Name: 複数の齧歯動物の頭脳の同時セクショニング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: 学ぶ複数の齧歯動物の脳を同時に凍結・セクション化する手法。免疫組織化学の染色ばらつきを減らし、神経科学研究の再現性と効率性を向上させる革新的な組織処理プロトコルです。

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PCH ミッション サポート資金は、本稿で報告された研究をサポートしました。著者は、数字で使用されている画像を撮影のダニエル ・ グリフィスを感謝したいです。

Megabrain 技術は、男性成人 C57Bl6 マウス5、若年ラット、およびリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 続いて x 1 と transcardially をした大人の Sprague-dawley ラットから hemisected と全体の脳を使用して最適化されています4% パラホルムアルデヒド6。マウスおよびラット、男女や年齢の他の系統と同様の結果を実現できます。この原稿のデータを生成する研究若年ラットを使用し、アリゾナ大学機関動物のケアと使用委員会によって承認された、実験動物のケアのためのガイドおよび実験室の使用によると介抱され動物7。
1. 灌流脳に対する凍害保護作用
<ol><li>次成功 transcardial 潅流6は動物から完全な脳6、8を収集し、後 24 時間 PBS で 4% のパラホルムアルデヒドの 25 mL バイアルに置くことで解決。 注意: パラホルムアルデヒドは有毒な組織の定着剤;取り扱いに注意。その濃度と化学の発煙のフードの中のボリュームを識別する具体的にはラベルの付いた廃棄物コンテナーにパラホルムアルデヒドを転送し、化学廃棄物の化学物質安全性または正しく破棄されるまでキャビネットの店訓練を受けた技術者。</li>
	<li>発煙のフードの 24 時間が経過した後は、ヘラを使って 4% パラホルムアルデヒドから脳を削除します。脳がバイアル (約 24 時間) の底に沈むまで、1 x 含有トリス緩衝生理食塩水 (TBS) で 15% ショ糖液約 20 mL のバイアルに脳を転送します。</li>
	<li>次に、脳は、バイアル (約 24-48 h) の底に沈むまで脳を 1 x TBS で 30% ショ糖液約 20 mL のバイアルに転送します。</li>
</ol>2. 脳の凍結
<ol><li>ドライアイスの氷のバケツのベッドの上 500 mL ガラス製ビーカーを置きます。イソペンタン (2 メチル-ブタン) の 300-400 mL をガラスのビーカーに注ぐ。</li>
	<li>-45 ° C と-50 ° C の間に到達するイソペンタンの温度を許可します。密接に監視し、温度計、それをプロシージャ全体で一定に保つこの温度範囲を維持します。温度の測定値が下またはビーカーの側面に触れる中ではなく、ソリューションの中間から取られるを確認します。</li>
	<li>ベンチトップ、埋め込み型使い捨てを埋める (材料リスト参照) 最適な切削温度の約 1/2 フル (10 月;材料の表を参照してください) 化合物します。OCT で気泡がないことを確認します。ある場合任意の気泡はヘラや針でそれらを削除します。</li>
	<li>
30% ショ糖のバイアルから最初の脳をヘラで削除します。この時点で、いずれかの凍結脳全体または研究デザインに応じて、hemisect。
	<ol>
<li>Hemisected 脳の半球を分離するのに組織をきれいにカットするのに新しいかみそりの刃を使用します。研究のため必須ではない場合は、この段階で小脳および嗅球を削除します。小脳は、調査のため必要がある場合は、金型にまっすぐ立って脳を支援するために脳の後部の端に平らな面をカットすることをお勧めします。研究には、ローカライズされた領域から組織のみ必要とする場合は、既知の座標に基づく脳をブロックする齧歯動物の脳行列を使用できます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>脳の命名システム数値を与えます。図 1に示すように図を描きます。位置 2、脳が凍結された方向の迅速な特定を支援するための空白文字として位置 1 を残しての Megabrain 型に配置する最初の脳の数を記述します。</li>
	<li>1 の位置に配置する脳鈍い鉗子かピンセットを使用して、ピックアップします。最初上向きカットする側の脳に合わせます。下の適切な場所で、10 月に脳、それまでその位置を調整するピンセットを使用して独立して立っています。</li>
	<li>2.3 〜 2.5 残りの脳/半球を 3-10 の位置に固定するための手順を繰り返します。左右対称レイアウトでの脳/半球の配置は避けてください。</li>
	<li>Megabrain 金型のすべての 9 の脳を確認します。一度脳が独立して立っている、直立物および正しい方向 (図 2 bに示すように)、10 月のより 10 月までに追加金型 (脳の上部を覆われている)。また、OCT で目に見える気泡がないことを確認します。</li>
	<li>鉗子はないなって部分的に冠水した (図 3 a) 10 月に確保する、金型のコーナーを保持するのに鉗子を使用します。イソペンタン (-45 ° C ~-50 ° C) に金型を低い金型レベルを維持するように注意しながら、下の 3 番目が金型に水没します。ここで表面と組織 (図 3 b) から上昇し 10 月に任意の気泡をように保持します。</li>
	<li>30 後 s、低い少なくとも 3 分 (図 3) イソペンタン、鉗子、Megabrain を残してからのリリースに全体の金型が冠水しました。脳のまま直立と等距離にあるのでカビがレベルを維持ようにする (図 3 D)。</li>
	<li>3 分後、イソペンタンから脳 (図 3E) 埋め込みを使用する 10 月、冷凍を含む金型を削除する鉗子。</li>
	<li>すぐに、金型とその内容をアルミホイルで包んでと動物の番号または Megabrain 識別ラベルします。冷凍 Megabrain を組織を避けるためにできるだけ控えめにタッチします。</li>
	<li>この Megabrain は今-20 ° C のフリーザーに転送し、24 時間の最小値を格納できます。 注: プロトコルがここで一時停止にすることができます、凍結セクショニングが行われるまで、Megabrain を格納できます。</li>
</ol>3. クリオスタットの区分のため、Megabrain の準備
<ol><li>-19 ° c、クライオスタットのキャビネットの温度を設定します。続行する前にこの温度に達したかどうかを確認します。断面中、-18 ° C と-20 ° C の間にキャビネットの温度が保たれていることを確認します。</li>
	<li>-20 ° C のフリーザーから、Megabrain を取るし、クリオスタットに入れます。また、クリオスタットに適切なサイズの 2 つの細い先端絵筆チャックを配置します。クリオスタットの温度に来て、少なくとも 15 分用クライオスタットで、Megabrain とチャックの両方を残します。</li>
	<li>適切にラベルは Megabrain 識別番号、スライド番号をスライドします。これらのスライドをスライド暖かい (35-45 ° C) に置きます。</li>
	<li>アルミ箔から Megabrain の包みを開けます。縦型 (図 4 a) から 10 月のブロックを簡単に除去できるように金型の手抜きをするのにかみそりの刃を使用します。</li>
	<li>10 月の薄層 (約 3 mm 厚) をチャックに分配します。</li>
	<li>すぐに、指と OCT の最小限の接触、望まれる方向に、チャックに、Megabrain を配置します。融解を最小限に抑える大きな鉗子をこの手順の使用もできます。Megabrain をセクション、開始する前に完全にフリーズする 10 月を許可するように 15-20 分用クライオスタットでチャックを搭載しました。</li>
	<li>10 月の基本レイヤーを凍結している、Megabrain の側面のまわり 10 月 2 mm の厚い層を適用、チャックに側面からダウンを実行するこれを許可します。これはチャックに Megabrain をセキュリティ保護に役立ちます。もう一度前に、凍結する 10 月を許可するように 15-20 分用クライオスタットのマウント Megabrain チャックを残します。</li>
	<li>側面または底面のチャック (図 4 b) から任意の余分な 10 月を削除するのにには、かみそりの刃を使用します。</li>
</ol>4. セクショニング、Megabrain
<ol><li>始める前に、少なくとも 20 mL の 1x PBS を含むビーカーがアクセスできることを確認します。</li>
	<li>クライオスタット (図 4 b) のチャックの頭の中に、Megabrain を搭載、チャックを位置します。</li>
	<li>所望の厚さにカットするクライオスタットを設定します。現在の方法は、10 μ m 50 μ m のセクションからに最適化されています。</li>
	<li>トリム OCT と組織組織コレクション (図 4) に必要な脳の領域に到達するため必要に応じて。</li>
	<li>組織を収集する準備ができたら、ステージ上に置きますアンチロール プレートを下げるし、1 つのセクションを取るのクライオスタット ハンドルを回します。ゆっくりと持ち上げます断面 Megabrain がアンチロール プレートに接続されていないとステージ図 4オフに該当しないように注意しながら、アンチロール プレート)。</li>
	<li>フラット (図 5 a) クライオスタット ステージ上にあるまで、Megabrain セクションをアンロールするペイント ブラシを慎重に使ってください。(必要な場合保持する OCT フラット ローリングを防ぐためにペイント ブラシを使用して)。</li>
	<li>暖かいスライドからスライドを削除、スライド、ラベル面を下、セクションのスライドに固執をするステージに Megabrain のセクションの上をホバーします。</li>
	<li>すぐに各組織切片スライドに 1 × PBS のドロップを適用し、これらを彼らはフラット起毛されているまで乾燥を許可しない (4.9 の手順を参照してください)。</li>
	<li>組織のすべての泡をブラシとそれはスライド (図 5 b) の上に平らに横たわっているので、ティッシュを展開 1 × PBS 中に浸漬微細先端絵筆を使用します。脳断面の位置を変更し、従って他のティッシュ セクションに対する相対位置を失うように注意します。涙を避けるために注意して組織を操作します。スライドの端から脳セクションそのまま coverslip といくつかのプロトコルを汚すで PAP ペン アプリケーション用周辺のスペースが必要。</li>
	<li>暖かいと 45 分カバー ティッシュに沈降からほこりを防ぐために必要に応じて乾燥、バック スライドにスライドを配置します。一度乾燥し、さらに使用するまで-80 ° c でスライドを格納します。</li>
</ol>

<ol><li>Lyck, L., Dalmau, I., Chemnitz, J., Finsen, B., Schroder, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+markers+for+quantitative+studies+of+neurons+and+glia+in+human+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical markers for quantitative studies of neurons and glia in human neocortex.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (3), 201-221 (2008).</li>
<li>Fritz, P., Wu, X., Tuczek, H., Multhaupt, H., Schwarzmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+in+immunohistochemistry.+A+research+method+or+a+diagnostic+tool+in+surgical+pathology%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Pathologica%22%5BJournal%5D)">Quantitation in immunohistochemistry. A research method or a diagnostic tool in surgical pathology?</a> Pathologica. 87 (3), 300-309 (1995).</li>
<li>Walker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+immunohistochemistry--issues+concerning+methods%2C+utility+and+semiquantitative+assessment+I%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">Quantification of immunohistochemistry--issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment I.</a> Histopathology. 49 (4), 406-410 (2006).</li>
<li>Evilsizor, M. N., Ray-Jones, H. F., Lifshitz, J., Ziebell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer+for+immunohistochemistry+on+cryosectioned+rat+brain+tissue%3A+example+staining+for+microglia+and+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Primer for immunohistochemistry on cryosectioned rat brain tissue: example staining for microglia and neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (99), (2015).</li>
<li>Harrison, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolvins+AT-D1+and+E1+differentially+impact+functional+outcome%2C+post-traumatic+sleep%2C+and+microglial+activation+following+diffuse+brain+injury+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%2C+Behavior%2C+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Resolvins AT-D1 and E1 differentially impact functional outcome, post-traumatic sleep, and microglial activation following diffuse brain injury in the mouse.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 47, 131-140 (2015).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).</li>
<li>Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+bioscience+research+reporting%3A+the+ARRIVE+guidelines+for+reporting+animal+research%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research.</a> PLoS Biology. 8 (6), e1000412(2010).</li>
<li>Kennedy, H. S., Puth, F., Van Hoy, M., Le Pichon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+removing+the+brain+and+spinal+cord+as+one+unit+from+adult+mice+and+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Animal+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">A method for removing the brain and spinal cord as one unit from adult mice and rats.</a> Lab Animal (NY). 40 (2), 53-57 (2011).</li>
<li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematoxylin+and+eosin+staining+of+tissue+and+cell+sections%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protocols%22%5BJournal%5D)">Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections.</a> CSH Protocols. 2008, pdb prot4986 (2008).</li>
<li>Ji, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Impact+of+Repeated+Freeze-Thaw+Cycles+on+the+Quality+of+Biomolecules+in+Four+Different+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biopreservation+and+Biobanking%22%5BJournal%5D)">The Impact of Repeated Freeze-Thaw Cycles on the Quality of Biomolecules in Four Different Tissues.</a> Biopreservation and Biobanking. 15 (5), 475-483 (2017).</li>
<li>Pegg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+history+and+principles+of+cryopreservation%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Reproductive+Medicine%22%5BJournal%5D)">The history and principles of cryopreservation.</a> Seminars in Reproductive Medicine. 20 (1), 5-13 (2002).</li>
</ol>

著者の開示があります。

それは、融解と再組織の凍結を防ぐために、Megabrain とその周辺の温度を常に監視する必要があります、この手順で考慮必要があります。脳のみ削除できます-20 ° C のフリーザーからに 3 回としてたびにそれに触れると暖かい変動温度、組織と、クリオスタットの左を解凍し、refreezes、テクスチャや異常組織の完全性10のようなゼリーを引き起こしています。したがって、すべてを一度に、Megabrain の切削に最適です。
ティッシュの固定に対する凍害保護作用は、氷結晶の形成を最小限に抑えるため、外部の微生物の成長を減らすし、組織の整合性10はそのまま維持、酵素反応を停止するには、このプロトコルの主要部分。脳はショ糖と cryoprotected は、組織内の水は、組織を細断処理、フォームに穴を引き起こす凍結プロセス中に氷の結晶を形成できます。我々 は TBS でショ糖のシリアル希薄を示唆している、脳は類似に対する凍害保護作用を達成するために長時間 (48-72 時間) の 30% シ...

ここでは、cryosection 複数齧歯動物脳同時に下流の免疫組織化学的手順を開発した Megabrain と呼ばれる手法のプロトコルを提案する.Megabrain は、複数の動物からのティッシュを含んでいる 1 つのスライドの生産が可能です。この手法は、9 の成体ラット半球または 5 の成人における脳からコロナ セクションを同時にカットする最適化されています。したがって、手法は大規模な免疫組織化学的研究や動物の大規模コホートからスライド マウントの脳組織に行う他の分析に最も適切です。
免疫組織化学には理解し、彼らの表情と特定の組織1,2,3の細胞変化を特徴付ける興味の蛋白質に対して指示される抗体の使用が含まれます。免疫組織化学的の使用は神経科学研究では、脳の4の細胞・分子の理解で助ける他の科学分野の間で流行。多くの動物との脳のセクションを含む大規模な研究は、リソースと時間がかかることができます。など、多面的な根拠、Megabrain の開発がある: セクショニング、マウント、およびその結果以下の試薬を使用しながら、組織を染色を過ごした時間を短縮します。さらに、プロセスを合理化し、同じ複数の脳を染色する能力のラウンド バッチ、免疫組織化学3の制限を染色性変動のいくつかを軽減するのに役立ちます。さらに、Megabrain を区分個別冷凍げっ歯類脳を断面に時間節約代替および動物やでも、試験治療グループ間の組織の迅速な比較により顕微鏡検査の技術。

<table><tbody><tr><td>Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCTコンパウンド(12のケース)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-373-65</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Shandon Peel-A-Way Disposable Embedding Molds</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-41</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 高精度ストレートブロードストロングポイントピンセット/鉗子</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-000-128</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 20 mL HDPE シンチレーションバイアルポリプロピレンキャップ</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>03-337-23</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖、ポリボトル 2.5 kg</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>S2-212</td><td>15%と30%の両方のショ糖濃度を構成する必要があります。</td></tr><tr><td>2-メチルブタン(認定)、フィッシャーケミカル</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>O3551-4</td><td></td></tr>パイ<tr><td>レックストールフォームビーカー</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>02-546E</td><td></td></tr><tr><td>フィッシャーブランド汎用液体イングラス部分浸漬温度計(-50〜+ 50°C;C)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>13-201-642</td><td></td></tr><tr><td>フィッシャーブランド&nbsp;スクープラ スパチュラ</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>14-357Q</td><td></td></tr><tr><td>スタンレー カミソリ刃</td><td>グレインジャー</td><td>4A807</td><td></td></tr><tr><td>エッジライト ミクロトーム ブレード</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>14-070-60</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スライド (1" 霜) - 白</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>22-034-979</td><td></td></tr><tr><td>ギブコ&nbsp;PBS(リン酸緩衝生理食塩水)10倍、pH 7.2</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>70-013-032</td><td>1倍に希釈&nbsp;使用前に</td></tr><tr><td>15ピースの細かいペイントブラシ</td><td>アマゾン</td><td>B079J12ZRV</td><td></td></tr><tr><td>PAPペン</td><td>abcam</td><td>ab2601</td><td></td></tr><tr><td>チャック 図4に示されているのは、ラボの技術者によってカスタムメイドされましたが、同様のサイズは他の会社から商業的に注文することができます。</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>EMS065</td><td></td></tr></tbody></table>

複数の齧歯動物の頭脳の同時セクショニング

Simultaneous Cryosectioning of Multiple Rodent Brains

組織および免疫組織化学は、顕微解剖学を視覚化し、生体組織内の蛋白質を集中解析のルーチンの方法です。他の科学分野の茄多と同様、神経科学、これらのテクニックを使用します。スライド マウント組織または浮遊セクションに対する免疫組織化学を行うことができます。スライド マウントのサンプルを準備して、時間集中的なプロセスです。Megabrain と呼ばれるテクニックの次のプロトコルは、単一の冷凍ブロックに複数の脳を組み合わせることで最大 90 %cryosection とマウントの脳組織へ搬送時間を短縮しました。さらに、この手法は大規模な組織化学的研究でのラウンドを染色の間見られる変動を削減しました。現在のテクニックは、下流の免疫組織化学的解析で齧歯動物の脳組織を使用するために最適化されていますただし、セクショニングを使用する別の科学的なフィールドに適用できます。

このプロシージャに肯定的な結果は、泡や涙、凍結された向きでない、スライドにある組織です。切片は、OCT で脳と図 1に示すよう良い表記の良い配置のため離れてしやすい等間隔です。脳組織は同じような年齢の動物から採取したと、組織は OCT に合っていると仮定すると、スライドの収集のセクションは似たようなコロナの平面は、動物の脳の比較を許可するを表す必要があります。組織は最小限凍結アーティファクトでも、凍結していること H &amp; E 染色はに対する凍害保護作用品質9を評価するために実施することができます。免疫組織化学は、染色の図 6に示すように遂行することができます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/5...

ここでは、凍結し、単一脳の処理時間を節約する代わりとして複数の動物から脳組織をセクション プロトコルを提案します。これは免疫組織化学的に染色変動を減少し、時間セクショニングとイメージングを減少します。

Histology and immunohistochemistry are routine methods of analysis to visualize microscopic anatomy and localize proteins within biological tissue. In ...

この時間を節約する方法は、解剖学および局所的なタンパク質および組織の可視化を最適化するために、神経科学研究における免疫組織化学的手順のラウンド間の変動を減少させる。この技術の主な利点は、複数の脳を単一の凍結ブロックに組み合わせることで、凍結切断と脳組織の取り付けにかかる時間を短縮することです。この技術はげっ歯類の脳の冠状動脈セクションに最適化されていますが、矢状または横方向のセクション、または筋肉や肝臓などの異なるタイプの組織に適応することができます。正常な経心面灌流に続いて、24時間PBSで4%パラホルムアルデヒドの25ミリリットルバイアルで動物からの脳を後固定する。この後、パラホルムアルデヒドから脳を取り除くために鈍い先端鉗子を使用してください。TBSで30%スクロース溶液の約20ミリリットルのバイアルに脳を移す。彼らはバイアルの底に沈むまで、脳と解決策を保ちます.次に、アイスバケツのドライアイスのベッドの上に500ミリリットルのガラスビーカーを置きます。その後、ビーカーに300〜400ミリリットルのイポペンタンを注ぎます。マイナス45度とマイナス50°Cの間のイセペンタンを維持します。ベンチ上部で、最適な切断温度またはOCT化合物で、使い捨て埋め込み金型をほぼ半分いっぱいに充填します。針を使用して、金型から気泡を取り除きます。スクロース溶液から最初の脳を取り除くために鈍い先端鉗子を使用してください。その後、半球を分離する前に小脳と嗅球を取り除くために新しいカミソリの刃を使用してください。次に、脳に数値命名システムを与えます。鈍い鉗子を使用し、2番目の位置に置かれる脳を拾い、最初に上向きに切り取られる側でそれを向ける。OCTに脳を下げ、ピンセットを使用して独立して立つまで位置を調整します。この手法の重要な変更は、位置 1 の空白です。この空間は、メガブレインの向きを容易に識別できるように指定されているため、各脳に関連付けられている動物を識別します。すべての脳が金型に配置された後、脳の上部をカバーするのに十分なOCTを追加し、針を使用して気泡を取り除きます。フォースプを使用して金型のコーナーを保持し、フォースが OCT で部分的に水没しないようにします。次に、金型の底部3分の1が水没するように、イソペンタンにモールドを下げます。30秒後、金型全体をイポペンタンに下げ、鉗子から放出します。3分後、鉗子を使用してイポランタンから金型を取り除きます。金型とその内容物を直ちにアルミホイルで包み、適切なラベルを貼ります。メガブレインを最低24時間、マイナス20°Cの冷凍庫に移します。まず、クライオスタットキャビネットの温度をマイナス19°Cに設定します。冷凍庫からメガブレインを取り出し、クライオスタットに入れる。その後、チャックと2つの薄い先端のペイントブラシをクライオスタットに置きます。この後、メガブレイン識別番号とスライド番号でスライドにラベルを付け、スライドウォーマーにスライドを置きます。次に、メガブレインを解き放ち、カミソリの刃を使用してカビの角をカットします。OCTの薄い層をチャックに分配します。その後、すぐにチャックの上にメガブレインを置きます。OCTが完全に凍結した後、メガブレインの側面の周りにOCTの2ミリメートル層を適用し、チャックに側面を実行することができます。カミソリの刃を使用して、チャックの側面と底部から余分なOCTを取り除きます。まず、クライオスタットのチャックヘッドにメガブレインを搭載したチャックを配置します。次に、クライオスタットを希望の厚さに設定します。組織の収集のために所望の脳領域に到達するために必要に応じてOCTと組織をトリミング.その後、ステージ上に置かれるまでアンチロールプレートを下げ、クライオスタットハンドルを回して単一のセクションを取ります。反ロールプレートをゆっくりと持ち上げ、組織部分が触れないように注意してください。塗料ブラシをそっと使って、平らに横たわるまで組織セクションを展開します。必要に応じて、ペイントブラシを使用してOCTフラットを保持し、ローリングを防ぎます。次に、スライドウォーマーからスライドを取り外し、スライドラベルをメガブレインセクションの上に下に置き、スライドに固執できるようにします。迅速に組織のセクションにPBSの滴を適用します。PBSに浸した細かい先端のペイントブラシを使用して、組織セクション内の気泡を磨き、スライド上に平らに横たわっているように組織を展開します。最後に、スライドウォーマーの上にスライドを置いて45分間乾燥させ、マイナス80°Cでスライドを保存します。このプロトコルでは、9匹の動物からの脳組織を準備し、同時に凍結切断した。凍結切除後、H&E染色を行い、凍結保護の品質を評価することができます。イオン化カルシウム結合アダプター分子1またはIba1ミクログリアの染色の代表的な結果は、各研究脳間の一貫した染色を単一のメガブレイン上で示す。この手順を試みる間、異常な組織の完全性につながる組織の割れや解凍を防ぐために、メガブレインを凍結しながら常に温度を監視することを忘れないでください。これは、染色中にグループ間の差異を作成し、イメージングと分析中にバイアスと主観性を減らすことができるので、別々のメガブレインで異なる治療群を分離することはお勧めしません。パラホルムアルデヒドを使用することは非常に危険であり、PBEを着用し、フードで作業するなどの予防措置は、常にこの手順を実行している間に取られるべきであることを忘れないでください。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

マウス脳の特定の領域におけるRNA発現プロファイリングには、正確で再現性のある組織採取戦略が必要です。ここでは、冠状断による脳切断と組織コーラーを用いたマイクロダイセクションの両方を併用するプロトコルについて説明します。得られたサンプルから抽出した全RNAの収量と品質により、本手法の有用性が確認されています。...

トータルRNAの単離およびダウンストリーム次世代シーケンシングと遺伝子発現プロファイリングのための離散マウスの脳領域のマイクロダイセクションのための非レーザーキャプチャー顕微鏡のアプローチ

我々は内側嗅内皮質（MEC）の背腹軸を維持する脳スライスからの調製および電気生理学的記録のための手順について説明します。場所の神経エンコーディングはMEC内の背腹軸の組織を次のようなので、これらの手順は、ナビゲーションやメモリのための重要な細胞メカニズムの調査を容易にします。...

げっ歯類の内側嗅内皮質の背腹軸機構の調査のための矢状スライスの作成

このビデオでは、ダウンストリーム分析のために凍結マウス脳組織切片を準備するための詳細なステップバイステップのプロトコルを示しています。...

ダウンストリーム解析のためのマウス脳の処理

このプロトコルは、全細胞パッチクランプ記録を実行するための基本的な処理手順を説明します。この技術は、神経細胞の電気的挙動の研究を可能にし、脳スライスに行ったときに、まだ比較的よく保存脳の回路に集積されているニューロンからの様々な神経機能の評価を可能にします。...

脳スライスにおける全細胞パッチクランプ記録

連続凍結切片を、単一のマウス骨格筋からの隣接領域を用いた遺伝子発現の測定のための組織学的応用およびRNAの濃縮を可能にするために収集されます。直接アプリケーション間で比較され、プールされた凍結切片と測定30mgの - 高品質のRNAが20から得られます。...

遺伝子発現と組織学的分析のためにシングルマウス骨格筋の連続領域の凍結切片化

ここでは、共焦点顕微鏡とライブ イメージング技術に適したマウス胚から electroporated...

Ex 子宮エレクトロポレーションと gaba 作動性介在ニューロンの移行のライブ イメージング用マウス萌芽期の脳の脊髄スライス培養

この手順は、安価で一般的に入手可能なツールを使用して高品質のタンパク質およびRNAを得るために離散的な凍結脳領域のコレクションを記述する。...

下流解析のための凍結げっ歯類の脳領域の収集

我々は、新鮮な脳組織からの離散領域のマウス脳除去および解剖のための実践的な、段階的、迅速なプロトコルを提示する。分子解析のために脳領域を取得することは、多くの神経科学研究室で日常的になっています。これらの脳領域は直ちに凍結され、システムレベルの解析のための高品質のトランスクリプトームデータが得られます。...

機能的および解剖学的に異なる領域へのマウス脳の微小解剖

本プロトコルは、統合された組織保存システムを用いた低侵襲アプローチによるげっ歯類の脳腫瘍の標準化された切除を記載する。この技術は、げっ歯類や他の動物モデルにおける標準治療を正確に反映するための意味を持ちます。...

高生存率組織採取のためのげっ歯類における低侵襲脳腫瘍切除術の実施

本プロトコルは、色素および凍結切片を用いてウイルス追跡を行う前に、脳定位固定装置注射座標の検証ステップを迅速化するための実際的な戦略を説明しています。...

クライオセクショニングによる脳定位固定装置注射座標の予備検証

現代の神経科学は、実験室の齧歯類や人間を含む多くの種の違いを探る必要があります。しかし、大きな脳を持つ哺乳類が関わると技術的な困難が生じます。このアプローチは、非常に異なる哺乳類における神経細胞集団の種間変異に対応し、進化的パターンを明らかにするための類似結果を生み出します。...

異なる哺乳類の脳における定量的細胞計数研究の比較アプローチ

学ぶ複数の齧歯動物の脳を同時に凍結・セクション化する手法。免疫組織化学の染色ばらつきを減らし、神経科学研究の再現性と効率性を向上させる革新的な組織処理プロトコルです。

複数の齧歯動物の頭脳の同時セクショニング

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