Name: 発展途上ひよこ視蓋接線細胞移動の可視化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-24T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: 学ぶ発生生物学における神経細胞移動のメカニズムを、発展途上のニワトリ視蓋における接線細胞移動の可視化手法を用いて。電気穿孔とタイムラプスイメージングで個々および集団的細胞動態を長期的に観察する方法です。

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この作品は、日本学術振興会科研費助成数によって支えられた Y.W. に 15 K 06740

1。Ovo でエレクトロポレーション
<ol><li>高濃度で蛍光ラベリングの発現プラスミド DNA を準備します。製造元のプロトコル (材料表) によると陰イオン交換カラムを用いたアルカリ溶解法による細菌培養の 200 mL から DNA を隔離します。PCAGGS EGFP と pCAGGS-mCherryNuc 4 μ g/μ l 各最終濃度で混ぜます。 注: プラスミド DNA 精製のエンドトキシンはエレクトロポレーションの最寄りにあります。</li>
	<li>38 ° C 相対湿度 70% で水平方向に肥沃な鶏の卵を孵化させなさい。</li>
	<li>2.5 日後 18 ゲージ針で 20 mL の注射器を使用して、卵の尖った側から卵白 (卵白) 5 mL を排除し、テープで針穴をシールします。</li>
	<li>直径 2 cm の穴を開く (ハンバーガーとハミルトンの9のステージ 17) 実体顕微鏡下で胚の発育段階をチェックして曲線はさみで卵の殻の上部をカットします。もう一度テープで穴を塞ぐ。 注: この手順は、E2.5 E3.0 中にいつでも実行できます。1.3 と 1.4 の手順は、トップのシェルに成長する胎児の血管タイトな添付ファイルを避けるために卵の胚のレベルを下げます。</li>
	<li>E5.5 まで潜伏を続けてください。</li>
	<li>エレクトロポレーション、前に述べられたプラスミド DNA の色付きの高速グリーン (25 mg/mL)、0.5 μ 10 mL をオートクレーブ処理したリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) (100 単位/ml) ペニシリンとストレプトマイシン (100 μ g/mL)、製マイクロ ピペットを含む 10 μ L を準備します。ガラス毛細管ピペット プロセッサを使用します。注射用 DNA の量によって孔の適切なサイズを作るにピペットの先端をカットします。</li>
	<li>穴径 2.5 cm を再び開いて、安定したステレオの顕微鏡の下で卵を設定にハサミでシールのトップのシェルをカットします。卵に PBS を数滴を追加します。2 つの微細鉗子を用いた出血せず、胚を覆う尿膜をはがします。胚の頭から、羊膜を削除します。</li>
	<li>Microspatula で頭を回しながら注入 0.1-1 μ L マイクロ ピペットを使用して左の視蓋の心室に着色された DNA の吸引管に接続されています。 注: DNA の注入量は、実験の目的によって異なります。DNA 溶液をシンク、心室の壁に沿って取り付けます。</li>
	<li>光 tectumis のターゲット領域 (図 1、ステップ 1) の間に配置されるように鉗子型電極 (7 mm と 3 mm 正方形電極) のペアを配置します。 注: DNA は陽極側に electroporated です。</li>
	<li>30 V の前のパルス、1 ms の 5 ms 間隔と 6 V の 4 つ後のパルス、パルス発生器を使用する 10 ms 間隔で 5 ms を充電します。 注: 電子の状態は、電極の距離とサイズに依存します。効率的な遺伝子導入を達成するために十分に強いべきであることが、それは標的組織の正常な発達を保証するために十分な謙虚でなければなりません。</li>
	<li>穴をテープでふさぐし、潜伏を続けます。プラスチックの皿に歯間ブラシで卵白を削除する PBS で電極を浸します。それぞれの卵に 1.7 1.11 を繰り返します。</li>
</ol>2. フラット マウント文化セルの挿入
<ol><li>フラット マウント文化前日準備被覆細胞文化挿入。10 cm の細胞培養皿で蒸留水をフロートいくつかの細胞培養は、オートクレーブに挿入します。8 μ G/ml ラミニンと 80 μ g/mL ポリ-L-リジン挿入をカバーし、37 ° C でセル文化 CO2インキュベーターで一晩フロート挿入のままのソリューションを読み込みます。 注: 次の日にコーティングされた挿入格納できる 4 ° C で</li>
	<li>E7.0 で文化の日、挿入からラミニン ポリ-L-リジンのソリューションを削除し、1.1 ml 培養液 (60% 減少血清中、20 %10 10% 牛胎児血清、f12 キーのガラス底皿 (図 1の手順 2) に挿入を置きます50 単位/mL ペニシリン、50 μ g/mL ストレプトマイシン % ニワトリ血清)。37 ° C でセル文化 CO2インキュベーターで皿を保つ 注: 媒体を変更することがなく 3 日間の培養期間中使用できます。</li>
	<li>文化のセットアップを準備します。40% O2と 5% CO2 (ガス コント ローラー) 38 ° C (温度コント ローラー) でのガス流れと倒立顕微鏡に湿気の多い室内ユニットを設定します。</li>
	<li>胎児の頭をハサミでカットします。冷たいハンクス平衡塩類溶液 (HBSS) 6 cm 細胞培養皿の中に鉗子を頭をつまみます。</li>
	<li>2 つの微細鉗子を用いた electroporated 視蓋を分離します。冷たい HBSS でいっぱい別皿にプラスチック スポイトを蓋を転送します。切断のための受け皿としてブラック シリコンによる凹面ガラスの皿を使用します。</li>
	<li>蛍光実体顕微鏡下でラベルの位置を確認します。蓋組織の顕微鏡下のナイフでラベルの領域を周囲をカットします。組織の方向性の確認蓋 (前方-後方、背腹軸) します。</li>
	<li>ぴあ側が挿入に接続されるので挿入するプラスチック スポイトがラベルの付いたティッシュを転送します。目的の方向に蓋組織を置き、余分な HBSS (図 1、手順 2) を取り外します。</li>
	<li>同じ他の組織を準備するために 2.4 2.7 挿入を繰り返します。倒立の共焦点顕微鏡 (図 1、手順 3) に prewarmed の商工会議所に料理を配置します。</li>
</ol>3. タイムラプス イメージング
<ol><li>蛍光ラベルをチェックし、倒立顕微鏡でミクロな場に焦点を当てます。レーザー共焦点ユニットを起動し、フィールドに X および y 軸に沿って組織の位置や方向を調整する共焦点スキャンをサンプリングしようとします。10 X または浸漬油なし 20 × 対物レンズ使用します。</li>
	<li>スキャン サイズを選択 (例えば512 x 512 dpi)。間隔および z 軸に沿って共焦点スキャンの全範囲を決定します。100 μ m の範囲の 5 〜 10 μ m の間隔を取る。共焦点レーザー顕微鏡とイメージングの期間 (例えば、 10 分間隔 48 時間以上) 合計の時間間隔を決定します。 注: レーザー光毒性を避けるためには、高スキャン サイズ長い z 範囲の z - 間隔が短いまたは長いイメージング期間中に短い時間間隔でのスキャンを禁止します。たとえば、高スキャン サイズ (1024 x 1024 dpiなど) を適用すると、z 軸に沿ってスキャンの数を減らします。</li>
	<li>セット共焦点実行中のパラメーターは、プログラムに記載されている 3.2 とイメージングを開始します。</li>
	<li>イメージング後、すべての時点で焦点微調整で z のイメージを提供する別の z 軸の共焦点画像を組み合わせます。</li>
	<li>異なる時点で z の画像を追加し、AVI 形式でコマ撮りムービーを作成します。</li>
</ol>

<ol><li>Marín, O., Rubenstein, J. L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration+in+the+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cell migration in the forebrain.</a> Annual Reviews of Neuroscience. 26, 441-483 (2003).</li>
<li>Nadarajah, B., Alifragis, P., Wong, R. O. L., Parnavelas, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+migration+in+the+developing+cerebral+cortex%3A+Observations+based+on+real-time+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Neuronal migration in the developing cerebral cortex: Observations based on real-time imaging.</a> Cerebral Cortex. 13, 607-611 (2003).</li>
<li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipolar+migration%3A+the+third+mode+of+radial+neuronal+migration+in+the+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Multipolar migration: the third mode of radial neuronal migration in the developing cerebral cortex.</a> Journal of Neuroscience. 23, 9996-10001 (2003).</li>
<li>Martini, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biased+selection+of+leading+process+branches+mediates+chemotaxis+during+tangential+neuronal+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Biased selection of leading process branches mediates chemotaxis during tangential neuronal migration.</a> Development. 136, 41-50 (2009).</li>
<li>Polleux, F., Whitford, K. L., Dijkhuizen, P. A., Vitalis, T., Ghosh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+cortical+interneuron+migration+by+neurotrophins+and+PI3-kinase+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Control of cortical interneuron migration by neurotrophins and PI3-kinase signaling.</a> Development. 129, 3147-3160 (2002).</li>
<li>Watanabe, Y., Yaginuma, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tangential+cell+migration+during+layer+formation+of+chick+optic+tectum%5BTitle%5D)+AND+%22Development%2C+Growth+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Tangential cell migration during layer formation of chick optic tectum.</a> Development, Growth and Differentiation. 57, 539-543 (2015).</li>
<li>Watanabe, Y., Sakuma, C., Yaginuma, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NRP1-mediated+Sema3A+signals+coordinate+laminar+formation+in+the+developing+chick+optic+tectum%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">NRP1-mediated Sema3A signals coordinate laminar formation in the developing chick optic tectum.</a> Development. 141, 3572-3582 (2014).</li>
<li>Watanabe, Y., Sakuma, C., Yaginuma, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dispersing+movement+of+neuronal+tangential+migration+in+superficial+layers+of+the+developing+chick+optic+tectum%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Dispersing movement of neuronal tangential migration in superficial layers of the developing chick optic tectum.</a> Developmental Biology. 437, 131-139 (2018).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Morphology%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).</li>
<li>Cordelières, F. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+cell+tracking+and+analysis+in+phase-contrast+videos+%28iTrack4U%29%3A+development+of+Java+software+based+on+combined+mean-shift+processes%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Automated cell tracking and analysis in phase-contrast videos (iTrack4U): development of Java software based on combined mean-shift processes.</a> PLOS One. 8, e81266(2013).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9, 676-682 (2012).</li>
</ol>

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

上記で説明したプロトコルは、浅層6,8で細胞の移動を検出に最適です。エレクトロポレーション (E4.5、E5.5) のタイミングと文化の始まりをシフト イメージング (E6.0 に E7.0) だけで中間層の移行ストリーム (映画 5)6、7を検出が可能です。
提示された手順ovo でエレクトロポレーション、フラット マウント文化とタイムラプス顕微鏡を用いたイメージング (図 1) によって分類するセルで構成されます。まず第一に、健康と通常として生体内で成長して、組織を維持する培養条件を最適化するべきであることの前提条件です。また、ティッシュの向きは細胞遊走の検出に適していることを確認する...

ライブ イメージングの進歩技術と細胞移動の研究が進み。蛍光細胞ラベリング後、ビデオ顕微鏡下で培養皿や生体内での標識細胞の時間的な動きを記録できます。神経系の発達の研究では、タイムラプス イメージングを用いた移行細胞または軸索伸長の形態学的変化を分析されてが。効果的なイメージング実験と解析の目的に基づく蛍光細胞ラベリングと組織の準備のための適切な方法を適用が欠かせません。発展途上の脳細胞の移動を分析するため細胞遊走細胞径移行1,2,3などのスライス セクションに平行を観察するスライス培養によく使用されています。スライス培養系も接線方向セル移行4,5の検出用、セルがスライス セクションに垂直を分散の場合指向性分析のため適していません。
視蓋は萌芽期の開発中に放射状および接した細胞移行によって形成された、多層構造で構成されます。蓋層形成心室の地帯から後の神経前駆細胞の放射状移動に主に左右心室ゾーン6生年と相関する層の彼らの最終目的地。接線方向の移動に関しては以前に発展途上のひよこ視蓋の真ん中と表面的な層の移行の 2 つのストリームを報告しました。E6 E8 の中に中間層で長い主要なプロセスと薄い後続プロセスと双極細胞は、7を実行する背腹側蓋の遠心性軸索軸索束に沿って背側または腹側を移行します。この axophilic 移行後、細胞は深い層にある多極神経細胞に分化します。E7 E14 中に表層で移行するセルは複数方向8分岐リード処理および散布を改質による水平方向に分散します。移行を分散後に、後者のセルは、最終的に様々 な形態の表面的なニューロンに分化します。両方のケースでは、フラット マウント文化は軟膜表面に平行細胞運動を観察するが効率的です。
ここでは、発展途上のひよここま7,8で接線方向細胞遊走を視覚化する時間経過イメージ投射のためのプロトコルを提案する.Ovoエレクトロポレーションと携帯文化にその後フラット マウント文化によって分類するセルの組み合わせにより、移行細胞の移動および移行の方向の検出です。このメソッドの目的は、長期と水平面内のセルのグループの集団行動の両方の個々 のセル動作の検出を容易にすることです。

<table><tbody><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Midi Plus EF</td><td>MACHEREY-NAGEL</td><td>740422.5</td><td>エンドトキシンフリープラスミドDNA精製キット</td></tr><tr><td>20mlシリンジ</td><td>テルモ</td><td>SS-20ESZ</td><td></td></tr><tr><td>18ゲージ針</td><td>テルモ</td><td>NN-1838R</td><td></td></tr><tr><td>ファストグリーン</td><td>和光</td><td>061-00031</td><td></td></tr><tr><td>100xペニシリンとストレプトマイシン</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>ガラス毛細管</td><td>成重</td><td>G-1</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養インサート</td><td>ミリポア</td><td>ミリセル CM-ORG</td><td></td></tr><tr><td>ラミニン</td><td></td><td>SIGMA L2020</td><td>培養インサート</td></tr><tr><td>ポリ-L-リジン</td><td>ペプチド研究所</td><td>3075</td><td>培養インサート</td></tr><tr><td>ガラス底皿</td>のコーティング<td>松波</td><td>D11130H</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td>培地</td></tr><tr><td>F12</td><td>Gibco</td><td>11765-054</td><td>培地</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Gibco</td><td>12483</td><td>培地</td></tr><tr><td>ひよこ血清</td><td>Gibco</td><td>16110082</td><td>培地</td></tr><tr><td>10xHBSS</td><td>Gibco</td><td>14065-056</td><td></td></tr><tr><td>マイクロサージェリーナイフ</td><td>外科専門協力</td><td>72-1501</td><td></td></tr><tr><td>名</td><td>企業名</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>湾曲ハサミ</td><td>AS ONE</td><td>No.11</td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペットプロセッサー</td><td>SUTTER INSTRUMENT</td><td>P97/IVF</td><td></td></tr><tr><td>鉗子型電極</td><td>BEX</td><td>LF646P3x3</td><td></td></tr><tr><td>パルス発生器</td><td>BEX</td><td>CUY21EX</td><td>エレクトロポレーター</td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>MZ16F</td><td></td></tr><tr><td>倒立型蛍光顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>ガスコントローラー</td><td>トッケン</td><td>MIGM/OL-2</td><td></td></tr><tr><td>温度調節器</td><td>東海ヒット</td><td>MI-IBC</td><td></td></tr><tr><td>レーザー共焦点ユニット</td><td>オリンパス</td><td>FV300</td><td></td></tr></tbody></table>

発展途上ひよこ視蓋接線細胞移動の可視化

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

タイムラプス イメージングは、移行細胞の挙動を分析する強力な方法です。蛍光細胞ラベリング後、ビデオ顕微鏡下文化の標識細胞の動きを記録できます。発展途上の脳細胞の移動を分析するためスライス培養、細胞遊走の放射状の細胞遊走などのスライス セクションに平行を観察する使用されます。しかし、限られた情報は、接線方向の細胞遊走などのスライス セクションに垂直セル移行を分析するスライス培養法から入手できます。ここでは、発展途上のひよこ視蓋接線細胞遊走を視覚化する時間経過イメージ投射のためのプロトコルを提案する.Ovo でエレクトロポレーションと細胞培養チップの後フラット マウント文化によって分類するセルの組み合わせにより、水平面内移行細胞運動の検出です。また、本手法は個々 のセルの動作と長期的に細胞のグループの集団行動の両方の検出を容易します。このメソッドは、蛍光マイクロ構造の非神経組織神経のティッシュか細胞の変位で軸索の伸長を含む連続した変化を検出する可能性があります適用ことができます。

図 2は、記録の発症後経過時間 (0、9、18、27 h) でフラット マウント文化で可視化された表面的な接線方向の移動を示します。映画1は 28 時間 50 分の間 10 分間隔のインターバル撮影ムービーです。フレームは、フレームのラベル左下隅からラベルのない領域 (図 3 a) 移行の細胞に焦点を当てに対して選択されます。移行細胞 (GFP; 上部左側のパネル、映画 1) の質量の運動 (mCherry Nuc; 右上のパネル)、原子核を結合されたムービー (下のパネル、映画 1) で観察できるし、。細胞移動の方向性は、ラベル センターからすべての方向 (映画 2<strong cl...

接線方向の移行の蛍光標識法について述べるエレクトロポレーション、および移行を視覚化するためにフラット マウント文化のラベルの付いたセルの動きのタイムラプス イメージング用セル セル開発ひよこ視蓋動作.

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...

この方法は、神経細胞移動のメカニズムなど、発生生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、長期的に個々の細胞移動および集合的な細胞の移動を検出できることです。アルカリ性のリシス法により200ミリリットルの細菌培養液を単離した後、2つのプラスミドを混合し、各々の最終濃度がマイクロリットル当たり4マイクログラムとなる。肥沃な鶏卵を摂氏38度で相対湿度70%で水平にインキュベートします。2日半後、18ゲージの針で20ミリリットルの注射器を使用して、卵の尖った側から5ミリリットルのアルブミンを排除します。穴をテープで密封します。次に、湾曲したはさみを使用して卵殻の上部を切断し、直径2センチメートルの穴を開けます。実体顕微鏡下で、胚の発達段階を確認する。この大きな穴をテープで密封してください。E5.5まで摂氏38度、相対湿度70%でインキュベーションを続けます。エレクトロポレーションの前に、0.5マイクロリットルの速緑色で着色された上記プラスミドDNAの10マイクロリットルを調製する。また、ペニシリン1ミリリットルあたり100単位を含むオートクレーブPBSの10ミリリットル、ストレプトマイシンのミリリットル当たり100マイクログラムを調製する。マイクロピペットプロセッサーを使用して、ガラスキャピラリーチューブから作られたマイクロピペットを準備します。マイクロピペットの遠位先端を、注入するDNAの量に適した孔サイズにカットします。はさみを使用して密閉された上部シェルを切り、直径2.5センチメートルの穴を開け直し、卵をステレオ顕微鏡の下に刺しておいてください。卵に調製したPBS溶液の数滴を入金します。2つの細かい鉗子を使用して、胚を覆うアラントインス膜を剥がし、出血を起こさないように注意する。次に、胚の頭部から羊膜を取り除きます。マイクロスパチュラで頭を回している間、吸引管に接続されたマイクロピペットを使用して、着色されたDNAの0.1と1マイクロリットルの間を左視テクタムの心室腔に注入する。一対の鉗子タイプの電極を、光学テクタムのターゲット領域の周りに置きます。パルス発生器を使用して、1ミリ秒のプレパルスを5ミリ秒間隔で1ミリ秒、その後のパルスは5ミリ秒で5ボルトの6ボルトの場合は10ミリ秒間隔で充電します。結局のところ、テープで穴を密封し、摂氏38度と相対湿度70%でインキュベートを続けます。PBSで満たされたプラスチック皿に電極を浸し、歯間ブラシを使用してアルブミンを取り除きます。初期シェル切断から各卵のエレクトロポレーションまでのプロセスを繰り返します。フラットマウント培養の前日には、10センチメートルの細胞培養皿に蒸留水にオートクレーブを加えることで、コード化された細胞培養インサートの準備を始めました。いくつかの細胞培養を水に浮かべる。1ミリリットルラミニンあたり8マイクログラム、1ミリリットルポリーLあたり80マイクログラムを含む溶液では、挿入物をカバーすることを確認する。細胞培養二酸化炭素インキュベーターで摂氏37度で一晩インキュベートする。E7.0で培養した日に、ラミニンおよびポリl-リジン溶液を挿入から取り除いた。次に、1.1ミリリットルの培養培地を充填したガラス底皿に挿入物を移す。37°Cで細胞培養二酸化炭素インキュベーターに皿を移します。40%酸素と5%の二酸化炭素のガス流と38°Cの温度と反転共焦点顕微鏡上の湿気の部屋単位を設定します。Insertで組織サンプルの準備を始めるには、鉗子を使用して胚の頭部を氷冷HBSSを含む6センチメートルの細胞培養皿につまみます。2つの微細な鉗子を使用して、電気ポレートされた光学テクタムを分離します。そして、プラスチックドロッパーを使用して、黒いシリコンをベースにした凹ガラス皿に移し、氷冷HBSSで満たします。蛍光立体顕微鏡での標識の位置を確認します。マイクロ外科用ナイフを用いて、テクタム内の組織の方向を指摘しながら、ラベルを取り囲むテクタル組織を切り取る。この後、プラスチックドロッパーを使用して、ラベル付き組織を挿入に移し、ピン側が挿入部に取り付けられます。所望の方向にテクタル組織を置き、余分なHBSSを取り除きます。同じインサートを対象とした他の組織サンプルについても、組織調製プロセスを繰り返します。次に、逆焦点顕微鏡の前形のチャンバーに皿を置きます。反転共焦点顕微鏡を使用して、蛍光標識を確認し、顕微鏡分野に焦点を当てます。レーザー共焦点ユニットを起動します。コンフォーカルスキャンをサンプリングして、フィールド内のx軸とy軸に沿って組織の方向と位置を調整します。次に、スキャンサイズを選択します。z 軸に沿った共焦点スキャンの間隔と合計範囲を決定します。100マイクロメートルの範囲のための5または10マイクロメートルの間隔を取る。共焦点イメージングの時間間隔と総イメージング時間を選択します。コンフォーカル実行プログラムのパラメータを設定した後、イメージングを開始します。イメージングが完了したら、異なるC軸の共焦点画像を組み合わせて、Zスタック画像を生成し、各時点で最終的な焦点調整を行います。次に、さまざまなタイムポイントでZスタック画像を追加して、タイムラプスムービーを構築します。本研究では、Ovoのエレクトロポレーション、平台細胞培養、およびタイムラプス共焦点イメージングを介して表面層で細胞移動が検出される。なお、接線移動細胞と視体の表面層の核は、記録の発症後0時間、9時間、18時間、27時間が経過した。28時間50分間隔で10分間隔のタイムラプスムービーは、遊動細胞とその核の質量移動を示す。マージされたムービーは、移動する細胞の質量移動を明確に示しています。細胞移動の方向性は、標識された中心から全方向への分散セルに焦点を合わせ、調べることができます。核の動きの明確なイメージは、粒子追跡プラグインを使用して核移動の自動追跡を可能にする。接線移動の軌跡の時間変化を視覚化し、分散移動が全方向性であることを証明することができる。より高い倍率画像は5分間隔で撮影することができます。先行プロセス、トレーリングプロセス、および核の逐次形態変化を伴う個々の細胞挙動を調査する。この手順に従って、照明操作のラベル付けを実行できます。Aksumガイダンスのメカニズムのような追加の質問に答えるために。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

ここでは、GFPタグ付きのグリア細胞とペアライブ顕微鏡分析を使用して開発をショウジョウバエの眼にグリア細胞の遊走を調べるためのプロトコルについて説明します。...

ショウジョウバエの眼成虫ディスクに付属してグリア細胞の移行のイメージングを生きる

この記事では、表面のラベルを説明し、...

初期のニワトリ胚の形態形成の組織の変形を追跡

出典:Williams, A. L., et al.リアルタイムで発生を視覚化する多光子タイムラプスイメージング:ゼブラフィッシュ胚の移動する神経堤細胞の可視化。J. Vis. Exp.

マルチフォトンタイムラプスイメージングによるゼブラフィッシュ胚の神経堤細胞遊走の可視化

このプロトコルは、生きたショウジョウバエの蛹の眼神経上皮をイメージングするための効率的な方法を提供します。この方法は、組織の動きと不均一なトポロジーを補正し、複数のGFPタグ付き接合タンパク質を使用して細胞境界の視覚化を強化し、簡単に組み立てられるイメージングリグを使用します。...

のライブイメージングショウジョウバエ蛹アイ

ライトシート蛍光顕微鏡は、胚発生をイメージングするための優れたツールです。これにより、生理学的に近い状態で生きた胚の長時間のタイムラプス動画を記録できます。私たちは、広い時空間スケールでのゼブラフィッシュの眼の発達のイメージングへの応用を実証し、マルチビューデータセットの融合とデコンボリューションのパイプラインを提示します。...

イメージゼブラフィッシュアイ開発にライトシート蛍光顕微鏡を用いて、

長い波長多光子蛍光励起顕微鏡レーザーの高度な光学技術の組み合わせは、Tg (sox10:EGFP) および Tg (foxd3:GFP)...

リアルタイムで開発を可視化する多光子タイムラプス イメージング: ゼブラフィッシュ胚の神経堤細胞の可視化

ひよこ毛様体神経節(CG)は副交感神経系の一部である。ひよこCGニューロンの神経細胞培養は、神経筋相互作用の研究において有効な細胞モデルであることが示された。我々は、ひよこ胚からのCGニューロンの解剖、解離およびインビトロ培養のための詳細なプロトコルを記述する。...

チラリア性神経節ニューロンの分離と培養

このプロトコルは、ゼブラフィッシュ早期眼の開発におけるトトラベリングおよび多次元イメージングのアプローチを記述する。レーザー走査共焦点顕微鏡によるラベリング、埋め込み、4次元(4D)イメージング、および光学カップ形態形成の解剖機構のためのデータセットの取得を最適化するための考慮事項について述べる。...

ゼブラフィッシュオプティクスカップ形態形成の4次元イメージング

ここでは、市販のライトシート顕微鏡および画像処理ワークステーションを用いて眼形態形成のタイムラプスイメージングを行い、得られたデータを解析するためのプロトコルが提供される。このプロトコルは、胚麻酔、低融解温度アガロースへの埋め込み、イメージングチャンバ内の懸濁、イメージングパラメータの設定、および最後に画像解析ソフトウェアを使用したイメージングデータの分析の手順を詳述しています。...

rx3:GFPトランスジェニックゼブラフィッシュを用いたライトシート顕微鏡による眼の形態形成の可視化

この記事では、網膜入力が視蓋の成長と発達にどのように影響するかを調査するための第一歩として、生きているゼブラフィッシュの幼虫から外科的に目を取り除く方法について説明します。さらに、この記事では、幼虫の麻酔、固定、および脳解剖に関する情報を提供し、続いて免疫組織化学および共焦点イメージングを行う。...

生きているゼブラフィッシュ幼虫の眼球除去による神経支配依存性の成長と視覚系の発達を調べる

学ぶ発生生物学における神経細胞移動のメカニズムを、発展途上のニワトリ視蓋における接線細胞移動の可視化手法を用いて。電気穿孔とタイムラプスイメージングで個々および集団的細胞動態を長期的に観察する方法です。

発展途上ひよこ視蓋接線細胞移動の可視化

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