Name: マウス血液精巣関門の整合性を研究するIn Vivo法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 48 s
Description: 学ぶマウスの血液精巣関門のin vivo評価法。inulin-FITCを用いてC57Black/6雄マウスの関門機能を評価し、カドミウム塩化物の影響を調べる。生殖医学研究に有用な手法です。

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この作品は著名な若い学者 (BK20150047)、自然科学の国立キー R & D 中国プログラム (2016YFA0500902)、国家自然科学基金、中国の (31471228、31771653)、江蘇省の科学技術振興財団によって支えられました。江蘇省 (BK20140897、14KJA180005) と K.Z. に江蘇省の革新的かつ起業家プログラムの基礎

すべての行われた動物実験は、南京医科大学の委員会によって承認されています。男性の c57bl/6 マウス制御日長条件下で保管された、食料と水と供給されました。
1. 準備
<ol><li>
マイクロインジェクション毛細血管
	<ol>
<li>外径、内側径 10.0 cm、0.8 mm、1.0 mm の長さとマイクロインジェクション毛細血管をそれぞれ使用します。</li>
		<li>キャピラリーの引き手 (図 1 a) にガラス管を引き出します。テストし、使用されている毛細血管の引き手マシンに応じて設定を調整します。</li>
		<li>ピペット チップを先端に 50 μ m 径の毛細血管を取得に使用する鉗子で破る。 注: ヒントは精巣を貫通するには長すぎる可能性があります。</li>
		<li>マイクロ ピペットの面取り機 (図 1) を使用して、30 ° の角度で先端をシャープに。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
試薬
	<ol>
<li>1% ペントバルビ タール ナトリウムを準備: ペントバルビ タール ナトリウム 100 mg のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) (ステップ 2.3.3) 10 mL に溶かします。</li>
		<li>10 mg/mL イヌリン FITC を準備: イヌリン FITC 100 μ L の PBS (ステップ 2.1.6) で 1 mg を溶解します。</li>
		<li>4% のパラホルムアルデヒドの準備: パラホルムアルデヒド (PFA) 4 g で 100 mL の PBS (ステップ 2.3.3) を解散。</li>
		<li>30% ショ糖を準備: ショ糖 10 mL の PBS (手順 2.3.4) での 3 g を溶かします。</li>
		<li>0.1% 塩化カドミウムを準備: 塩化カドミウム PBS (ステップ 2.1.1) 10 mL に 10 mg を溶解します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 方法
<ol><li>
麻酔と presurgery の準備
	<ol>
<li>8 週齢の c57bl/6 男性マウスの重量を量るし、CdCl2の必要量を計算します。マウスのグループを扱う (n = 3) CdCl2 (キリアド プレステージ 5 mg/kg, i. p.) の術前に、3 d。8 週齢の c57bl/6 男性マウスの別のグループを扱う (n = 3) コントロールとして PBS の。</li>
		<li>滅菌注射器、針、ハサミ、鉗子を使用して無菌条件下で手術を行います。</li>
		<li>新鮮な麻酔作業ソリューションを準備します。麻酔の必要な線量は、ペントバルビ タール ナトリウム/kg 体重の 70 mg です。平均では、8 週齢で大人の c57bl/6 マウス 1% ペントバルビ タール ナトリウム (マウスあたり 1.75 mg) の 175 μ L に相当する 〜 25 グラムの重さ。 注: ペントバルビ タール ナトリウム滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) に溶解しています。ソリューション 0.22 um フィルターが使用される前にフィルター ユニット。</li>
		<li>エタノール 75% と手術のための区域をきれいにしクリーンな組織タオルで領域をカバーします。</li>
		<li>サーモスタットのヒーターをオンにし、37 ° c. に温度を調整</li>
		<li>手術の日にイヌリン FITC 作業ソリューション (10 mg/mL) を準備します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
手術の手順
	<ol>
<li>8 週齢の c57bl/6 男性マウスの重量を量るし、麻酔の必要量を計算します。</li>
		<li>ペントバルビ タール ナトリウム 1 mL 滅菌注射器を使用しての腹腔内投与を行います。きれいなケージでマウスを維持します。</li>
		<li>目の反射的な反応と完全な麻酔の下でことを確認するためにマウスの呼吸パターンを観察します。 注: 通常、10 〜 15 分必要なマウスを麻酔が深く、つま先ピンチ応答の完全な欠如と遅い、安定した呼吸のメンテナンスまで。</li>
		<li>操作領域にマウスを移動し、麻酔 (図 2 a) 中の乾燥を避けるために湿ったティッシュ ペーパーでその眼の領域をカバーします。</li>
		<li>髭剃りと、腹部の毛を剃る、75% エタノールと切開部を消毒してください。</li>
		<li>鋭いハサミで腹壁を公開する包皮腺の上 1 cm 皮膚切開をします。小鉗子で腹壁を持ち上げて、0.5 cm 切開腹腔内 (図 2 b) を公開します。</li>
		<li>精巣上体、精巣周囲脂肪パッドを検索する鉗子を使用します。添付の精巣を明確に公開する脂肪パッドを慎重に引き出します (図 2および2 D)。通常、一度に 1 つの精巣に動作します。 注: は、脂肪パッドと手で精巣には触れないでください。</li>
		<li>脂肪パッドと精巣 (図 2) の下に紙 (直径 9 cm) を置きます。</li>
		<li>マイクロインジェクション ピペット注入イヌリン FITC とマイクロマニピュレーター ユニット (図 1) に接続します。優しく逃げず下マイクロインジェクション ピペットを挿入し、(図 2 eおよび2 f) 精巣の間質にイヌリン FITC の 20 μ L の合計を読み込みます。 注: は慎重に移動することを避けるためにマイクロインジェクション ピペットを押し下げます。</li>
		<li>(図 2) 精巣におけるイヌリン FITC の動きを監視します。</li>
		<li>ただちに精巣は腹腔内に注入完了後バックアップします。</li>
		<li>対側精巣の手順を繰り返します。この精巣は、コントロールとして PBS の 20 μ L が注入されます。</li>
		<li>手術用の縫合糸で皮膚を閉じて、サーモスタットのヒーター (図 1 b) の熱パッドにマウスを移動します。皮下注射で体重 1 kg あたりに鎮痛剤 (ブプレノルフィン) の 1 mg の投与します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
精巣と凍結切片作製を収穫
	<ol>
<li>注入後 40 分動物のケアによると頚部転位によって受信者のマウスを安楽死させるし、ガイドラインを使用します。</li>
		<li>シャープはさみのペアを使用して、精巣を収集します。1 mL の血液汚染を削除する氷冷 PBS に精巣を配置します。</li>
		<li>12-24 破棄のための 4 ° C で 4% パラホルムアルデヒド (PFA) の精巣を修正、4 %pfa と洗浄組織 3 1.5 ml 室温で 1 %pbs の x。</li>
		<li>一晩 30% ショ糖で組織の水分を取り除きます。精巣を入れて埋め込みフレームとカバーの化合物の最適な切削温度と組織 (OCT)。OCT を冷凍すると、10 月に精巣全体を覆うことができるので、10 月に埋め込みフレームに入力します。</li>
		<li>-20 ° C でクライオスタットで精巣の 5 μ m 厚い、冷凍の断面を切り取ってスライド ガラスに付着させてください。 注: は莖ドライアイスで埋め込まれた組織切削の剛性が増加します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
画像依頼
	<ol>
<li>加湿ボックスにスライドを配置します。室温で 10 分間スライドを温めます。</li>
		<li>セクション 3 を洗ってトリス緩衝生理食塩水 (TBS) 室温で x。</li>
		<li>暗闇の中で 5 分間空気乾燥します。埃のない紙で任意の残留 TBS をふき取りなさい。</li>
		<li>4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) と断面をカバーしてください。顕微鏡スライドの上逆 coverslip の場所。</li>
		<li>共焦点の顕微鏡を使用して画像を取得します。20 倍の倍率の合計は、鮮やかな蛍光シグナルを検出だけで十分です。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Mruk, D. D., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sertoli-Sertoli+and+Sertoli-germ+cell+interactions+and+their+significance+in+germ+cell+movement+in+the+seminiferous+epithelium+during+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">Sertoli-Sertoli and Sertoli-germ cell interactions and their significance in germ cell movement in the seminiferous epithelium during spermatogenesis.</a> Endocrine Reviews. 25 (5), 747-806 (2004).</li>
<li>Wen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+of+germ+cells+across+the+seminiferous+epithelium+during+spermatogenesis-the+involvement+of+both+actin-+and+microtubule-based+cytoskeletons%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Barriers%22%5BJournal%5D)">Transport of germ cells across the seminiferous epithelium during spermatogenesis-the involvement of both actin- and microtubule-based cytoskeletons.</a> Tissue Barriers. 4 (4), e1265042(2016).</li>
<li>Wang, C. Q., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+seamless+trespass%3A+germ+cell+migration+across+the+seminiferous+epithelium+during+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A seamless trespass: germ cell migration across the seminiferous epithelium during spermatogenesis.</a> Journal of Cell Biology. 178 (4), 549-556 (2007).</li>
<li>Fijak, M., Meinhardt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+testis+in+immune+privilege%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The testis in immune privilege.</a> Immunological Reviews. 213, 66-81 (2006).</li>
<li>O'Bryan, M. K., Hedger, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+Networks+in+the+Control+of+Spermatogenesis+Chronic+Inflammation+in+an+Immunologically+Privileged+Tissue%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Mechanisms+In+Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">Inflammatory Networks in the Control of Spermatogenesis Chronic Inflammation in an Immunologically Privileged Tissue?</a> Molecular Mechanisms In Spermatogenesis. 636, 92-114 (2008).</li>
<li>Li, N., Wang, T., Han, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+cellular+and+molecular+aspects+of+immune+privilege+in+the+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Structural cellular and molecular aspects of immune privilege in the testis.</a> Frontiers in Immunology. 3, 152(2012).</li>
<li>Mruk, D. D., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mammalian+Blood-Testis+Barrier%3A+Its+Biology+and+Regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Review%22%5BJournal%5D)">The Mammalian Blood-Testis Barrier: Its Biology and Regulation.</a> Endocrine Review. 36 (5), 564-591 (2015).</li>
<li>Govero, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus+infection+damages+the+testes+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Zika virus infection damages the testes in mice.</a> Nature. 540 (7633), 438-442 (2016).</li>
<li>Jenabian, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+tolerance+properties+of+the+testicular+tissue+as+a+viral+sanctuary+site+in+ART-treated+HIV-infected+adults%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">Immune tolerance properties of the testicular tissue as a viral sanctuary site in ART-treated HIV-infected adults.</a> AIDS. 30 (18), 2777-2786 (2016).</li>
<li>Holembowski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAp73+is+essential+for+germ+cell+adhesion+and+maturation+in+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">TAp73 is essential for germ cell adhesion and maturation in testis.</a> Journal Of Cell Biology. 204 (7), 1173-1190 (2014).</li>
<li>Legendre, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+engineered+3D+blood-testis+barrier+model+for+the+assessment+of+reproductive+toxicity+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">An engineered 3D blood-testis barrier model for the assessment of reproductive toxicity potential.</a> Biomaterials. 31 (16), 4492-4505 (2010).</li>
<li>Setchell, B. P., Waites, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+permeability+of+the+testicular+capillaries+and+of+the+%27blood-testis+barrier%27+after+injection+of+cadmium+chloride+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Changes in the permeability of the testicular capillaries and of the 'blood-testis barrier' after injection of cadmium chloride in the rat.</a> Journal of Endocrinology. 47 (1), 81-86 (1970).</li>
<li>Griswold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+central+role+of+Sertoli+cells+in+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The central role of Sertoli cells in spermatogenesis.</a> Seminars in Cell & Developmental Biology. 9 (4), 411-416 (1998).</li>
<li>Cheng, C. Y., Mruk, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-testis+barrier+and+its+implications+for+male+contraception%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The blood-testis barrier and its implications for male contraception.</a> Pharmacological Reviews. 64 (1), 16-64 (2012).</li>
<li>Mruk, D. D., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+system+to+study+Sertoli+cell+blood-testis+barrier+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An in vitro system to study Sertoli cell blood-testis barrier dynamics.</a> Methods Molecular Biology. 763, 237-252 (2011).</li>
<li>Orth, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+of+Sertoli+cells+in+fetal+and+postnatal+rats%3A+a+quantitative+autoradiographic+study%5BTitle%5D)+AND+%22Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Proliferation of Sertoli cells in fetal and postnatal rats: a quantitative autoradiographic study.</a> Anatomical Record. 203 (4), 485-492 (1982).</li>
<li>Lee, N. P. Y., Mruk, D., Lee, W. M., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+the+cadherin%2Fcatenin+complex+a+functional+unit+of+cell-cell+actin-based+adherens+junctions+in+the+rat+testis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Is the cadherin/catenin complex a functional unit of cell-cell actin-based adherens junctions in the rat testis?</a> Biology of Reproduction. 68 (2), 489-508 (2003).</li>
<li>Bai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Germline-Specific+Role+for+the+mTORC2+Component+Rictor+in+Maintaining+Spermatogonial+Differentiation+and+Intercellular+Adhesion+in+Mouse+Testis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">A Germline-Specific Role for the mTORC2 Component Rictor in Maintaining Spermatogonial Differentiation and Intercellular Adhesion in Mouse Testis.</a> Molecular Human Reproduction. 24 (5), 244-259 (2018).</li>
<li>Korhonen, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DICER+Regulates+the+Formation+and+Maintenance+of+Cell-Cell+Junctions+in+the+Mouse+Seminiferous+Epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">DICER Regulates the Formation and Maintenance of Cell-Cell Junctions in the Mouse Seminiferous Epithelium.</a> Biology of Reproduction. 93 (6), 139(2015).</li>
<li>Loir, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trout+Sertoli+cells+and+germ+cells+in+primary+culture%3A+I.+Morphological+and+ultrastructural+study%5BTitle%5D)+AND+%22Gamete+Research%22%5BJournal%5D)">Trout Sertoli cells and germ cells in primary culture: I. Morphological and ultrastructural study.</a> Gamete Research. 24 (2), 151-169 (1989).</li>
<li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+the+Integrity+of+the+Blood-Testis+Barrier+%28BTB%29%3A+An+In+Vivo+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Monitoring the Integrity of the Blood-Testis Barrier (BTB): An In Vivo Assay.</a> Methods in Molecular Biology. 1748, 245-252 (2018).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

精子は精上皮で起こる、生殖細胞と体細胞によって支配される高度順序でダイナミックなプロセス (例えば、セルトリ細胞)13。セルトリ細胞では, BTB 構造分割精上皮、基底部および根尖部のコンパートメント。減数分裂と半数体の生殖細胞の開発は、免疫学的障壁14を形成する根尖部のコンパートメントで発生します。
BTB 関数は毒性または男性不妊につながる細胞接合の形成に関与する遺伝子の欠陥が原因で起きます。BTB の整合性を調べるため体外セルトリ細胞培養系が確立されている密接にその形成上皮のことができる生体内でBTB15を模倣します。この生体外でシステムは、セルトリ細胞の機能と構造を研究するための単純なモデルを提供します。しかし、精巣由来セルトリ細胞と培養の in vitro動物年齢と細胞密度15...

哺乳類精子は精原自己複製と劇的な中半数体精子細胞分裂、減数分裂、精子形成、精母細胞を分化を含む高度に構造化されたプロセスと見なされます生化学的および形態学的変化が発生します。発展途上の生殖細胞は精細管内腔に向かっての基本から徐々 に転送されます。このプロセスは、生殖細胞、セルトリ細胞1,2間細胞細胞の接触によって規制されています。隣接するセルトリ細胞は精細管の基地の近くに位置する BTB を形成します。物理的に、BTB は、上皮を基部と adluminal のコンパートメントに分割します。段階 VIII ・ IX 上皮サイクルの基底のコンパートメントから preleptotene/leptotene を精母細胞は adluminal コンパートメント3に入る、BTB の間で移行します。したがって、BTB の機能は、減数分裂と精子形成の4,5,6の完了した immunoprivileged の微小環境を提供することです。その他血液-組織の障壁 (例えば血液脳関門) タイトな接合 (TJs) だけで構成されるのとは異なり、BTB は 4 つの異なる接合 (TJs、心霊の特殊化、ギャップ結合および中間フィラメント ベースによって形成されます。デスモゾーム) セルトリ間細胞1,7。
多くの研究は、BTB 整合性7,8,9のメカニズムを調査するため、遺伝子組み換えマウス、ウイルス感染、環境有害物質を使用しています。BTB 中断障害精子と受精率低下や不妊を誘発します。孤立したセルトリ細胞の初代培養に基づく体外モデルを使用されていますので BTB 形成と整合性は、セルトリ細胞8間の接触の影響を受ける確認されている、BTB スタディの。ただし、このモデルは、BTB 動態の生体内を模倣することはできません正確に。また、セルトリ細胞と生殖細胞のような共同の文化は確立されていない BTB10,11のすべての関連する構造・機能コンポーネントを反映することができます。
一般に、生体内でBTB 整合性の試金は通常 EZ リンク スルホ-NHS-LC-ビオチンと FITC 結合イヌリン (イヌリン FITC) などの小さな分子に基づいています。通常、ビオチンまたは基底のコンパートメントからイヌリン FITC の拡散は、BTB 構造によってブロックされます。したがって、我々 はコントロール群と比較して BTB 損傷の程度を評価するためにこのメソッドを使用することができます。BTB は、BTB カドミウム塩化 (CdCl2)12、治療などの刺激の特定の種類の危険にさらされることができます最終的に指標として adluminal コンパートメントを入力する小分子にアクセス可能になります。
BTB 整合性アッセイ体内初期ビオチンまたはイヌリン FITC を侵襲的な複雑で時間のかかるを外科では、頚静脈に注入することが含まれます。その上、記者物質は循環を介して全身を通って拡散、ビオチンまたは精細管でイヌリン FITC の局所濃度は限られる。また、全身の露出は免疫反応を引き起こす可能性があります。シンプルで効果的な体内BTB 整合性試金、精巣の間質にイヌリン FITC の小さい因数の直接注入を有効にするを紹介します。蛍光分類方法を使用して、染色のプロセスは便利な二次抗体は必要ないためです。ここでは、精巣に入る蛍光染料のプロセスを視覚化します。

<table><tbody><tr><td>キャピラリープーラー&nbsp;</td><td>SUTTER INSTRUMENT (USA)</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Hyclone (USA)</td><td>SH30258.01</td><td>dilution to 1&times; in ddH2O</td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td><td>Sigma (USA)</td><td>F6057</td><td></td></tr><tr><td>接着顕微鏡スライド</td><td>CITOGLAS (中国)</td><td>80312-3161</td><td></td></tr><tr><td>塩化カドミウム</td><td>Sigma (USA)</td><td>655198-5G</td><td></td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>ツァイス (ドイツ)</td><td>LSM700</td><td></td></tr><tr><td>ダストフリーペーパー</td><td>Kimberly-Clark (アメリカ)</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>Inulin-FITC</td><td>Sigma (アメリカ)</td><td>F3272</td><td></td></tr><tr><td>マイクロインジェクション毛細血管</td><td>鄭天一 (中国)</td><td>BJ-40</td><td>1.0 mm &times; 0.8 mm&nbsp; &times; 100 mm</td></tr><tr><td>マイクロピペットベベラー</td><td>NARISHIGE (JAPAN)</td><td>EG-400</td><td></td></tr><tr><td>OCT</td><td>さくら(日本)</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>シグマ(米国)</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>ペントバルビタールナトリウム</td><td>メルク(ドイツ)</td><td>P11011</td><td></td></tr><tr><td>シェーバー&nbsp;</td><td>Yashen(中国)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>Nikon (JAPAN)</td><td>SMZ1000</td><td></td></tr><tr><td>スクロース&nbsp;</td><td>Sangon Biotech (China)</td><td>A610498</td><td></td></tr><tr><td>Surgical instruments</td><td>Stronger (China)</td><td></td><td>はさみ、鉗子、ニードルホルダー</td></tr><tr><td>Syringe</td><td>KDL (China)</td><td>20163150518</td><td>0.45 mm &times; 0.16 mm RW LB</td></tr><tr><td>Thermostatic heater</td><td>KELL (Nanjing, China)</td><td>KEL-2010</td><td></td></tr><tr><td>10x TBS, pH 7.6</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2 M Tris</td><td>Sangon Biotech(中国)</td><td>A600194</td><td></td></tr><tr><td>1.37 M Nacl</td><td>Sangon Biotech(中国)</td><td>A610476</td><td></td></tr></tbody></table>

マウス血液精巣関門の整合性を研究するin vivo法

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

精子は、精巣の精細管で成熟した精子に精巣の開発です。このプロセスは、哺乳類の体に厳しい組織障壁であり 2 つのコンパートメント、基部と、adluminal に精上皮を分離血液精巣関門 (BTB) でセルトリ細胞によってサポートされます。BTB 減数分裂における生殖細胞のユニークな微小環境を作成します私/II と精子形成を介して精子に postmeiotic 細胞の開発のため。ここでは、マウス精巣体内の BTB の整合性を監視する信頼性の高いアッセイについて述べる。そのまま BTB 指示薬の頂のコンパートメントに基底からイヌリンを FITC 結合の拡散をブロックします。この手法は、候補遺伝子、ウイルス、または BTB 関数または簡単な手順と方法と比較して手術技能の最小限の要件との整合性に影響を与える可能性があります環境の毒性を勉強に適しています。

BTB 整合性分析を実行するための実験の設定を図 1に示します。プルし、キャピラリーの引き手とピペットの面取り機、マイクロインジェクション毛細血管をそれぞれシャープ (図 1 a 1 C)。サーモスタットのヒーター用マイクロインジェクション装置は、図 1 bと1 Dで示されます。
図 2イヌリン FITC のインジェクションの主要な手順が表示されます。はさみを使用して、マウス (図 2 aおよび2 b) 完全な麻酔を受けた後に小切開を行います。マウス精巣は露...

ここでは、精巣にイヌリン FITC を注入して血液精巣関門の整合性を評価するためのプロトコルを提案する.遺伝と環境要素によって危険にさらされることができます血液精巣関門の整合性を研究するため生体内で効率的な方法です。

マウス血液精巣関門の整合性を研究するIn Vivo法

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...

この方法は、遺伝子候補、ウイルス、または血液精巣バリア機能または完全性に影響を与える可能性のある環境毒素に関する生物学分野の血液検査障壁の主要な質問に答えるのに役立ちます。手術の3日前に、少なくとも3匹の8週齢のC57Black/6雄マウスを、腹腔内注射を介して1キログラムの体重1キログラム当たり5ミリグラムの塩化カドミウムで治療する。手術当日、75%エタノール殺菌手術領域の上にきれいな組織を置き、サーモスタットヒーターを摂氏37度に設定します。麻酔をしたマウスを組織に置き、つま先ピンチに対する反応の欠如を確認する。腹部の毛を剃り、75%エタノールで露出した皮膚を消毒する。腹壁を露出させるために前置腺の上に1センチメートルの皮膚切開を行い、腹膜に0.5センチメートルの切開を行うために皮膚を持ち上げるために小さな鉗子を使用します。鉗子を使用して、精巣上体と精巣の周りの脂肪パッドを検索し、慎重に脂肪パッドを引き出して1つの付着精巣を露出させます。脂肪パッドと精巣の下に9センチメートルの紙を置き、新たに調製したイヌリン-FITC溶液でマイクロインジェクションピペットをロードします。ピペットをマイクロマニピュレーターユニットに接続し、解剖顕微鏡を使用して、チュニカアルブギネアの下にマイクロインジェクションピペットチップをそっと挿入します。手術レバーをゆっくりと回転させて、20マイクロリットルのイヌリン-FITCを精巣のインタースティシウムに送ります。配信が成功した場合、精巣は明るい緑色と黄色に変わります。すぐに精巣を腹腔に戻し、20マイクロリットルのPBSで対側精巣を注入し、外科縫合糸で皮膚を閉じる。そして、サーモスタットヒーターのヒートパッドにマウスを置きます。注射の40分後、鋭いはさみを使用して各マウスから精巣を採取し、1ミリリットルの氷冷PBSで組織を洗浄する。次に、1回の洗浄につき1.5ミリリットルで3回の洗浄を行い、摂氏4度で4%パラホルムアルデヒドで12〜24時間精巣を固定します。一晩で30%スクロース脱水後、個々の埋め込みフレームにサンプルを移し、最適な切断温度化合物で組織を覆います。クライオスタットの温度をマイナス20°Cに設定し、OCTが凍結するまで約10分間クライオスタットにフレームを入れます。次に、各鋳片全体が各金型で覆われるまで、各埋め込みフレームに新しいOCTを充填します。OCTの第2層が凍結すると、各精巣の厚さ5マイクロメートルの断面を取得し、得られるガラス顕微鏡スライド上に組織切片を捕捉する。サンプルを画像化するには、まず室温で加湿ボックスでスライドを温めます。10分後、スライドを洗浄ごとに新鮮なトリスバッファ付生理液で3回洗浄し、セクションを光から保護して5分間乾燥させます。ダストフリーの紙を使用して残留生理的な生理を取り除き、サンプルをDAPIを補った取り付け媒体で取り付けます。次に、各サンプルを反転カバースリップで覆い、共焦点顕微鏡の20X目的の下でサンプルを画像化します。3日間の塩化カドミウム治療は、血液精巣バリアに損傷を与え、イヌリン-FITCが基底コンパートメントから半日本体上皮の尖体コンパートメントへの拡散を可能にする。対照的に、この拡散は、PBS処理精巣の制御で遮断される。血液検査バリア損傷の程度は、同じ半細管の半径に対するイヌリン-FITC拡散の距離の比を計算することによって決定される。さらに、ヘテロ接合性Rictor floxdノックアウトマウスの無傷の血液検査障壁は、障壁を越えて上端コンパートメントへのイヌリン拡散をブロックし、条件付きRictorノックアウトマウスはインリン拡散を可能にする侵害された血液検査障壁を有する。この手順を試みる間、実験当日に準備されたイヌリン-FITCを提供し、FITCは光感受性分子であるため、組織を光から保護しておくことが重要です。この技術の意味は、血液検査障壁の機能が精子形成におけるmeiosisの完了のための免疫特権的微小環境を提供することであるため、精子形成障害の治療に及ぶ。その開発後、この技術は、生殖医学の分野の研究者がマウスの不妊症と不妊症を探求する方法を提供します。パラホルムアルデヒドを使用することは非常に危険であり、この手順を実行する際には衣服やフェイスマスクを着用するなどの予防措置を常に取るべきであることを忘れないでください。

an-in-vivo-method-to-study-mouse-blood-testis-barrier-integrity

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

アン<em生体内で&gt;</em血管透過性をテストする&gt;アッセイ

この記事では、精子形成のユニークなプロセスを研究するために精巣マウス細胞のトランスフェクション技術としてインビボでマウス精巣のマイクロインジェクションやエレクトロポレーションについて説明します。提示されたプロトコルは、ガラスキャピラリーの準備、輸出管を経由してマイクロインジェクション、エレクトロポレーションによるトランスフェクションの工程を含む。...

マウス精巣の生体内マイクロインジェクションやエレクトロポレーションで

私たちは、マトリックスゲルプラグ血管新生アッセイの変動を用いて、マウスにおけるヒト内皮 - 周皮細胞の相互作用を研究するためのプロトコルを提示します。...

マウスにおけるマトリックスゲルプラグアッセイを用いたヒト内皮-周皮細胞の相互作用のin vivo研究で

2 つのメソッドは、腸管のバリア機能を決定するここで掲載されています。上皮メーター (ボルト/オーム) は、組織培養の井戸に直接培養上皮細胞の上皮電気抵抗の測定に使用されます。マウスで FITC...

腸管上皮細胞の透磁率を決定する体外と体内アプローチ

血液脳関門の機能障害の動物モデルに適用可能な灌流が続く蛍光トレーサーの腹腔内注入によるマウス脳血管透過性アッセイをご紹介します。1 逸見脳は、透水性の定量的評価と可視化トレーサー/染色の他に使用されます。10 匹のマウスに 5-6...

生体内で血液脳関門透過性アッセイを用いたマウス蛍光トレーサーに分類

ここでは、精巣での RBP 候補の主要な RNA 標的を決定するための eCLIP...

マウス精巣におけるタンパク質結合 RNA の効率的な同定のための拡張架橋免疫沈降 (eCLIP) 法

生体内顕微鏡を利用して、ここで提示される方法は、生きている動物の腸上皮細胞脱落のリアルタイム視覚化を可能にする。従って、麻酔化マウスの局所染色された腸粘膜(アクリフラビン及びローダミンB-デキストラン)は、共焦点顕微鏡を用いて単細胞分解能まで画像化される。...

腸透過性と上皮細胞流れ性能を評価する生体内顕微鏡ベースのアプローチ

本プロトコルは、半日本円上皮周期の特定段階を表す成体マウス半細管の断面微小切除法、およびその中の細胞タイプ、および後にスカッシュ製剤および無傷の管状セグメントの免疫染色を記述する。...

下流免疫染色解析のためのマウス半離層上皮周期の特定段階のトランスイルミネーション支援解離

本稿では,男性減数分裂の貴重なモデルであるGSK923295の腹部手術と精巣注射によるCENP-Eの in vivo...

in vivo阻害、免疫蛍光法およびフローサイトメトリーを用いた精母細胞におけるキネシン-7 CENP-Eの機能評価(英語)

本プロトコールでは、顎下腺(SMG)の内皮バリア機能を、2光子レーザー走査顕微鏡下で in vivo...

インビボ マウス顎下腺における血管透過性検出

本研究では、フルオレセインイソチオシアネート標識(FITC)デキストラン を経口強制 投与してマウスに投与し、 in vivo...

フルオレセインイソチオシアネート標識デキストランを用いたマウスの腸バリア完全性の評価

学ぶマウスの血液精巣関門のin vivo評価法。inulin-FITCを用いてC57Black/6雄マウスの関門機能を評価し、カドミウム塩化物の影響を調べる。生殖医学研究に有用な手法です。

マウス血液精巣関門の整合性を研究するIn Vivo法

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