフトの前側との間に刃を配置する。

膝蓋骨を越えて切開を延長する。膝蓋腱の真ん中を切断して四頭筋腱部を取り除く。次に、大腿骨の近位端から始まり、ハムストリング筋腱部と大腿シャフトの後側との間にメスの刃を配置し、骨に沿って遠位方向に切断する。

切開が膝関節に近づくと、軟部組織を切り抜き、膝関節を越えて切り終える。四頭筋とハムストリングの筋肉を引き戻して大腿骨を露出させます。そして、骨の側側および内側の側面に余分な筋肉を切り取る。

近位脛辺の後部側のふくらはぎの筋肉を切る。そして、大腿骨の後部側を視覚化するために脚を反転させます。膝関節の周りの余分な組織を取り除き、大腿骨の遠位顆と近位脛骨の後面を露出させる。

前房と後十字靭帯を大腿骨顆から切り離します。そして脛骨を大腿骨から引き離し、すべての靭帯を切断して下肢を大腿骨から分離する。標準的な解剖はさみを使用して、側側から脛骨関節の約8ミリメートル上の骨の近位端で大腿骨を切断する。

そして、大腿骨から周囲の柔らかい組織を除去するために宝石商の鉗子を使用してください。次に、大腿骨の遠位端で両方の顆に軟骨を露出させる。関節表面をHBSSで定期的に水和する。

上腕骨の解剖のために、マウスを上方位置に置きます。そして、肘の後部側に5ミリメートルの切開を行うためにマイクロハサミを使用してください。肘の周りの切開を伸ばし、腕と肩の筋肉を露出させるために皮膚を引き戻す。

上腕骨の近位端から始まり、上腕骨の後部側と三頭筋腱部との間に数11個のメスの刃を配置する。そして、遠位方向に骨に沿ってカットします。上腕骨の遠位端に向かって切開を伸ばし、三頭筋腱を通り、上腕頭が露出するまで上腕骨の近位端に向かって三頭筋を引き戻す。

関節面に触れることなく、上腕頭の周りの結合組織を切断します。そして、体から手足を取り除きます。HBSSで上腕頭の関節面を水和します。

腕から上腕骨を切断するには、腕の後部側の尺骨の近位端を断ち切るために鉗子を使用します。そして、骨の余分な組織を取り除き、上腕骨の遠位端の周りの結合組織を切断します。その後、標準的な解剖はさみを使用して、上腕骨の後部側の三角結節性を除去する。

そして、HBSSを含む1.5ミリリットルマイクロ遠心分離管に解剖標本を置きます。サンプルのカルセインAM染色の場合、骨をHBSSで10.05マイクロモルカルセインの500マイクロリットルを含む1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに移します。そして、光から保護された800 rpmで摂氏37度のサーモミキサーにチューブを置きます。

30分後、新鮮なHBSSで10分間洗浄します。そして、後大腿骨顆または上腕頭の関節面がガラスの上に座っているような、カスタム顕微鏡取り付け式機械検査装置のガラススライドに標本を移す。HBSSで検体を水和し、試料と一緒に装置を蛍光顕微鏡のステージに置きます。

4倍の倍率で負荷アプリケーションの前にカルセインAMで染色された関節軟骨細胞を画像化する。取得の設定を調整して、画質を最適化します。静的機械的荷重を適用するには、関節軟骨がカバーガラスに対して5分間圧縮されてから、負荷を取り除くように、所定の静的負荷を試料の上に保持します。

衝撃機械的荷重を適用するには、所定の高さから既知の重量の円筒型インコンパクタを試料にドロップし、衝撃の5秒後に荷重を解放します。いずれかの負荷が除去された直後に、HBSSの1ミリリットルで調製した60マイクロモルヨウ化物で試料をインキュベートする。室温で5分間、ちょうど実証したように蛍光顕微鏡による関節軟骨細胞を再画像化する。

機械的荷重の適用による傷ついた細胞と死んだ細胞の面積を定量化するために、まず、ImageJで機械的負荷の適用前後に取得した関節面の顕微鏡写真を開く。画像をスタックに結合します。イメージの解像度に基づいて、イメージのスケールを設定します。

次に、細胞がカルセイン陰性とPI陽性になった領域を定義します。これらの細胞は、負傷または死んでいると考えられています。次に、測定ツールを使用して、負傷死細胞の面積を決定します。

試験された少なくとも6個の負荷プロトコルは、8〜10週齢のバルブCマウスから得られた大腿骨および上腕軟骨軟骨における細胞損傷の定量可能な局所領域を再現的に誘発した。テストされたすべての負荷プロトコルにおいて、大腿骨および上皮両方における細胞損傷の空間的な範囲を、より高い負荷の大きさおよびより高い衝撃強度が著しく悪化させた。この切片を行う間、これは標本の能力によってベースラインを損なう可能性があるため、手術用具で関節軟骨に接触しないことを覚えておくことが重要である。

このミラーリングモデルの使用は、疾患が遺伝的、食事的、または外科的操作を通じてマウスで容易に誘発されるように、変形性関節症の研究を容易にすることができる。また、基礎科学の質問を調査し、軟骨細胞の機械的脆弱性を標的とした治療介入をスクリーニングするためのツールも提供しています。