Name: 重症患者における全血エンドトキシア血症の検出に関するエンドトキシン活性アッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: 学ぶエンドトキシン活性アッセイによる重症患者の全血エンドトキシア血症検出法。迅速かつ信頼性の高いバイオマーカーとして敗血症の早期診断と治療方針決定に活用できます。

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我々は、パオロ・ブラガノとリサ・マティアセン博士に、アッセイプロトコルの方法論のレビューに感謝する。ダリオ・ウィンタートン,MDは英語能力のための原稿のレビューに大きな助けを与えました。

このプロトコルは、ヒト生体標本の取り扱いに関する制度ガイドラインに従い、当社の臨床検査室の現在の標準的な手術手順に従って実施されます。EAデータと検査対象の患者の臨床情報の使用は、当機関の人間研究倫理委員会のガイドラインに従っています。
1. 実験装置及びアッセイキット内容
<ol><li>使用しない場合は、EAキットを2~8°Cに保管してください。</li>
	<li>
各EAテストは、チューブの5種類で構成されています。テストの異なる部分にそれぞれを使用します(セクション2を参照)。
	<ol>
<li>チューブ#1(「コントロール」チューブ)を使用して、特定の抗体がない患者の好中球の非特異的酸化バーストの基底活性を測定する。</li>
		<li>チューブ#2(「サンプル」チューブ)を使用して、LPS抗体複合体に応答して酸化バーストを測定します。</li>
		<li>チューブ#3(「最大」チューブ)を使用して、エンドトキシンの過剰に応答して患者の好中球の最大酸化バーストを測定します。</li>
		<li>外因性エンドトキシンの供給源としてチューブ#4(「LPS」チューブ)を使用してください。</li>
		<li>血液貯蔵にはチューブ#5(「アリコット」チューブ)を使用してください。 注:#1、#2、#3チューブの複製は、テストされる各血液サンプルに使用する合計8本のチューブ(EA試薬ボトルおよび品質管理試験は、パウチに含まれるすべての試験に使用できます)を提供しています。</li>
	</ol>
</li>
	<li>EDTA抗凝固剤を含む無菌チューブで患者の血液サンプルを収集します。EAテストを実行する前に、血液サンプルを室温で保存してください。</li>
	<li>テストを開始する前に、化学体計とインキュベーターシェーカーをオンにします。インキュベーターを37°Cの温度に温めます。</li>
	<li>理想的には、採血から30分以内にサンプルの処理を開始する。</li>
</ol>2. エンドトキシン活性アッセイ
<ol><li>テストする必要がある各患者の血液サンプルのEA試験管を準備します。チューブをチューブラックに入れます。その後、キャップを取り外します。</li>
	<li>コンビピペットを使用して、ボトルからチューブ#1チューブ(コントロールチューブ)、#2(サンプルチューブ)、#3(最大チューブ)にEA試薬の1 mL体積をピペットし、それぞれが複製する。 注:溶液が跳ね返らないように、チューブの側面を下にピペット。</li>
	<li>血液採取管を20回ゆっくりと反転して患者の血液サンプルを混ぜます。次に、患者の血液のピペット0.5mLをチューブ#4(LPS最大チューブ)およびチューブ#5(アリコチューブ)に入れる。渦チューブ#410s。</li>
	<li>すべてのEA試験管を備えたチューブラックをインキュベーターシェーカーに入れます。蓋を閉め、37°Cの温度で10分間インキュベートします。</li>
	<li>蓋を開け、インキュベーターシェーカーからチューブラックを取り外します。渦管#5(アリコチューブ)。無菌先端を使用して、チューブに40 μLの血液をチューブに#1し、#2に、複製する。</li>
	<li>渦管#4(LPS管)。同じピペット先端を使用して、チューブ#4からチューブ#3(最大チューブ)に、重複して血液のピペット40 μLを使用します。</li>
	<li>6つの最終試験管(#1、#2、#3、およびそれぞれの複製)を渦下し、ラックに戻します。 注:すべてのチューブが同じ時間に渦を積んでいることを確認します。</li>
	<li>チューブラックをインキュベートシェーカーに戻し、蓋を閉じます。インキュベートシェーカーを100rpmに設定し、14分間動きを開始します。</li>
	<li>EAラベルのチップカードを化学体計に挿入し、スタートを押します。14分インキュベーションの後、化学体温計に表示される指示に従って、EAチューブを正しい順序で読み取ります。</li>
	<li>化学体計のサンプルホルダーに置く前に、各チューブを10sのために穏やかに渦にします。サンプルドロワーを開き、チューブ#1をサンプルホルダーに入れます。次に、サンプル ドロワーを閉じて、相対ライト ユニット(RLU)の読み取りが待機します。</li>
	<li>チューブ 2 とチューブ 3 の手順 2.10 を繰り返します。</li>
	<li>重複するチューブ 1、2、および 3 の場合は、手順 2.10 を繰り返します。 注:ステップ2.10-2.12の間に同じ時間のためにすべてのチューブを渦にしてみてください。</li>
	<li>すべてのチューブが処理された後、EAの結果が自動的に計算され、印刷されることに注意してください。水準はEA単位で表され、同じサンプルからの重複判定の平均を表します。</li>
	<li>検査が必要なすべての血液サンプルについて、手順 2.2 ~ 2.13 を繰り返します。</li>
	<li>アッセイが完了したら、残りの試験管とEA試薬を2~8°Cで最大30日間保管してください。</li>
</ol>

<ol><li>Akira, S., Takeda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor signalling.</a> Nature Reviews Immunology. 4 (7), 499-511 (2004).</li>
<li>Takeda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+and+integration+of+innate+immune+recognition+systems%3A+the+Toll-like+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Endotoxin+Research%22%5BJournal%5D)">Evolution and integration of innate immune recognition systems: the Toll-like receptors.</a> Journal of Endotoxin Research. 11 (1), 51-55 (2005).</li>
<li>Ulevitch, R. J., Tobias, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+gram-negative+bacteria+and+endotoxin+by+the+innate+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Recognition of gram-negative bacteria and endotoxin by the innate immune system.</a> Current Opinion in Immunology. 11 (1), 19-22 (1999).</li>
<li>Natanson, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endotoxin+and+tumor+necrosis+factor+challenges+in+dogs+simulate+the+cardiovascular+profile+of+human+septic+shock%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Endotoxin and tumor necrosis factor challenges in dogs simulate the cardiovascular profile of human septic shock.</a> The Journal of Experimental Medicine. 169 (3), 823-832 (1989).</li>
<li>Suffredini, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cardiovascular+response+of+normal+humans+to+the+administration+of+endotoxin%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">The cardiovascular response of normal humans to the administration of endotoxin.</a> The New England Journal of Medicine. 321 (5), 280-287 (1989).</li>
<li>Singer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Third+International+Consensus+Definitions+for+Sepsis+and+Septic+Shock+%28Sepsis-3%29%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%3A+The+Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">The Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock (Sepsis-3).</a> JAMA: The Journal of the American Medical Association. 315 (8), 801-810 (2016).</li>
<li>Gupta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture-Negative+Severe+Sepsis%3A+Nationwide+Trends+and+Outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">Culture-Negative Severe Sepsis: Nationwide Trends and Outcomes.</a> Chest. 150 (6), 1251-1259 (2016).</li>
<li>Ikeda, T., Ikeda, K., Suda, S., Ueno, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Usefulness+of+the+endotoxin+activity+assay+as+a+biomarker+to+assess+the+severity+of+endotoxemia+in+critically+ill+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Innate+Immunity%22%5BJournal%5D)">Usefulness of the endotoxin activity assay as a biomarker to assess the severity of endotoxemia in critically ill patients.</a> Innate Immunity. 20 (8), 881-887 (2014).</li>
<li>Dellinger, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Targeted+Polymyxin+B+Hemoperfusion+on+28-Day+Mortality+in+Patients+With+Septic+Shock+and+Elevated+Endotoxin+Level%5BTitle%5D)+AND+%22The+EUPHRATES+Randomized+Clinical+Trial.+JAMA%3A+The+Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Effect of Targeted Polymyxin B Hemoperfusion on 28-Day Mortality in Patients With Septic Shock and Elevated Endotoxin Level.</a> The EUPHRATES Randomized Clinical Trial. JAMA: The Journal of the American Medical Association. 320 (14), 1455-1463 (2018).</li>
<li>Marshall, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+and+prognostic+implications+of+endotoxemia+in+critical+illness%3A+results+of+the+MEDIC+study%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Diagnostic and prognostic implications of endotoxemia in critical illness: results of the MEDIC study.</a> The Journal of Infectious Diseases. 190 (3), 527-534 (2004).</li>
<li>Levin, J., Bang, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clottable+protein+in+Limulus%3B+its+localization+and+kinetics+of+its+coagulation+by+endotoxin%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+et+Diathesis+Haemorrhagica%22%5BJournal%5D)">Clottable protein in Limulus; its localization and kinetics of its coagulation by endotoxin.</a> Thrombosis et Diathesis Haemorrhagica. 19 (1), 186-197 (1968).</li>
<li>Marshall, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+endotoxin+activity+in+critically+ill+patients+using+whole+blood+neutrophil+dependent+chemiluminescence%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Care%22%5BJournal%5D)">Measurement of endotoxin activity in critically ill patients using whole blood neutrophil dependent chemiluminescence.</a> Critical Care. 6 (4), London, England. 342-348 (2002).</li>
<li>Grimaldi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Level+of+Endotoxemia+Following+Out-of-Hospital+Cardiac+Arrest+Is+Associated+With+Severity+and+Duration+of+Postcardiac+Arrest+Shock%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">High Level of Endotoxemia Following Out-of-Hospital Cardiac Arrest Is Associated With Severity and Duration of Postcardiac Arrest Shock.</a> Critical Care Medicine. 43 (12), 2597-2604 (2015).</li>
<li>Klein, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+EUPHRATES+trial+%28Evaluating+the+Use+of+Polymyxin+B+Hemoperfusion+in+a+Randomized+controlled+trial+of+Adults+Treated+for+Endotoxemia+and+Septic+shock%29%3A+study+protocol+for+a+randomized+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Trials%22%5BJournal%5D)">The EUPHRATES trial (Evaluating the Use of Polymyxin B Hemoperfusion in a Randomized controlled trial of Adults Treated for Endotoxemia and Septic shock): study protocol for a randomized controlled trial.</a> Trials. 15, 218(2014).</li>
<li>Bottiroli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+and+clinical+significance+of+early+high+Endotoxin+Activity+in+septic+shock%3A+An+observational+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Critical+Care%22%5BJournal%5D)">Prevalence and clinical significance of early high Endotoxin Activity in septic shock: An observational study.</a> Journal of Critical Care. 41, 124-129 (2017).</li>
<li>Kaukonen, K. M., Bailey, M., Suzuki, S., Pilcher, D., Bellomo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mortality+related+to+severe+sepsis+and+septic+shock+among+critically+ill+patients+in+Australia+and+New+Zealand%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%3A+The+Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Mortality related to severe sepsis and septic shock among critically ill patients in Australia and New Zealand.</a> JAMA: The Journal of the American Medical Association. 311 (13), 1308-1316 (2014).</li>
<li>Biagioni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endotoxin+activity+levels+as+a+prediction+tool+for+risk+of+deterioration+in+patients+with+sepsis+not+admitted+to+the+intensive+care+unit%3A+a+pilot+observational+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Critical+Care%22%5BJournal%5D)">Endotoxin activity levels as a prediction tool for risk of deterioration in patients with sepsis not admitted to the intensive care unit: a pilot observational study.</a> Journal of Critical Care. 28 (5), 612-617 (2013).</li>
<li>Roth, R. I., Levin, F. C., Levin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+detection+of+bacterial+endotoxin+in+plasma+with+the+Limulus+test%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Laboratory+and+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Optimization of detection of bacterial endotoxin in plasma with the Limulus test.</a> The Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 116 (2), 153-161 (1990).</li>
<li>Yaguchi, A., Yuzawa, J., Klein, D. J., Takeda, M., Harada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+intermediate+levels+of+the+Endotoxin+Activity+Assay+%28EA%29+with+other+biomarkers+in+the+assessment+of+patients+with+sepsis%3A+results+of+an+observational+study%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Care%22%5BJournal%5D)">Combining intermediate levels of the Endotoxin Activity Assay (EA) with other biomarkers in the assessment of patients with sepsis: results of an observational study.</a> Critical Care. 16 (3), London, England. (2012).</li>
<li>Earley, Z. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burn+Injury+Alters+the+Intestinal+Microbiome+and+Increases+Gut+Permeability+and+Bacterial+Translocation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Burn Injury Alters the Intestinal Microbiome and Increases Gut Permeability and Bacterial Translocation.</a> PLoS One. 10 (7), (2015).</li>
<li>Munster, A. M., Smith-Meek, M., Dickerson, C., Translocation Winchurch, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidental+phenomenon+or+true+pathology%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Incidental phenomenon or true pathology?</a> Annals of Surgery. 218 (3), 321(1993).</li>
<li>Clementi, A., Virzì, G. M., Brocca, A., Ronco, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Endotoxin+in+the+Setting+of+Cardiorenal+Syndrome+Type+5%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiorenal+Medicine%22%5BJournal%5D)">The Role of Endotoxin in the Setting of Cardiorenal Syndrome Type 5.</a> Cardiorenal Medicine. 7 (4), 276-283 (2017).</li>
<li>Virzì, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiorenal+Syndrome+Type+5+in+Sepsis%3A+Role+of+Endotoxin%5BTitle%5D)+AND+%22in+Cell+Death+Pathways+and+Inflammation.+Kidney+and+Blood+Pressure+Research%22%5BJournal%5D)">Cardiorenal Syndrome Type 5 in Sepsis: Role of Endotoxin.</a> in Cell Death Pathways and Inflammation. Kidney and Blood Pressure Research. 41 (6), 1008-1015 (2016).</li>
<li>Mignon, F., Piagnerelli, M., Van Nuffelen, M., Vincent, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+empiric+antibiotic+treatment+on+plasma+endotoxin+activity+in+septic+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Infection%22%5BJournal%5D)">Effect of empiric antibiotic treatment on plasma endotoxin activity in septic patients.</a> Infection. 42 (3), 521-528 (2014).</li>
<li>Klein, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Daily+variation+in+endotoxin+levels+is+associated+with+increased+organ+failure+in+critically+ill+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Shock%22%5BJournal%5D)">Daily variation in endotoxin levels is associated with increased organ failure in critically ill patients.</a> Shock. 28 (5), 524-529 (2007).</li>
</ol>

Estor SpAは、ジャーナルの出版費とビデオ制作費をカバーしました。著者は、開示する利益相反を持っていません。

敗血症性ショックは、現在でも40%と高い死亡率に関連しているが、この率は考慮されたレポート16に従って変化する。新規でより良いバイオマーカーの必要性は、早期診断、より良い管理、敗血症性ショック6の患者の予後を臨床医を支援するために、分野のほとんどの専門家によって提唱されています。
EAテストを実施する際、以前の技術的知識や高度な実験装置は必要なく、医療機関はそれを簡単かつ迅速に実行する方法を学ぶことができます。高循環EAの迅速な同定は、患者のリスクを階層化し、より早く、より積極的な治療アプローチを引き起こすのに役立つ可能性がある。逆に、0.40 EA単位未満のEA結果は、多臓器不全17への進行のリスクが低いことを示している可能性がある。患者のサンプルを自分の制御として使用することは簡単であり、このテストはより敏感になり、エンドトキセミアの真の血中レベルのより正確な表現をする。
LPS抗...

リポ多糖類(LPS)は、エンドトキシンとしても知られており、グラム陰性(GN)細菌の膜構造の重要な構成要素である。これは、細胞壁の約10%を構成し、外膜の完全性と恒常性のために不可欠です。また、宿主自然免疫系1、2の強力な活性化剤である。
LPSへの自然免疫系細胞のインビトロ暴露は、複数の遺伝子3の発現の変化につながる。健康なヒトボランティアにおける非常に少量のLPSの投与は急性全身性炎症のカスケードを引き起こすが、敗血症および敗血症性ショックは、より高いエンドトキシン濃度4、5で生じる可能性がある。
敗血症は生命を脅かす状態であり、速やかに認識されなければ、多臓器不全や死に至る可能性がある。敗血症患者は、積極的な蘇生、適切な抗生物質療法、最適なソース管理、迅速な臓器支援戦略を備え、タイムリーに治療する必要があります。敗血症の病因の診断は、主に臨床認識および培養ベースの病原体検出6に基づいている。しかし、微生物培養の結果は48時間までかかることがあり、症例7の30%まで決定的ではない。早期の同定と介入は、より良い患者の結果につながる可能性があります。敗血症が疑われる患者では、内分泌血症の明確な兆候なしに、生理学的および生化学的パラメータに基づいて決定が行われることが多い。
エンドトキシン活性(EA)の測定は、全血中の市販アッセイ(材料の表を参照)によって得ることができる。これは、疾患重症度の早期階層化のための全身性エンドトキシア血症のバイオマーカーとして使用することができ、特に敗血症性ショック8を発症するリスクのある患者において。このアッセイは、敗血症性ショック9の患者における最近発表された二重盲検無作為化対照臨床試験においてポリミキシンBヘモパーフュージョン療法を導くために使用された。重篤な患者では、MEDIC研究は、多臓器機能障害、集中治療室(ICU)滞在期間、および死亡率10に関連するEAレベルの増加を示した。
エンドトキシンを検出するために異なるアッセイが開発されました。Limulusアメーボサイトライサート(LAL)アッセイは、ゲル凝固、濁膜、または発色検査のいずれかとして、これまでで最も頻繁に血清エンドトキシンの推定のために採用されています。これは、エンドトキシンがホースシューカニ、リムルスポリフェムスのヘモリンフの凝固を誘導する能力に基づいている。しかし、このアッセイには特異性の点でいくつかの制限があります。特に、真菌細胞壁の成分などのエンドトキシン以外の微生物産物によって活性化することもでき、かつ種々のヒト血漿タンパク質11によって阻害することができる。
過去10年間にEAの測定は循環内分血症のバイオマーカーとして開発され、検証された。LALテストと比較して、EAはより速く、臨床設定で実施するのが容易である。さらに、全血中のLALよりも正確であることが示されており、感度および特異性が増加し、インビトロおよびインビボ12の両方である。
敗血症原因体としてGN細菌を迅速に同定するための早期診断ツールとしての初期の実施にもかかわらず、EAレベルは疾患重症度のバイオマーカーとしても研究されている。この文脈において、敗血症性ショックまたは心停止症候群13などの進行中の重篤な疾患による低灌流状態を評価することが特に有用であることが示されている。より最近では、殺量化システムの開発以来、このような治療14の潜在的な候補を正確に同定するためのスクリーニングツールとして肯定的なEA結果も提案されている。我々は最近、敗血症性ショック患者107人に対して、早期高レベルのEAの有病率と臨床的意義に関する観察的振り返り研究を行った。他の最近の結果に沿って、我々はEAが敗血症性ショック15の患者における疾患重症度の有望なマーカーであることを見出した。
本原稿の目的は、ベッドサイドまたは実験室でEAアッセイを行う方法を記述し、敗血症性ショックの代表的なシナリオでその潜在的な使用を記述することです。この技術は、抗エンドトキシン抗体およびLPSの複合体によるプライミングに続く好中球における増強された酸化バーストを測定することによってLPS活性を検出することができる。増加した呼吸バーストは化学体計によって検出され、放出される光の量は血液サンプル中のエンドトキシンの量に比例すると考えられる。アッセイは、少数の試薬を必要とし、実行するのに約30分かかり、全血12の40 μL程度しか使用しなす。

<table><tbody><tr><td>EAAキット</td><td>Spectral Medical Inc.</td><td>EAAST-20</td><td>パッケージ、20テスト+1品質管理</td></tr><tr><td>スマートライン TL</td><td>ベルトルト</td><td>EAASL</td><td>ルミノメーター</td></tr><tr><td>インキュベーターシェーカー</td><td>GRANT</td><td>ES-20</td><td>ミニインキュベーターシェーカー</td></tr><tr><td>ボルテックサー</td><td>VWR</td><td>444-2790</td><td>ボルテックス機器</td></tr></tbody></table>

重症患者における全血エンドトキシア血症の検出に関するエンドトキシン活性アッセイ

Endotoxin Activity Assay for the Detection of Whole Blood Endotoxemia in Critically Ill Patients

リポ多糖類は、エンドトキシンとしても知られており、グラム陰性細菌の基本的な構成要素であり、敗血症および敗血症性ショックの発症に重要な役割を果たしている。重大な病気に急速に進化している感染プロセスの早期同定は、より迅速かつより集中的な治療を促し、それによってより良い患者の結果につながる可能性がある。エンドトキシン活性(EA)アッセイは、全身性エンドトキセミアの信頼性の高いバイオマーカーとしてベッドサイドで使用することができる。高められたエンドトキシン活性レベルの検出は、敗血症および敗血症性ショック患者における疾患重症度の増加に関連することが繰り返し示されている。アッセイは迅速かつ簡単に実行できます。簡単に言えば、サンプリング後、全血のアリコートを抗エンドトキシン抗体と添加したLPSと混合する。エンドトキシン活性は、化学発光によって検出されるプライミング好中球の相対的な酸化バーストとして測定される。アッセイの出力は、0 (不在) から 1 (最大) までのスケールで表され、「低」(<0.4 単位)、「中間」(0.4~ 0.59 単位)、または "高" (≥0.6 単位) に分類されます。EAアッセイの実施のための詳細な方法論と根拠は、この原稿で報告される。

72歳の男性が、学術都市病院の救急部(ED)に入院した。数日前、彼は排尿の燃焼を訴えて彼のプライマリケアの医師に提示していました。経口ホスホマイシンを用した短期療法が推奨された。彼の病歴には、高血圧、単純な2型糖尿病、良性前立腺過形成が含まれていた。彼の薬にはエナラプリル、アトルバスタチン、タムスロシン、メトホルミンが含まれていた。
EDでは、彼は無気力で、目覚めたときに混乱していました。彼の温度は39.1 °C、心拍数は毎分125拍、血圧は80/40 mmHg、呼吸数は20/分、SpO2は室空気中で94%、鼻カニューを通して4L/分酸素で99%に上昇した。腹部の検査は正常であったが、局所的に局所的な軽度の優しさを除いては正常であった。困難に、フォーリーカテーテルが置かれました。少量の暗い色の化膿性尿を排出した。
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1...

我々は、本明細書を、ヒト全血試料のエンドトキシン活性をベッドサイドで測定するプロトコルを提示する。エンドトキシン活性アッセイは、実行するための簡単なテストであり、敗血症の重症患者に有用なバイオマーカーである可能性があります。

Lipopolysaccharide, also known as endotoxin, is a fundamental component of gram-negative bacteria and plays a crucial role in the development of sepsis ...

敗血症は多臓器不全や死を引き起こす可能性があります。内毒素はグラム陰性菌の基本的な成分である。内毒素の循環レベルの上昇は、より重篤な疾患を発症するリスクが高い患者を特定する可能性があります。このEndotoxin活性アッセイは、全身性内毒素症のシンプルで迅速かつ信頼性の高いバイオマーカーとして使用できます。この毒素の早期発見は、敗血症性ショック患者を治療する臨床医を助けるかもしれない。敗血症性ショックを受けた患者では、急速に進化する状態の早期同定は、より迅速かつ集中的な生命維持療法を促し、より良い結果につながる可能性がある。この手順を実証することは、私たちの研究グループと協力する分子生物学者のリサ・マティアセンです。この手順を開始するには、EAテストキットをセットし、5種類のチューブを開梱します。チューブナンバーワン、コントロールチューブを使用して、特定の抗体がない場合の患者の好中球の非特異的酸化バーストの基底活性を測定する。チューブナンバー2、サンプルチューブを用い、LPS抗体複合体に応答して酸化バーストを測定する。チューブ番号3、Maxチューブを使用して、過剰な内毒素に応答して患者の好中球の最大酸化バーストを測定する。チューブ番号4、LPSチューブを、外因性内毒素の供給源として使用する。そして、血液貯蔵のためにチューブ番号5、アリコートチューブを使用してください。EDTA抗凝固剤を含む滅菌チューブに患者の血液サンプルを収集し、EAテストを実行する前に室温でそれらを保存します。テストを開始する前に、ケミアルミノメーターとインキュベーターシェーカーをオンにし、インキュベーターを摂氏37度に温めます。まず、チューブラックに使用するEAチューブを配置し、キャップを取り外します。コンピペットを使用して、EA試薬の1ミリリットルをボトルからチューブ番号1、ナンバー2、ナンバー3にチューブの側面をピペットで移します。採血管を20回軽く反転させ、患者の血液サンプルを混合する。次いで、ピペット0.5ミリリットルの患者血液をチューブ番号4およびチューブ番号5に入れた。ボルテックスチューブ番号4を10秒間。すべてのEA試験管を備えたチューブラックをインキュベーターシェーカーに取り付けます。蓋を閉め、摂氏37度で10分間インキュベートします。この後、インキュベーターの蓋を開け、シェーカーからチューブラックを取り外します。渦管番号5。滅菌先端を使用して、ピペット40マイクロリットルの血液をチューブ1とナンバー2に、重複する。渦管番号4。同じピペットチップを使用して、チューブ番号4からチューブ番号3に40マイクロリットルの血液を複製します。6つの最終試験管を1つずつ渦。チューブラックをインキュベーションシェーカーに戻し、蓋を閉めます。シェーカーを100rpmに設定し、14分間動きを開始します。EAラベルのチップカードをケミルミニメーターに挿入し、Startを押します。14分間のインキュベーションの後、ケミルミノメーターに表示される指示に従ってください。各チューブを10秒間静かに渦を入れ、ケミルミノメーターのサンプルホルダーに置きます。サンプルドロワーを開き、チューブナンバーワンをサンプルホルダーに入れます。次に、サンプルドロワーを閉じて、相対光単位の読み取りを待ちます。テキスト プロトコルで説明されているように、チューブ 2 と 3 とすべての重複に対してこの読み取りプロセスを繰り返します。すべてのチューブが処理された後、EAの結果が自動的に計算され、印刷されます。検査が必要な血液サンプルごとにアッセイプロセス全体を繰り返します。EAアッセイキットとその部品を、摂氏2~25度の温度で元の密閉パッケージに保管してください。本研究では、重症患者の全血内毒素症を検出するために、内毒素活性アッセイが行われる。EA値が0.40未満のEA単位は、低い内毒素活性レベルを示し、循環LPS濃度が低く、これは重篤な疾患状態への進行のリスクが低いことを示す。0.40から0.59の間のEA単位の間の結果は、重度の敗血症および敗血症性ショックの発症の中間リスクを表す中間内毒素活性レベルを示す。0.60以上のEAユニットの結果は、敗血症性ショックおよび患者転帰不良のリスクが高いことを示す高い内毒素活性レベルを示す。チューブ番号4と5からの血液は、正しい試験管と混合する必要があります。プロトコルに示された正しい順序に従うように、特別な注意が必要です。すべてのチューブは重複して実行され、このフェーズで間違いにつながる可能性があります。導入後、EAアッセイは全身低灌流患者のリスク階層化のためのバイオマーカーとして提案されている。また、高度な水浄化治療戦略のための患者を選定するためのスクリーニング検査として研究されている。

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細胞外小胞組織因子活性アッセイ

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