Name: 体外流れ球サブポピュレーションの募集の同時研究 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: 学ぶ単球サブポピュレーションの体外流れ条件下での動態解析法。共焦点蛍光顕微鏡と表面マーカーを用いて、血管内皮細胞単層への接着と遊走を区別し、炎症における白血球動員メカニズムを解明する。

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博士ポール ブラッドは、原稿を読むとフィードバックを感謝いたします。A. S. デマンドレギュレーター サー ジュールとげ慈善海外信用、財政支援を受けてください。

人間の材料は、ボランティア ドナーとスイス臨床研究倫理委員会に従ってインフォームド・コンセントと使用されました。
1. 分離と凍結ひと臍帯静脈血管内皮細胞 (株)
<ol><li>螢光分離を開始する前に、37 ° C で 30 分間 T75 フラスコ (0.1 mg/mL コラーゲン G とリン酸緩衝生理食塩水 pH 7.4 PBS で 0.2% のゼラチン) にコーティング溶液 5 mL を追加します。</li>
	<li>PBS のコードをきれいに、滅菌湿布を拭き、滅菌 20 cm シャーレに配置。滅菌ハサミでコードの端をカットします。</li>
	<li>単一の大きい静脈と 2 つの小動脈を特定します。優しくコード両端静脈下肢にそれに付す三方活栓でカニューレを挿入します。</li>
	<li>コードとワイヤーの長さとしっかりとカニューレの接続を締めます。</li>
	<li>100 U/mL ペニシリン、100 U/mL ストレプトマイシン 250 ng/mL コードの静脈を洗うアムホテリシン B を含む RPMI 培地 20 mL で 2 回コードを灌流します。このプロセスは、コードの外観をより白くより明確になります。コラゲナーゼ加算の前に静脈を空には、一方の端に注射器で、RPMI を収集します。</li>
	<li>1 mg/mL コラゲナーゼ型の 12 ml 静脈灌流私 (0.22 μ m フィルター)。</li>
	<li>すぐコードで活栓を終了し、12 分の 37 ° C でコードを孵化させなさい。</li>
	<li>静脈腔から血管内皮細胞をデタッチするのにはコードを優しくマッサージします。</li>
	<li>50 mL の注射器で 10% 牛胎児血清を含む RPMI 30 mL をとり、臍帯の一方の端に接続します。</li>
	<li>臍帯のもう一方の端に空 50 mL 注射器を接続します。</li>
	<li>活栓を開き、もう一方の端から相互を集めながら端から端まで静脈を灌流します。 注:収集した懸濁液には、内皮細胞が含まれています。</li>
	<li>200 x gで 5 分でこの細胞懸濁液を遠心します。</li>
	<li>上澄みを廃棄し、10 ml の完全 M199 培地 (20% の FCS を含む、15 μ g/ミリリットルで内皮細胞増殖サプリメント M199、100 μ g/mL のヘパリン ナトリウム、0.5 μ M のヒドロコルチゾン、10 μ G/ml L-アスコルビン酸、100 U/mL ペニシリン、100 U/mL の細胞ペレットを再懸濁しますストレプトマイシンと 250 ng/mL アムホテリシン B)。</li>
	<li>T75 フラスコからコーティング ソリューションを削除し、PBS で 1 回洗浄します。</li>
	<li>種子セル T75 フラスコに 1.13 のステップから収集し、5% CO2と 37 ° C でインキュベーターで置きます。</li>
	<li>次の日は、残留の赤い血液細胞を削除しの変更媒体合流点まで 2 日おきに完全 M199 培地で 3 回フラスコをすすいでください。</li>
	<li>80-90% の合流点で 5 mL の PBS と一度血管内皮膜を洗浄、5 ml の M199 5 分追加 4 mL、1 mL のトリプシンのアクションを停止する FCS の 37 ° C で 1 mM EDTA で 0.05% トリプシンの細胞を切り離します。すべての血管内皮をデタッチするフラスコをフラッシュします。</li>
	<li>VE カドヘリン PECAM 1、gp38、汚損に使用して、血管内皮の純度を確認するフローサイトメトリーによる分析に 50 μ L の因数を収集します。</li>
	<li>室温で 5 分間 200 x g で 15 mL の管および遠心分離機のステップ 1.18 から新生活の残りの部分を収集します。</li>
	<li>ステップ 1.19 から上澄みを廃棄、cryotubes で 5 × 105セル/ml の密度で凍結溶液 (10 %dmso を含む FCS) で細胞ペレットを再懸濁します、-80 ° c または液体窒素を使用するまで凍結します。</li>
	<li>
螢光純度を確認: する
	<ol>
<li>1.18 のステップで収集した螢光を 50 μ l 添加の因数に抗ポドプラニン APC 抗体の 1 μ L、1 μ L 抗ひと PECAM1 PE 抗体の抗ひと VE カドヘリン FITC 抗体の 1 μ L を追加します。</li>
		<li>10 分間室温でインキュベートします。</li>
		<li>400 x g 30 で 100 μ L の PBS と遠心分離機を追加 s。</li>
		<li>上澄みを廃棄し、100 μ L の PBS に再懸濁します。データは流れ cytometry 技術で今すぐ取得できます。 注:新生活はポドプラニンの陰陽である VE カドヘリンの PECAM-1 です。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 血管内皮が霜取り
注:(最大 5 通路) の実験のための低い通路では、血管内皮を使用します。
<ol><li>30 分の 37 ° C でコーティング溶液 1 mL と T75 フラスコをコートします。</li>
	<li>2 分の 37 ° C で新生活を defreeze かつ完全な M199 の 10 mL の細胞を再懸濁します。</li>
	<li>200 x gで 5 分間室温で細胞を遠心分離し、上澄みを廃棄します。</li>
	<li>完全な M199 の 10 mL の細胞ペレットを再懸濁します。</li>
	<li>プレコート フラスコ細胞懸濁液を転送します。5% CO2と 37 ° C でインキュベーターでフラスコを配置します。2 日ごとに細胞培養培地を変更します。</li>
</ol>3. 新生活文化 0.4 μ スライド室
<ol><li>流れの実験を開始する前に 5 日間は、0.1 mg/mL コラーゲン G、30 分の 37 ° C で 0.2% のゼラチンを含んでいる PBS の 30 μ L で 0.4 μ-スライドの部屋事前コートします。</li>
	<li>100 μ L の PBS とチャンバーを洗います。</li>
	<li>T75 フラスコの 80-90% コンフルエント新生活から細胞をデタッチします。</li>
	<li>5 mL の PBS で新生活を洗い、5 ml の 5 分の 37 ° C で 0.05% トリプシンの切断します。</li>
	<li>フラッシュし完全な M199 に細胞懸濁液を収集し、最も便利な方法でセルをカウントします。室温で 5 分間 200 × gで遠心分離機します。</li>
	<li>106セル/ml 細胞ペレットを再懸濁し、商工会議所あたり 30 μ L (30,000 細胞) を配布します。</li>
	<li>1 h の 5% CO2と 37 ° C でインキュベーターでセルを孵化させなさい。</li>
	<li>各商工会議所に完全な M199 の 150 μ L を追加し、37 ° C、5% CO2でインキュベーターで 5 日間培養します。2 日ごとに媒体を変更します。</li>
</ol>4. 新生活流動場下における単球採用試金のための汚損
<ol><li>M199 と 1 μ M CMFDA (5 chloromethylfluorescein ・ ジアセテート) の作られたラベルのメディアの準備し、細胞ラベリング前に 5 分の 37 ° C に温めてください。</li>
	<li>37 ° C で暖められた M199 培地で 2 回洗う新生活</li>
	<li>温めたラベリング培 CMFDA の 1 μ M の 30 μ L で媒体を交換し、37 ° C、5% CO2で 10 分間定温器に配置します。</li>
	<li>完全な M199 で 1 回洗浄し、30 分の 37 ° C、5% CO2でインキュベーターで完全な M199 とセルを孵化させなさい。 注:ラベリング溶液添加前に血清中のすべてのトレースを削除することが重要だ、それ以外の場合それは螢光染色を変更可能性があります。</li>
	<li>いずれかの人間の tnf α を含む完全な M199 と媒体を交換 (500 U/mL) または人間の tnf α のミックス (500 U/mL) 人間 VEGFA と (1 μ g/mL) 37 ° C、5% CO2でインキュベーターで 6 時間。</li>
</ol>5. 分離人間パン単球のサブポピュレーションの染色
<ol><li>集中して人間の血のバフィー コートまたは EDTA バキュテナー管実験の日に収集された新鮮単離の人間血 20 mL を使用します。</li>
	<li>PBS 1 mM EDTA (1:1) で血液を希釈し、優しく密度勾配メディアの 20 mL の上に希釈血液の 20 mL のピペットします。遅い加速とブレーキなしの室温で 30 分間 400 × gで遠心分離機します。</li>
	<li>末梢血単核球 (PBMC) の収集-40 mL の PBS-1 mm EDTA を含む新しい 50 mL チューブに (密度勾配メディアとプラズマ層) の間の血小板層。最大 50 mL の PBS-1 mM EDTA をトップします。</li>
	<li>室温で 200 x gで 5 分間遠心上清を破棄します。</li>
	<li>10 mL の染色バッファー (PBS-1 mM EDTA の 0.5% ウシ血清アルブミン BSA を含む) と細胞ペレットを再懸濁します。</li>
	<li>室温で 200 x gで 5 分間遠心上清を破棄します。</li>
	<li>5.5、5.6 の手順を繰り返します。</li>
	<li>10 ml のバッファーを染色の細胞ペレットを再懸濁します。細胞数の 10 μ L の因数を取る。</li>
	<li>PBMC 集団を確認し、流れの cytometer で急激にセルをカウントします。 注:特徴的なリンパ球と単球の集団は、(図 1 a) を観察できます。について期待して新鮮な人間の血の 50 mL から 50-100 × 106 PBMC。</li>
	<li>
Cd14対CD14-PBMC 流動下での募集のため。<ol>
<li>フロー バッファーの 3 回餌を洗浄 (M199 0.5 %bsa を含む) と 1 mL あたり 6 x 10 の6セルでフロー バッファーの単核細胞を再懸濁します。</li>
		<li>200 μ L 各試金のための因数を作る。アッセイの前に 20 分までは、37 ° C で孵化させなさい。</li>
		<li>抗 CD14 PE のヘキスト 33342 2 μ M の最終濃度 5 μ L をそれぞれ因数に追加します。混合し、37 ° c 10 分間加温します。</li>
		<li>400 x g 30 で因数を遠心分離機 s。</li>
		<li>上澄みを廃棄し、フロー バッファーの 200 μ L でペレットを再懸濁します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
流動場下における単球サブポピュレーションの募集:<ol>
<li>製造元の指示に従ってパン単球分離キットで単球を分離します。 注:次の隔離のプロトコルは、50 x 10 の6セルです。それ拡張できます上下に製造元の推奨事項内にある限り。</li>
		<li>200 x gで 5 分間室温の PBMC 懸濁液を遠心します。</li>
		<li>上澄みを廃棄し、バッファーを染色の 400 μ L でペレットを再懸濁します。</li>
		<li>Fc 受容体ブロック試薬を 50 μ l 添加とパン単球抗体カクテルの 50 μ L を追加します。</li>
		<li>10 分間室温でインキュベートします。</li>
		<li>染色バッファーと磁気ビーズ共役反ビオチン抗体の 100 μ L の 400 μ L を追加します。15 分間室温でインキュベートします。</li>
		<li>2 mL の染色バッファーを追加し、磁石と相まって MAC LS 列を使用します。</li>
		<li>磁石で LS 列を置き、染色バッファーの 1 つの mL を追加します。流れを破棄します。</li>
		<li>列の PBMC の懸濁液を渡すし、新しい 15 mL チューブにパンの単球を含む、明確なフローを収集します。</li>
		<li>5 mL をトップに染色バッファーを追加します。</li>
		<li>硫酸を取るし、流れの cytometer による単球の分離の品質をチェックします。</li>
		<li>パン単球数を決定します。 注:単球の人口だけが見られる(図 1 b)。</li>
		<li>200 x gで 5 分でステップ 5.11.11 から単球の残りの部分を遠心します。</li>
		<li>上清を捨てます。</li>
		<li>5 mL のフロー バッファーで細胞ペレットを再懸濁します (M199 0.5 %bsa を含む)。</li>
		<li>5.11.13 に 5.11.14 EDTA の痕跡を除去するために 2 回を繰り返します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>単球の懸濁液は流れ、6 x 106セル/ml (0.5 %bsa を用いた M199) をバッファーします。</li>
	<li>各募集の試金のための単球 200 μ L の因数を作る。</li>
	<li>インキュベーターの 37 ° C で 20 分注入前に、まではろを維持します。</li>
	<li>各因数に抗 CD16 PE 抗体とヘキスト 33342 (最終 2 μ M) の 5 μ L を追加します。</li>
	<li>混合し、37 ° c 10 分間加温します。</li>
	<li>400 x g 30 で因数を遠心分離機 s。</li>
	<li>上澄みを廃棄し、フロー バッファーの 250 μ L でペレットを再懸濁します。</li>
	<li>共焦点顕微鏡のアクイジション ・ パラメーターを設定するためにスライドの 1 つの区域で単球懸濁液 30 μ L を追加します。</li>
	<li>37 ° C で 5.18 ステップから単球懸濁液の因数を維持します。 注:この懸濁液は流れシステムで注入されます。</li>
</ol>6. 流体システムの準備
<ol><li>37 ° C で設定用セル インキュベーターは、します。 注:流システムの図は、図 2にとおりです。</li>
	<li>チューブ部 i: 組み立てルアーロック コネクタ オス シリコーン チューブ (8 cm 長く、3 mm 厚) の部分の 1 つの端を挿入し、ラインにルアー インジェクション セットにもう一方の端を接続します。シリコーン チューブ (40 cm、厚さ 3 mm) の部分に後者のルアーロック コネクタを接続 1 つ終わり。 注:必要に応じて、ラインにルアー注入セットと最終的な空気泡除去のためチューブ シリコン 5 mL 注射器に接続されている 3 ウェイ タップを挿入できます。</li>
	<li>チューブ ii を組み立てる: シリコーン チューブ (長さ 1 m、厚さ 3 mm) の長さの 1 つの端に 20 mL 注射器を接続します。ルアーロック コネクタ オス管のもう一方の端を挿入します。</li>
	<li>接続部 I および II 管をルアー コネクタ男性女性ルアー ロック カプラー (図 2 a) を挿入することによって部。</li>
	<li>37 ° C で暖められたフロー バッファー (M199 + 0.5 %bsa) を含む貯水池側のシリコン チューブを入れ</li>
	<li>フロー バッファーとチューブに合わせて 20 mL シリンジのプランジャーを引きます。</li>
	<li>ポンプの注射器に置き、固定します。</li>
	<li>ポンプの設定でモードを撤回するではなく吹き込む) と流量を指定します。</li>
	<li>次の数式を使用して、使用する IBIDI スライドによると流量を決定します。 <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/58509/58509eq1.jpg"> 注: スライド率は実験用 IBIDI スライドに依存しています。Μ-スライドの私0.4この例では、スライドの要素で使用されているロックが 131.6。特定のスライドの要因、会社ウェブサイト14を参照してください。フロー バッファー粘度は 0.0072 dyn.s/cm2です。後毛細血管細静脈のせん断応力は約 0.5 の dyn/cm2です。</li>
	<li>
スライド (図 2 b) に接続します。
	<ol>
<li>女性のルアーロック ロック カプラー周りのシリコン チューブをクランプ、カプラーから 2 つのルアーロック コネクタ男性を外します。</li>
		<li>刺激血管内皮と培地での塗りつぶしを含むスライドの貯水池にそれらを接続します。このステップの間に空気の泡を避けるため。</li>
		<li>クランプ離陸し、接続が漏れていないことを確認します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>タイムラプス イメージングのための顕微鏡下でスライドしポンプを起動します。</li>
</ol>7 共焦点顕微鏡による流動場下における単球採用のタイムラプス イメージング
<ol><li>40 x 目的を使用して (材料の表を参照) 用。</li>
	<li>405 をアクティブに nm (青単球核)、488 nm (緑内皮細胞)、561 nm (赤 CD16 + サブセット) のレーザー。</li>
	<li>アクイジション ・ パラメーターを設定するのには単球を含む商工会議所を使用します。 注:非転生し、転生の両方の球を検出するためには、ピンホールとレーザ 405 nm の強さが高に設定されます。したがって、非転生の単球は少し根元の計画に表示されます。しか転生単球は内皮細胞下に新しい領域に対応する核周辺の無染色を提示します。</li>
	<li>顕微鏡下で取得するチャンバーを配置します。</li>
	<li>マルチ ポジション共焦点イメージングのため 1 cm 半径内のビューの 3 つのフィールドを選択します。</li>
	<li>基底と内皮細胞の頂端側を定義します。</li>
	<li>Z スタックを 10-12 μ m 範囲 (0.5 μ m ステップ) に設定します。1 分毎時間経過の取得を実行します。</li>
	<li>イメージングの 3 分後にラインにルアー注入ポートを介して単球懸濁液 (6 x 106セル/mL) の 200 μ L を注入します。 注:急速に単球が付着、輪廻 (基底の計画に頂端からトランジット) を開始に頂面上に表示されます。</li>
	<li>少なくとも 30 分のイメージです。終わったら、画像を停止し、流れを止めます。スライドからそれらを切断するチューブをクランプします。</li>
	<li>10 分の 4 ° C で 4% パラホルムアルデヒドでスライドを固定します。</li>
	<li>PBS でスライドを洗浄し、さらなる分析の必要な場合は 4 ° C でスライドを保存します。</li>
</ol>8. ImageJ によるデータを分析します。
<ol><li>各フィールドの合計付着性単球の数を数えます。Mm2あたりの細胞数を決定します。</li>
	<li>転生の単球が内皮細胞下に基底の計画に存在し、核の周り (グリーン チャンネル) でブラック ホールの存在によって識別されたをカウントします。</li>
	<li>付着性白血球の総数によって転生白血球の数を分割します。移住率は付着性単球の割合として表示されます。</li>
	<li>図では、ための樹状突起と基底の側面のこれらの内皮細胞コンパートメントのそれぞれで発生するイベントを説明するために同時に表示できます。</li>
</ol>

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</ol>

著者は競合する金融興味を持ってないです。

単球サブポピュレーションが炎症血管内皮膜を通して生まれ変わる方法の研究を詳述した手法を報告する.議論の方法は、位相差顕微鏡検査、また、単球の流れ3,11,19の下で採用を検討するものです代わりに共焦点顕微鏡を使用しました。タイムラプス イメージング用共焦点顕微鏡を使用しての主な利点の 1 つは、輪廻と単球の接着力が強力との間を明確に判別する能力です。位相差顕微鏡ベース方法は堅牢なも、転生の細胞と強く付着細胞との混同を避けるために専門知識が必要です。この場合、1 つは単球採用カスケードのこれらの 2 つの状態間の明確な違いを作るために分析のための厳格な基準を確立する必要があります。また、位相差顕微鏡で観察する世界の動向を確認するために、共焦点顕微鏡によるエンドポイント解析を行うことが重要ですも。したがって、単球の流れの下で採用を検討する共焦点顕微鏡の直接使用は、キャプチャされた単球の実際輪廻状態で明確な結果を提供します。
<p class="jo...

単球は、損傷した組織、血管新生、癌1,2,3 を含む多くの疾患の病態をクリーンアップする病原体と戦うために不可欠な免疫の貪食コンポーネントを構成します。.単球は骨髄由来細胞が血液中を循環するが、特定の分子機構を末梢組織における炎症のサイトに募集することができます異種の集団から成る。白血球は、単球の募集カスケードは一般に、キャプチャ、圧延、クロール、逮捕、内皮下浸潤 (輪廻)、血管壁 (基底膜と壁画を通じて移行などの異なる手順を関係づけるセル)4。これらの手順は主にセレクチンのリガンドなどの白血球に注目している、糖タンパク質リガンド、ケモカイン、細胞と接合部の接着分子、その受容体など、内皮細胞内腔で炎症誘起分子を含むインテグリンです。血管内皮細胞の接合点 (傍細胞) や内皮細胞体 (transcellular) を通じて人身取引の経路は、内皮バリア5を横断する白血球により使用できます。単球は歴史的に transcellular ルートを通じて霊界に記載されている、しながら、単球はもはや均質の細胞集団を考えられているように、渡り鳥の経路に潜在的な相違が提案されている.多様性単球ごとの相違点と共通点の定義することができます、彼らの独特の血管外漏出に対するカスケード3,6ことが明らかとなりつつあります。したがって、明確に、単球集団間差別するために可視化することが重要だし、募集中のこれらの異なる集団のそれぞれの行動の表現型を処理します。
人間から単球、ブタ、ラット、マウス特定の生得的機能と特定の渡り鳥動作7,8,9形質集団に分割されました。たとえば、ヒトでは、単球が細菌リポ多糖のコレセプター CD14、CD16、Fc γ レセプター III の表面表現に基づく 3 つのサブセットに分けることが。ひと単球のサブポピュレーションを含めるクラシック CD14+CD16-、CD14 を中間+CD16+と非古典的 CD14薄暗いCD16+細胞6,9。古典の CD14+CD16-単球は、主に炎症性であることを示したに対し CD16 のプール+単球は現在 TIE2 発現と血管新生関数10総称して発見されました。一貫して、人間の腫瘍の壊死などの炎症性サイトカインと内皮細胞刺激因子 (TNF) α やインターロイキン (il-1) ベータ (従来の炎症) は古典的な CD14 の完全な募集をトリガーするのに十分な+CD16-単球。ただし、血管内皮増殖因子 (VEGF) と tnf α (血管新生因子による炎症) の同時作用が、CD16 の輪廻を挑発する必要+単球3の血管新生プール。歴史的には、伝統的な Transwell 静的な条件、平行平板の流れ区域や μ スライド流室制度は、時間の in vitro11 で 1 つの末梢血白血球ポピュレーションの募集を定量的に解析に使用されています。 ,12,13。これらのプロトコルを検証しながら複数の単球サブポピュレーションの同時解析を許可より強固な方法がより洞察力があると見なされます。このような手法必要があります複数の対話および各それぞれの人口の異なる周波数のアカウントし、類似点と特異性のメカニズムの理解は、各単球を定義する募集カスケードサブセット。
同時に共焦点顕微鏡を用いた研究に異なる単球サブポピュレーションの渡り鳥のカスケードを可能にする流動場下における単球採用のタイムラプス イメージングに基づく方法を紹介します。このメソッドは、単球後毛細血管細静脈の循環の血行動態、白血球動員の生体内での主要な場所と同様に、血管内皮細胞炎症を模倣する特定の重要な機能を統合します。提案手法は、ひと臍帯からの分離の確立されたプロトコルを介して生成されるひと臍帯静脈血管内皮細胞 (新生活) を使用します。この臨床のリソースも臍静脈から分離でき、血管内皮細胞の合理的な利回りを提供しながら生物学的副産物として簡単に利用できるという利点があります。我々 も蛍光色素や蛍光を別の細胞成分と共焦点顕微鏡による単球の位置 (abluminal 対内腔) の明確な定義を区別する使用時間をかけて。ここで提示されたプロトコル開発した同時に測定する単球サブポピュレーションの転生レベル。また、他の白血球サブポピュレーションや採用プロセスを研究するこの方法を異なるバイオ マーカーおよびラベルの使用によって拡張できることに注意してください。

<table><tbody><tr><td>組織培養フラスコ 75 cm2</td><td>TPP</td><td>90076</td><td>単離されたHUVECのルーチン培養</td></tr><tr><td>&micro;-スライドVI 0.4</td><td>IBIDI</td><td>80606</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離チューブ 15 mL</td><td>TPP</td><td>191015</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離チューブ 50 mL</td><td>TPP</td><td>191050</td><td></td></tr><tr><td>コラーゲンG</td><td>バイオクロム</td><td>L 7213</td><td>細胞培養のコーティング用フラスコゼ</td></tr><tr><td>ラチン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1393</td>細胞<td>培養フラスコ</td></tr><tr><td>Dulbecco'のコーティング用リン酸緩衝生理食塩水(MgCl2およびCaCl2を含まない)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'リン酸緩衝生理食塩水(MgCl2およびCaCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 中型</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>3方向ストップコック</td><td>BIO-RAD</td><td>7328103</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン10,000 &mu;/mL ストレプトマイシン10,000 &mu;g/mL 菌類ゾーン 25 &mu;/mL</td><td>AMIMED</td><td>4-02F00-H</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ 1 型</td><td>Worthington</td><td>LS004216</td><td></td></tr><tr><td>Medium 199 1x avec アール塩、L-グルタミン、25 mM Hepes</td><td>GIBCO</td><td>22340020</td><td></td></tr><tr><td>ウシ アルブミン画分 V</td><td>サーモフィッシャー</td><td>15260037</td><td></td></tr><tr><td>内皮細胞増殖サプリメント、150 mg</td><td>ミリポア</td><td>02-102</td><td></td></tr><tr><td>ヘパリンナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149RT</td><td></td></tr><tr><td>ヒドロコルチゾン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6909</td><td></td></tr><tr><td>L-アスコルビン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A 4544</td><td></td></tr><tr><td>EDTA二ナトリウム塩二水和物C10H14N2Na2O8 &middot; 2H2O</td><td>APPLICHEM</td><td>A2937.0500</td><td></td></tr><tr><td>CD144(VE-Cadherin)、ヒト組換えクローン:REA199、FITC</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-100-713</td><td>AB_2655150</td></tr><tr><td>CD31-PE抗体、ヒト組換えクローン:REA730、PE</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-110-807</td><td>AB_2657280</td></tr><tr><td>抗ポドプラニン-APC、ヒト組換えクローン:REA446、APC</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-107-016</td><td>AB_2653263</td></tr><tr><td>BD Accuri C6 Plus</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&micro;-Slide I Luer</td><td>IBIDI</td><td>80176</td><td></td></tr><tr><td>CMFDA (5-クロロメチルフルオレセインジアセテート)</td><td>ThermoFisher</td><td>C2925</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒトTNF&α;</td><td>Peprotech</td><td>300-01A</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒト VEGFA</td><td>Peprotech</td><td>100-20</td><td></td></tr><tr><td>NE-1000 プログラマブル シリンジ ポンプ</td><td>KF テクノロジー</td><td>NE-1000</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll&nbsp;Paque Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>抗ヒトCD14-PE、ヒト組換えクローン:REA599、PE</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-110-519</td><td>AB_2655051</td></tr><tr><td>Pan Monocyte Isolation Kit、ヒト</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-096-537</td><td></td></tr><tr><td>抗ヒトCD16-PE、ヒト組換えクローン:REA423、PE</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-106-762</td><td>AB_2655403</td></tr><tr><td>LSカラム</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>QuadroMACS セパレーター</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342、三塩酸塩、三水和</td>物 <td>ThermoFisher</td><td>H1399</td><td></td></tr><tr><td>シリコンチューブ</td><td>IBIDI</td><td>10841</td><td></td></tr><tr><td>エルボールアーコネクター</td><td>IBIDI</td><td>10802</td><td></td></tr><tr><td>メス ルアーロックカプラー</td><td>IBIDI</td><td>10823</td><td></td></tr><tr><td>ルアーロックコネクタ メス</td><td>IBIDI</td><td>10825</td><td></td></tr><tr><td>インライン ルアー注入ポート</td><td>IBIDI</td><td>10820</td><td></td></tr><tr><td>Ar1 共焦点顕微鏡</td><td>ニコン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>40倍対物レンズ</td><td>ニコン</td><td>40x 0.6 CFI ELWD S 平面 蛍光 WD:3.6-2.8mm 補正 0-2mm</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ ソフトウェア</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

体外流れ球サブポピュレーションの募集の同時研究

Simultaneous Study of the Recruitment of Monocyte Subpopulations Under Flow In Vitro

ターゲットの末梢組織に血液中から単球の採用は、組織の損傷、腫瘍の開発、自己免疫疾患の中に炎症性プロセスに不可欠です。これは、基になる影響を受ける組織に接着や内皮下移行 (輪廻) が続いて活性化の内皮細胞の管腔表面に自由な流れからのキャプチャのプロセスによって実現されます。ただし、単球サブポピュレーションの優遇とコンテキスト依存の募集をサポートするメカニズムはまだ完全に理解しました。そこで、同時に可視化し、流動場下における測定に異なる単球サブポピュレーションの採用を可能にする方法を開発しました。タイムラプス顕微鏡を用いたイメージング、に基づいて、このメソッドは明確な付着性と転生の球を区別することができます。ここでは、このメソッドを使用して、同時にプロ血管新生と血管新生の非単球の in vitro の募集カスケードを勉強する方法について述べる。さらに、このメソッドは、最大 3 つの単球集団のリクルートの別の手順を勉強する拡張できます。

Tnf α によって誘導される血管内皮活性化の状態の判断
炎症性サイトカイン tnf α の生物活性は、バッチと凍結融解サイクルの補充によって異なります。Tnf α の治療と血管内皮のライセンス認証の状態をチェックすることが重要です。これは、並列に注目している、icam-1 および VCAM 115,16,17の炎症の誘導の合流の螢光のいくつかのサンプルの汚損によって実行でした。Tnf α の治療は血管内皮細胞炎症性ストレスによって表示形態変化後血管内皮のライセンス認証の状態を確認する簡単でシンプルな方法。図 3に示すとおり、螢光を物質の細胞と比較して tnf α 存在下で 6 時間後細長い。比較は、tnf α と...

ここでは、単球 subpopulation の特定の表面マーカーと共焦点蛍光顕微鏡を用いて in vitro における流動場下における人身売買対策統合のプロトコルを提案する.このプロトコルは、他の特定の表面マーカーを使用して他の白血球のサブタイプをプロファイルとして順次募集手順同様を探索する使用できます。

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development ...

この方法は、炎症と免疫学の分野で重要な質問に答えることができます。例えば、白血球接着と経内皮移動の分子機構は何ですか。この技術の主な利点は、それが半透明単層への単球のトランスマイグレーションと強い付加との間の無制限の使用の差別を可能にすることです。この方法は、流れ上の単球の採用に関する情報を提供するが、T細胞、B細胞、またはその亜集団の誘導体のような造血系の他の細胞にも適応することができる。洗浄後、37°Cおよび5%炭酸ガスで10分間1マイクロモルCMFDAを添加した30マイクロモルM199培地の30マイクロリットルでヒト臍静脈内皮細胞またはHUVECにラベルを付けます。インキュベーションの終わりに、完全なM199培地の150マイクロリットルで細胞を洗浄し、さらに30分間新鮮な完全なM199培地の150マイクロリットルで培養をインキュベートします。次に、上清を適切な実験用サプリメントを含む完全なM199培地の150マイクロリットルに交換し、スライドチャンバー培養液を6時間インキュベーターに戻します。ヒトPAN単球単球分離の場合、1対1の比率で1ミリモルEDTAを添加したPBSで採取した新しい血液サンプルを希釈し、遠心分離による密度勾配分離のために20mlの密度勾配培地上に20mlの血液溶液を慎重に層化する。中末梢血単核細胞血小板層を1ミリモルEDTAで補った40mlのPBSを含む新しい50mlチューブに集め、追加のPBS-EDTAで最終体積を50mlに持ち込み、数えた後、メーカーの指示に従ってPAN単球分離キットで単球を単球に分離する。そして、0.5%牛血清アルブミン、またはBSAを添加したM199培地で細胞を3回洗浄して、EDTAの痕跡を排除する。単球分離の品質は、堅牢なトランスマイグレーションと接着結果を確保するために重要です。したがって、分離のためのメーカーの勧告に厳密に従うことが重要です。0.5%BSAを補充した新鮮なM199培地中のml濃度当たり6倍の10倍の10回でペレットを再懸濁し、細胞を採用アッセイ当て試算1回当たりのマイクロ遠心分離管当たり1つの200マイクロセントリコートに分割する。その後、フローチャンバーへの注入の前に20分間、セルを摂氏37度に置きます。分析用の流体システムを準備するには、まず、長さ8cmの3mm厚いシリコンチューブの一方の端にオスのルアーコネクタを挿入し、もう一方の端をインラインルアーインジェクションセットに接続します。その後、ルアーコネクタを長さ40cmの3mm厚いシリコンチューブの一端に接続します。次に、20mmシリンジを長さ1mの厚さ3mmのシリコンチューブの一方の端に、オスのルアーコネクタをもう一方の端に挿入します。次に、両方の男性ルアーコネクタを女性のルアーロックカプラに挿入し、シリコーンチューブのフリーエンドを0.5%BSAを補った37°CM199培地の貯水池に入れ。プランジャーを引き込んで、チューブをフローバッファで満たし、シリンジポンプのシリンジを固定します。次に、ポンプを引き出しモードに設定し、流量を指定します。スライドチャンバーを接続するには、女性のルアーロックカプラの周りにシリコーンチューブをクランプし、それらをスライドのリザーバに接続できるようにカプラーから2つのルアーコネクタオスを取り外します。気泡は画質を乱すだけでなく、毛細血管の薄いストレスを細胞に誘導し、細胞死を引き起こす。気泡を避けるために、貯蔵所にルアーを挿入する前に管の正しいクランプを確認しなさい。次にクランプを取り外して、接続が漏れていないことを確認し、スライドを顕微鏡の下に置きます。フロー下での単球募集のイメージングのために、5マイクロリットルの蛍光結合抗CD16抗体と適切な核染色を各アリクォート単球に室温で10分間インキュベーションし、短い遠心分離で細胞を収集する。250マイクロリットルのフローバッファでペレットを再懸濁し、シリンジポンプを開始します。スライドの1つのチャンバーに1つの単球懸濁液の30マイクロリットルを加え、共焦点顕微鏡の40X目的を選択します。適切な蛍光レーザーをアクティブにし、ラベル付き単球でチャンバーを使用して共焦点顕微鏡の取得パラメータを設定する次へ、マルチポジション共焦点イメージングのために半径半センチメートル以内の3つの視野を選択し、Zスタックを10〜12マイクロメートルの範囲に設定し、時間取得を1分ごとに実行します。3分間のイメージングの後、インラインルアー注入口を通して200マイクロリットルの単球を注入し、細胞相互作用のイメージングを開始する。少なくとも30分後、撮像と流れを止め、チューブをクランプしてスライドから切り離せるようにします。刺激されたHUVECを介した細胞の転写速度を決定するために、画像Jを開き、各フィールドの接着単球の総数をカウントして、1平方ミリメートルあたりの細胞数を決定する。次に、核の周りにブラックホールゾーンが存在することによって識別されるように、内皮細胞の下の基底面に存在するトランスマイグレーションされた単球の数を数えます。刺激後のHUVECsの活性化状態を確認する簡単な方法は、炎症性ストレス下でのそれらの伸びの視覚化です。タイムラプス共焦点イメージングは、その表現型を評価することができる尖体面での単球の可視化を可能にする。トランスマイグレーションを受けている移動細胞は、尖体面から消失して基底面に再び現れる前に、細胞間細胞間接合部に移動する。時間の経過に伴う単球の採用の定量化は、単球接着が続いてトランスマイグレーションされることを確認する。CD16陽性単球のトランスマイグレーション率は、内皮細胞がTNFアルファのみで刺激される場合には低いが、内皮細胞がTNFアルファおよび血管内皮成長因子またはVEGFAの両方で刺激されると増加する。TNFαおよびTNFアルファ+VEGFAを有するHUVEC刺激は、CD14陰性T、BおよびNK細胞への付着の増加を誘導し、CD14陽性単球と比較する。さらに、HUVEC刺激は、T、BおよびNK細胞がTNFアルファまたはTNFアルファプラスVEGFA刺激条件下でトランスマイグレーションを行わないので、単球集団の単球集団の単一の移動のみを誘導する。最適な単球採用アッセイを行うには、実験を事前に計画し、同じ日に行うことが重要です。また、細胞を精製する際には、実験中に細胞を異なる温度に変換しないように、顕微鏡が37度であることを確認してください。この手順を学ぶために、HUVECサイトカインおよびケモカイン発現のプロファイリングおよび化学血軸研究のようなすべての方法は、特定の単球集団の移行および接着を維持する分子メカニズムに関する追加の質問に答えるために行うことができる。

simultaneous-study-recruitment-monocyte-subpopulations-under-flow

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

このビデオでは、間葉系幹細胞(MSC)がエフェクターT細胞の増殖に及ぼす免疫調節効果を調査するためのin vitroアッセイを実演しています。このアッセイには、MSCとPBMCの共培養が含まれ、単球集団が免疫調節表現型を獲得するように誘導し、インターロイキン-10(IL-10)の分泌につながります。活性化されたCD4+...

白血球増殖に対する単球の免疫調節影響を評価するためのIn vitroアッセイ

このビデオは、白血球の動員に対する間質細胞の影響を調査する方法を示しています。パラレルプレートフローチャンバーモデルでは、炎症誘発性サイトカインが内皮細胞による接着受容体の発現を誘導し、好中球の動員と移動を促進します。間質細胞と内皮細胞との間のクロストークは、内皮細胞への好中球動員を減少させます。...

白血球動員に及ぼす間質細胞の影響に関するIn vitroフロー調査

肝臓への白血球の動員は、固有の肝臓類洞内皮細胞で裏打ちされている肝正弦波の特殊なチャネル内に発生します。生理学的な剪断応力の条件下でヒト肝臓シヌソイド内皮を通過する白血球動員の位相差顕微鏡は、このプロセスの根底にある分子機構の解明を容易にすることができる。...

せん断応力のヒト肝類洞内皮条件のことを白血球の募集を研究するフロー接着アッセイ

ここでは、調査員は、マウスの循環系に内皮由来の接着分子でコーティングされたチャンバーを接続することにより、ex vivoでの白血球動員のダイナミクスを評価することを可能にするプロトコルを提示する。それは相対的な生物学的条件下で、白血球の評価を可能にするため、この方法は重要な利点を提供しています。...

におけるフローの状況の下で白血球 - 内皮相互作用を評価するエクスビボ Autoperfusedマイクロフローチャンバーアッセイ

流れから白血球を募集する炎症を起こした内皮の能力は、間葉系間質細胞によって調節されている。我々は、フローからの好中球動員を評価し、間葉系間質細胞は、このプロセスの調節に果たす役割を調べるために使用することができる一次ヒト細胞を組み込んだ2 のインビトロモデルを記述する。...

フローから白血球の補充に間質細胞の影響を分析する

単球は、活性化時に解糖代謝に依存する人間の自然免疫系の不可欠な構成要素です。新鮮な全血中の全単球および単球亜集団によるグルコーストランスポーターの発現とグルコース取り込みを測定するためのフローサイトメトリープロトコルについて説明します。...

シンプルなフローサイトメトリー法は、全血における単球亜集団のためのグルコース取り込みおよびグルコーストランスポーターの発現を測定するために

リンパ球走化性と移行の定量的評価のためのプロトコルは、免疫学の研究のための重要なツールです。ここでは、リアルタイムで、多重セル移行の評価だけでなく、生体内で相補的な技術有効にする追跡ネイティブ細胞の脾臓に、体外のプロトコルを説明します。...

ひと単球走化性の in VitroおよびIn Vivoマウス リンパ球の定量化

ひと内皮細胞膜間での単球によって輪廻と泡沫細胞にその後成熟を測定するプロトコルについて述べる。これは、別の病気の条件を持つ人々...

単球輪廻と慢性炎症性疾患を持つ個人から泡沫細胞の形成の定量化

炎症時に血管壁の損傷後、白血球は血管細胞と血小板との対話熱心。ここでは、白血球や細胞パートナー間の相互作用の根底にある分子メカニズムを特徴付ける簡単流アッセイについて述べる。...

培養血管細胞と付着性血小板白血球動員を調査する層流に基づく試金

ここで全血フローサイトメトリーによる単球サブセットを特徴付けるためのプロトコルを提案する.これには、サブセットのゲートおよび表面マーカーの発現を評価する方法を概説し、(炎症性) M1 と M2 マーカー (抗炎症)...

全血によって人間の Monocyte のサブセットの解析フローのフローサイトメトリー解析

ここでは、マウスモデルにおける血液単球の化学的活性を定量化し、血液単球に対する栄養、薬理学的および遺伝的介入の影響を評価し、マクロファージ由来の血液単球を特徴付けるプロトコルを提示する。単球化学集性タンパク質-1(MCP-1)装填系地下膜由来ゲルプラグを用いてマウスモデルを用いる。...

生体内における単球血球活性の定量化と血液単球由来マクロファージの特性化

学ぶ単球サブポピュレーションの体外流れ条件下での動態解析法。共焦点蛍光顕微鏡と表面マーカーを用いて、血管内皮細胞単層への接着と遊走を区別し、炎症における白血球動員メカニズムを解明する。

体外流れ球サブポピュレーションの募集の同時研究

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