Name: 蛍光共焦点顕微鏡を用いた単純ヘルペス ウイルス 1 蛋白質の核-細胞質転流の時空間解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: 学ぶ蛍光共焦点顕微鏡を用いたHSV-1感染時のICP0タンパク質の核-細胞質転流の時空間解析法。この手法はタンパク質動態の定量解析とウイルス感染メカニズム研究の基盤となる。

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海東区受賞 NIH グラント (RO1AI118992) からの財政支援に感謝いたします。テクニカル サポートのウェイン州立大学で顕微鏡、イメージング ・ フローサイトメトリー リソース (MICR) コア施設に感謝いたします。

1. 細胞とウイルス感染
<ol><li>20-24 h ウイルス感染前に、シード 5 x 10 の4 (HEL) ひと胎児肺線維芽細胞や他の細胞成長培地 (ダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) 10% 胎児ウシの 4 も 11 mm ずらしてスライドの検討血清 (FBS))。5% 二酸化炭素 (CO2) 37 ° C でセルを孵化させなさい。 注: 各よく必要があります 70-80% のセル confluency 感染症の時に。</li>
	<li>次の日に成長培地を削除し、4-10 pfu/セルの範囲に媒体 199 のウイルスの細胞に感染します。37 ° C で 1 時間のウイルスに感染した細胞を孵化させなさい潜伏期間中にスライドを揺れ続けてください。</li>
	<li>1 時間培養後削除中 199 培地で補うので。 注: この手順またはウイルス吸収する前に、フェーズ別の感染を妨げる薬を追加できます。</li>
	<li>5% CO2感染期間の様々 な長さの 37 ° C でウイルスに感染した細胞を孵化させなさい。</li>
</ol>2. 固定・透過
<ol><li>適切な感染症時に、すぐに 3 回リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で感染した細胞を洗浄し、200 μ L の PBS で作りたての 4% パラホルムアルデヒドを追加します。各ウェルに、細胞を修正する室温で 8-10 分のパラホルムアルデヒドとセルを孵化させなさい。</li>
	<li>パラホルムアルデヒドを吸引し、3 回 200 μ L の PBS で洗浄します。完全に 3rd洗浄後 PBS を吸い出しなさい。</li>
	<li>5-10 分のセルを permeabilize 各ウェルに 100 μ L の 0.2% 非イオン性界面活性剤を追加します。</li>
	<li>非イオン性界面活性剤を吸引し、3 回 200 μ L の PBS で洗浄します。</li>
</ol>3. 免疫蛍光染色
<ol><li>完全に PBS を吸引各ウェル内のブロック バッファー (1% ウシ血清アルブミン (BSA) および PBS で 5% 馬血清) 200 μ L を追加し、一晩 4 ° C、1 時間室温で孵化させなさい。</li>
	<li>ブロック バッファーで一次抗体 (ウサギ抗 ICP0 抗体12) の実験的決定の濃度を追加し、4 ° C、2 時間室温で一次抗体を一晩インキュベートします。</li>
	<li>10 分間インキュベーションで 3 回ブロック バッファーで洗浄します。Alexa 594 共役ヤギ抗うさぎ二次抗体 (ブロック バッファーで希釈 1: 400) を追加し、スライドに 1 時間室温で孵化させなさい。10 分間隔でスライド ブロック バッファーで 3 回洗います。</li>
	<li>残留 BSA と馬の血清を削除する PBS で一度スライドを最後に洗います。</li>
	<li>4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) スライドをマウントし、透明なマニキュアを使用して coverslip のシールでメディアを antifade マウントの 1 滴を追加します。</li>
</ol>4. 共焦点レーザー顕微鏡
<ol><li>共焦点顕微鏡を用いた DAPI の Alexa 594 と 410-520 nm の 590-650 nm の範囲で波長を設定します。1024 x 1024 の画像形式と高解像度の画像を取得する 8 行平均を選択します。</li>
	<li>共焦点顕微鏡の下で 4 もスライドの各ウェルを分析します。図 1および図 2に示すように 100 X 目的として代表的な細胞像を取得します。</li>
	<li>多数のセルをカウントするため、40 X 目的の下の連続したフィールドの画像を取る。 注: 各感染症の各時点から 200 以上の感染した細胞を蓄積する 5-10 の画像が必要です。</li>
	<li>各実験で比較するすべてのサンプルの必要性のための定数の共焦点パラメーターで写真を撮る。</li>
</ol>5. 核と細胞質分布を解析
<ol><li>共焦点アプリケーション ソフトウェアでプロジェクトを開く。細胞が ICP0 の核と細胞質分布を集計する必要がありますイメージを選択します。</li>
	<li>トップ メニューから「量」をクリックし、、ツール メニューから「ソート ・ ロワ」を選択します。</li>
	<li>トップ メニューから「線を描画」を選択分析するの縦線を描画します。 注: ICP0、DAPI の線に沿って蛍光強度を示すヒストグラムが表示されます。ヒストグラムに青い線が DAPI ピクセルを表し、赤い線が ICP0 ピクセルを表すに対し、核の境界をマークします。</li>
	<li>
背景の汚損を基に、各実験における ICP0 の細胞内分布を解析する ICP0 強度定数のしきい値を設定します。
	<ol>
<li>において例示するとおり図 2、赤い信号の平均場合は核領域のしきい値を下回るが、青の境界を越えてしきい値を超えている、主に細胞質内に位置する、赤い信号を分類します。</li>
		<li>赤い信号が核の内外青い信号の境界のしきい値を超える場合、核と細胞質局在赤信号をグループ化します。</li>
		<li>赤い信号が核のしきい値を超えている、平均で青い信号の境界の外側の下にある場合、核局在化として赤い信号をグループ化します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>別の感染時と時間 (図 3) によると ICP0 の動きを説明するために棒グラフでプロットで各サンプルから 200 以上の感染した細胞を集計します。</li>
</ol>

<ol><li>Whitley, R., Kimberlin, D. W., Prober, C. G., et al. Pathogenesis and disease. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWhitley%2C+R+%22Human+Herpesviruses%3A+Biology%2C+Therapy%2C+and+Immunoprophylaxis%22">Human Herpesviruses: Biology, Therapy, and Immunoprophylaxis</a>. Arvin, A., et al. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2007).</li>
<li>Roizman, B., Knipe, D. M., Whitley, R. J., et al. Herpes simplex viruses. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRoizman%2C+B+%22Fields%27+Virology%22">Fields' Virology</a>. Knipe, D. M. , 6th Edition, Lippincott-Williams & Wilkins. USA. 1823-1897 (2013).</li>
<li>Gu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infected+cell+protein+0+functional+domains+and+their+coordination+in+herpes+simplex+virus+replication%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Infected cell protein 0 functional domains and their coordination in herpes simplex virus replication.</a> World Journal of Virology. 5 (1), 1-13 (2016).</li>
<li>Lopez, P., Van Sant, C., Roizman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirements+for+the+nuclear-cytoplasmic+translocation+of+infected-cell+protein+0+of+herpes+simplex+virus+1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Requirements for the nuclear-cytoplasmic translocation of infected-cell protein 0 of herpes simplex virus 1.</a> Journal of Virology. 75 (8), 3832-3840 (2001).</li>
<li>Kawaguchi, Y., Van Sant, C., Roizman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+1+alpha+regulatory+protein+ICP0+interacts+with+and+stabilizes+the+cell+cycle+regulator+cyclin+D3%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus 1 alpha regulatory protein ICP0 interacts with and stabilizes the cell cycle regulator cyclin D3.</a> Journal of Virology. 71 (10), 7328-7336 (1997).</li>
<li>Mullen, M. A., Ciufo, D. M., Hayward, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+intracellular+localization+domains+and+evidence+for+colocalization+interactions+between+the+IE110+and+IE175+nuclear+transactivator+proteins+of+herpes+simplex+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Mapping of intracellular localization domains and evidence for colocalization interactions between the IE110 and IE175 nuclear transactivator proteins of herpes simplex virus.</a> Journal of Virology. 68 (5), 3250-3266 (1994).</li>
<li>Maul, G. G., Everett, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nuclear+location+of+PML%2C+a+cellular+member+of+the+C3HC4+zinc-binding+domain+protein+family%2C+is+rearranged+during+herpes+simplex+virus+infection+by+the+C3HC4+viral+protein+ICP0%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">The nuclear location of PML, a cellular member of the C3HC4 zinc-binding domain protein family, is rearranged during herpes simplex virus infection by the C3HC4 viral protein ICP0.</a> Journal of General Virology. 75 (6), 1223-1233 (1994).</li>
<li>Chelbi-Alix, M. K., de The, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+virus+induced+proteasome-dependent+degradation+of+the+nuclear+bodies-associated+PML+and+Sp100+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Herpes virus induced proteasome-dependent degradation of the nuclear bodies-associated PML and Sp100 proteins.</a> Oncogene. 18 (4), 935-941 (1999).</li>
<li>Zheng, Y., Samrat, S. K., Gu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Tale+of+Two+PMLs%3A+Elements+Regulating+a+Differential+Substrate+Recognition+by+the+ICP0+E3+Ubiquitin+Ligase+of+Herpes+Simplex+Virus+1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">A Tale of Two PMLs: Elements Regulating a Differential Substrate Recognition by the ICP0 E3 Ubiquitin Ligase of Herpes Simplex Virus 1.</a> Journal of Virology. 90 (23), 10875-10885 (2016).</li>
<li>Lanfranca, M. P., Mostafa, H. H., Davido, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HSV-1+ICP0%3A+An+E3+Ubiquitin+Ligase+That+Counteracts+Host+Intrinsic+and+Innate+Immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">HSV-1 ICP0: An E3 Ubiquitin Ligase That Counteracts Host Intrinsic and Innate Immunity.</a> Cells. 3 (2), 438-454 (2014).</li>
<li>Zheng, Y., Gu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+three+redundant+segments+responsible+for+herpes+simplex+virus+1+ICP0+to+fuse+with+ND10+nuclear+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Identification of three redundant segments responsible for herpes simplex virus 1 ICP0 to fuse with ND10 nuclear bodies.</a> Journal of Virology. 89 (8), 4214-4226 (2015).</li>
<li>Samrat, S. K., Ha, B. L., Zheng, Y., Gu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Elements+Regulating+the+Nuclear-to-Cytoplasmic+Translocation+of+ICP0+in+Late+Herpes+Simplex+Virus+1+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Characterization of Elements Regulating the Nuclear-to-Cytoplasmic Translocation of ICP0 in Late Herpes Simplex Virus 1 Infection.</a> Journal of Virology. 92 (2), e01673-e01617 (2018).</li>
<li>Gu, H. <a target="_blank" href="https://www.futuremedicine.com/doi/abs/10.2217/fvl-2018-0038">What role does cytoplasmic ICP0 play in HSV-1 infection?</a> Future Virology. 13 (6), (2018).</li>
<li>Ettinger, A., Wittmann, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24974023">Fluorescence live cell imaging.</a> Methods Cell Biology. 123, 77-94 (2014).</li>
<li>Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+microscopy+-+tips+and+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Live-cell microscopy - tips and tools.</a> Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).</li>
<li>Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+proteins+as+a+toolkit+for+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Fluorescent proteins as a toolkit for in vivo imaging.</a> Trends in Biotechnology. 23 (12), 605-613 (2005).</li>
<li>Teng, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+proteins+inside+living+cells+using+external+fluorophores+for+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Labeling proteins inside living cells using external fluorophores for microscopy.</a> Elife. 5, e20378(2016).</li>
<li>Stephens, D. J., Allan, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+microscopy+techniques+for+live+cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Light microscopy techniques for live cell imaging.</a> Science. 300 (5616), 82-86 (2003).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

このプロトコルは、HSV-1 ICP0 の核-細胞質の転流を研究に使用されています。ICP0 は、HSV-1 感染 (図 1) の細胞内輸送を受けます。おそらく、ICP0 は別の場所で異なる機能を実行する各種の細胞経路と対話します。これにより、人間のホスト13と綱引きの複数機能を微調整する ICP0。しかし、ICP0 が時空の方法で複数の機能を調整する方法はよく研究されていません。上記蛍光顕微鏡のプロトコルと ICP0 核・細胞質移行の分子基盤の解析を始めました。今では、我々 は ICP0 の C 末端を識別したこの転置のために重要な必須の要素として 35 アミノ酸。C 末端がない場合は、ICP0 は感染症 (図 3) 核内で拘束されました。また、発見した、ICP0 E3 リガーゼ依存核保持力遅延、核-に-細胞質移行 U2OS セル12。さらに、我々 は ICP0 C 末端と後半のウイルス蛋白質の表現を核の保持を克服し、細胞...

単純ヘルペス ウイルス (HSV-1) の 1 により軽度口唇ヘルペス、性器ヘルペス、間質性角膜炎、脳炎など重症のヘルペス性疾患の広い範囲です。一度感染すると、ウイルスは神経節ニューロンに終生潜伏感染を確立します。時折、ウイルスの場合は、発熱、ストレス、免疫抑制1、再発ヘルペス感染症につながるなど様々 な理由で再アクティブ化できます。感染細胞内蛋白質 0 (ICP0) は、溶解と潜熱の HSV-1 感染の重要なキーのウイルス レギュレータです。それは下流のウイルス遺伝子を介してホスト組み込み/自然の抗ウイルス防御2,3に対抗する transactivates します。ICP0 は、プロテアソーム依存低下3のいくつかの細胞因子を対象とする E3 ユビキチン リガーゼ活性があります。それはまた様々 な細胞経路の活動を規制する、その後ホスト抗ウイルスの制限3を相殺すると対話します。ICP0 は、別の細胞内コンパートメントに感染が進む3,4,5を検索する知られています。タンパク質はリジン/アルギニンが豊富な核ローカリゼーションのシグナル (NLS) 残基 500 に 5066時位置します。初期の HSV-1 感染のde novo合成時に ICP0 すぐに核にインポートされます。それは最初構造と呼ぶ核ドメイン 10 (ND10) 動的核で検出は7。ICP0 ユビキチン E3 リガーゼ活性をトリガー ND10 オーガナイザー タンパク質、前骨髄球性白血病 (PML) 蛋白質およびまだらタンパク質 100 kDa (Sp100)8,9,10の劣化。主催者蛋白質の損失の後 ND10 核ボディに分散され、全体の核4,11に合わせて ICP0 を拡散します。
興味深いことに、ウイルスの DNA 複製の発症後、ICP0 は核から消えます。HSV-1 感染4,12後半核-細胞質移行が示唆された、細胞質にあるのみ。DNA 複製の要件は、HSV-1 ICP04,12の細胞質の転流を促進することで後半ウイルス蛋白の潜在的な関与を意味します。どうやら ICP0 時空ファッションの様々 な携帯電話経路にその相互作用を調節するために権限を与える ICP0 は伝染の間に別のコンパートメントの間で人身売買とその座標罰金に複数機能のバランスを調整溶解と潜在的な HSV-1 感染13。ICP0 多面的と溶菌感染全体の ICP0 の機能ドメインの連携を理解し、私たちは慎重に動的 ICP0 転座12の分子基盤を解剖しました。機構研究以前に報告された12を実施するには、共焦点顕微鏡の下の別の感染状態で ICP0 内局を可視化する蛍光染色法を適用した.我々 はまた分布を分析する核と細胞質 ICP0 の共焦点のソフトウェアを使用して量的なプロトコルを開発しました。感染症の段階で感染した HSV-1 セルの人口を一覧表し、異なる生化学的治療12歳未満、ICP0 運動の動向を分析しました。ここで詳細なプロトコル HSV-1 感染でそのドキュメント ICP0 転座について述べる。ライブ イメージング ライブ イメージングがために該当する場合に代替として使用できる他のウイルスや細胞蛋白質のため核と細胞質移行を検討する一般的な方法としてこの方法を採用できることを提案します。メソッド、信号強度、または蛋白質量のラベル付けなどの問題。

<table><tbody><tr><td>Cells and viruses</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human Embryonic Lung fibroblasts (HEL Cells)</td><td>Dr. Thomas E. Shenk (Princeton University)</td><td></td><td>HEL細胞をDMEMで増殖させ、10% FBS</td></tr><tr><td>HSV-1ウイルスストック(F株)</td><td>Dr. Bernard Roizman Lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコ修正されたイーグル」培地 (DMEM)</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp;11965-092</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F0926-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Medium-199 (10x)</td><td>Gibco</td><td>11825-015</td><td></td></tr><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4- well 11 mm staggered slide</td><td>Cel-Line/Thermofisher Scientific</td><td>&nbsp;30-149H-BLACK</td><td></td></tr><tr><td>16% パラホルムアルデヒド溶液(w/v) メタノールフリー</td><td>Thermo Scientific</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher 試薬</td><td>BP151-1C0</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アブミン (BSA)</td> <td>Calbiochem</td><td>CAS 9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>馬血清</td><td>シグマ</td><td>H1270</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, pH7.4)</td><td>Dr. Haidong Gu lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>フィッシャーバイオ試薬</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>フィッシャーバイオ試薬</td><td>BP362-500</td><td></td></tr><tr><td>KCl&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>Fisher Bioreagent</td><td>BP332-500</td><td></td></tr><tr><td>ブロッキングバッファー (PBS with 1% BSA and 5% Horse serum )</td><td>Dr. Haidong Gu lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rabiit Anti-ICP0 antibody</td><td>Dr. Haidong Gu lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PML (PG-M3)-Mouse monoclonal IgG</td><td>santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-966</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594-ヤギ抗ウサギ IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A11012</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-ヤギ抗マウスIgG</td><td>invitrogen</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield MOUTING MEDIUM with DAPI</td><td>Vector laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>パスツールピペット</td><td>Fisher Brand</td><td>13-678-20D</td><td></td></tr><tr><td>Nail Polish</td><td>Sally Hansen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Confocal Microscope</td><td>Leica SP8</td><td></td><td></td></tr><tr><td>共焦点ソフトウェア</td><td>Leica LAS X アプリケーションスイート</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Excel Excel Excel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HERAcell 150i CO2 インキュベーター</td><td>Thermo Scientific</td><td>注文コード 51026282</td><td></td></tr></tbody></table>

蛍光共焦点顕微鏡を用いた単純ヘルペス ウイルス 1 蛋白質の核-細胞質転流の時空間解析

Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy

単純ヘルペス ウイルス (HSV-1) の 1 の感染細胞内蛋白質 0 (ICP0) は、リング型 E3 ユビキチンリ ガーゼを含む即時初期タンパク質です。その後ウイルス遺伝子の活性化とホストの制限要因のプロテアソームの責任です。ICP0 には、標準的な核局在化シーケンス (NLS) が含まれています。デノボ合成直後に核に入り、核を中心にその対策の生体防御機能が実行されます。しかし、感染後の ICP0 のみにある細胞質、HSV-1 感染核-細胞質移行が示唆されました。おそらく ICP0 転座により別の感染段階でその細胞レベル下の場所によるとその機能を調節するための ICP0 です。生物学的機能と ICP0 核・細胞質移行の調節機構を示すために、ICP0 は、HSV-1 感染時に人身売買を監視するための蛍光顕微鏡観察法を変更しました。このプロトコルは、免疫蛍光染色、共焦点顕微鏡イメージング、および核と細胞質分布解析を含みます。このプロトコルの目的は、溶菌感染中 ICP0 運動の定量的なドキュメントに時間コースで撮影した定常共焦点画像を適応することです。ライブ イメージング技術を伴うことがなく他のウイルスや細胞の蛋白質の細胞質局在原子力対を定量的に解析するこの方法を一般化できることを提案します。

分子基盤と ICP0 は、HSV-1 感染時に人身売買の生物学的機能を理解するには、蛍光顕微鏡観察メソッドを使用して別の感染段階で ICP0 の細胞内分布を解析します。図 1は、感染症が進行するにつれて特徴的な ICP0 ローカリゼーションと代表的な細胞を示しています。ICP0 の核-細胞質の転流を定量化する感染細胞を 3 つのグループに分類することによって核の相対的な ICP0 分布を分析: 核局在化、細胞質局在化、核と細胞質局在 (図 2)。ICP0 は伝染の間に人身売買に必要な要素を理解するには、私たちは別の感染段階で野生型の HSV-1 突然変異体 ICP0 の動きを追跡します。ICP0 の細胞内分布感染の異なる時点での集計結果の例を図 3に示します。
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ICP0 は、HSV-1 感染核-細胞質転流を受けます。このイベントの分子メカニズムは知られていません。ここで我々 は将来解明で ICP0 転座を定量的に解析の基盤 HSV-1 感染の ICP0 運動を定量化するためのツールとしての共焦点顕微鏡の使用をについて説明します。

Infected cell protein 0 (ICP0) of herpes simplex virus 1 (HSV-1) is an immediate early protein containing a RING-type E3 ubiquitin ligase. It is ...

この方法は、光イメージングが利用できないシステムにおける核および細胞質転座に関するタンパク質密売分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、光イメージングを伴わずに一時的なタンパク質の動きの研究のための一般的なプロトコルとして適用することができるということです。ウイルス感染の20〜24時間前に、ウイルス感染種子50〜4回ヒト胚性肺またはHEL線維芽細胞は、4つのウェル11ミリメートルのよろめきスライドおよび成長培地上に、5%の二酸化炭素を有する摂氏37度で一晩培養する。培養液をこぼれさせないために、細胞の均等な分布を確保するためにスライドを十分に揺らすことが重要です。翌日、上清を置き換えて、70〜80%のコンフルエント培養物をセルあたり410個のプラーク形成ユニットを含むミディアム199に置き換え、スライドを揺れで摂氏37度に1時間置きます。インキュベーションの終了時に、上清を新しい増殖培地に置き換え、適切な実験感染期間のために細胞をインキュベーターに戻します。ウイルス感染細胞の免疫蛍光染色のために、PBSで細胞を3回速く洗浄する。続いて、PBSあたり4%のパラホルムアルデヒドの200マイクロリットルで8〜10分のインキュベーションが続いた。固定の終わりに、1回の洗浄につき200マイクロリットルのPBSで細胞を3回洗浄し、1ウェルあたり0.2%の非イオン界面活性剤を100マイクロリットルで細胞に5〜10分間透過させる。示されているようにPBSでパーメアビライズされた細胞を3回洗浄し、各ウェルに200マイクロリットルのブロッキングバッファーを加え、室温で1時間のインキュベーションを行います。次に、2時間の室温インキュベーションのために、目的とする一次抗体の適切な濃度を各ウェルに加える。インキュベーションの最後に、新鮮なブロッキングバッファーに3、10分間の洗い込みで結合していない一次抗体を取り除き、光から保護された室温で1時間のインキュベーションのために各ウェルに適切な二次抗体を加えます。インキュベーションの終わりに、デモンストレーションされたブロッキングバッファーで細胞を3回洗浄し、続いてPBSで1回洗浄し、各ウェルにDAPIを添加したアンチフェード実装培地を1滴加えます。その後、スライドの上にカバースリップを置き、透明なマニキュアでカバースロープを密封します。カバースリップを取り付けながら穏やかな圧力をかけると、余分な取り付け媒体が取り除かれ、高品質の画像の取得を確実にするのに役立ちます。標識された感染細胞の共焦点イメージングでは、適切な二次抗体およびDAPI波長を選択し、画像フォーマットを平均線8で1,024 x 1,024ピクセルに設定します。その後、100xの目的の下で4ウェルスライド上の各井戸を画像化します。多数のセルをカウントする場合は、40xの目的の下で同じウェルの連続したフィールドから5〜10個の画像を取得します。ICP0の核分布と細胞質分布を解析するには、共焦点アプリケーションソフトウェアでプロジェクトを開き、画像を選択します。[数量] タブを開き、[ツール] メニューの [対象地域の並べ替え] を選択します。[線を引く]を選択し、解析対象のセルを横切る縦線を描画します。ヒストグラムは、対象タンパク質とDAPIの両方の線に沿って蛍光強度を示して表示されます。背景染色に基づいて、各実験におけるタンパク質の細胞下分布の分析に関心のあるタンパク質の強度に対して一定の閾値を設定する。タンパク質シグナルが、平均して核領域の閾値を下回っている場合、DAPI境界を超えて閾値を超えているが、タンパク質シグナルを主に細胞質内に位置付けて分類する。タンパク質シグナルが核全体の閾値を超え、DAPIシグナルの境界を越える場合は、タンパク質シグナルを核プラス細胞質局在化としてグループ化する。タンパク質シグナルが核内の閾値を上回る場合、平均してDAPIシグナル群の境界外の閾値を下回るが、核局在としてタンパク質シグナルをグループ化する。最後に、各サンプルから200個以上の感染細胞を異なる感染時点で集計し、そのデータを棒グラフにプロットして、時間の経過に応じる目的のタンパク質の動きを示す。実証したように、この方法は、対象となるタンパク質の核細胞質転位の分析を容易にする。例えば、ウイルス感染が進行するにつれて、感染した細胞タンパク質ゼロ、またはICP0細胞内分布変化が進行する。感染時のICP0人身売買に必要な要素を理解するために、ICP0の動きは、異なる感染段階で野生型および変異型ヘルペスウイルス1感染細胞で追跡することができ、感染の異なる時点でのICP0の細胞下分布の評価を可能にする。ウイルスが細胞に等しくアクセスできるように単層培養を使用し、ウイルスのタイトルに従って感染の多重度を正規化して、ウイルス間およびウイルス内で感染の進行が同等になるようにすることを覚えておくことが重要です。この技術は、それぞれの開発の後、生物学および細胞ウイルス学の研究者が、細胞集団内の目的とするタンパク質の時間的な細胞内局在を研究することによってタンパク質の動きを探求する道を開いた。

temporal-analysis-nuclear-to-cytoplasmic-translocation-herpes-simplex

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

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学ぶ蛍光共焦点顕微鏡を用いたHSV-1感染時のICP0タンパク質の核-細胞質転流の時空間解析法。この手法はタンパク質動態の定量解析とウイルス感染メカニズム研究の基盤となる。

蛍光共焦点顕微鏡を用いた単純ヘルペスウイルス 1 蛋白質の核-細胞質転流の時空間解析

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蛍光共焦点顕微鏡を用いた単純ヘルペス ウイルス 1 蛋白質の核-細胞質転流の時空間解析

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