誘導と近親交配アリ、 Vollenhovia Emeryiを使用しての評価
2018年10月5日
このプロトコルでは、ant Vollenhovia emeryiの近親交配を実施し、これらの十字の成功を評価するためのメソッドを説明します。これらのプロトコルは、膜翅目の性決定システムの遺伝的基盤を理解することを目的とした実験のため重要です。
この方法は、性決定システムなどのハイメノプテラの分子生物学および遺伝的領域における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、遺伝的マッピングと分子状態に不可欠なアリボレンホビアエメリーの上に近親交配ラインを容易に誘導できることです。したがって、このミッションは、特定のアリの性決定システムに関する洞察を提供することができ、スズメバチなどの他のアリや他のヒメノプテラ種にも適用することができます。
プロトコルを開始するには、初夏の間にV.エメリのコロニーを収集します。収集した枝から、吸引器を使用して、ガラスカバー付きの人工石膏巣にアリの標本を移します。人工巣のコロニーを25°C、16〜8時間の明暗サイクルの下で維持する。
洗面ボトルを水道水に入れ、石膏を一日おきに一日おきに湿らせた状態に保ちます。次に、新しい生殖アリが出現するまで、1日おきに20マイクロリットルのチップを使用して、アルミニウム箔で包まれた乾燥したクリケットパウダーの約100マイクログラムと黒砂糖の水で満たされた先端をコロニーに追加します。畑からマイクロコロニーを収集し、新しい女王と男性を得るのに十分な食料を提供することが重要です。
まず、摂氏4度に設定された環境が15分間の部屋にコロニーを置くことによって、個人が移動するのを止めます。ステレオスコープの下で鉗子を使用して30個の作業アリの中足を取り除き、その後の近親交配十字架で生産された労働者からFゼロ世代を区別する。その後、交配十字架のための新しい小さな石膏の巣にアリを転送します。
次に、3~4匹の幼虫またはプーブを、作業員を含む石膏の巣に加えます。長い翼を持つ女王とオスを、交配十字架のために以前に準備された石膏の巣に移します。このステップでは、実験交差コロニーを通常のコロニーと同じ状態に維持することが重要である。
男性とメスを一緒に配置するだけで近親交配を誘導することは困難です。女王が翼を失い、卵を産むまで、食料と水を提供する16〜8時間の明るい暗いサイクルの下で25度のコロニーを保ちます。実験コロニーをステレオ顕微鏡で毎日確認してください。
F-1の子孫の間に近親交配の十字架を設定した後、卵はステレオスコープの下で観察することができる。F-oneクイーンが卵を産み始めた後、F-One世代とF-2世代が混合するのを防ぐために、巣からF-oneオスと幼虫またはプーブを取り除きます。F-2の子孫が出現するまで、コロニーを同じ条件で保ちます。
鉗子を使用してFゼロクイーンの片足を取り除きます。100マイクロリットルのチル剤を含む1.5ミリリットルマイクロチューブに脚を移します。ステレオスコープの下で鉗子を使用して超純水の300マイクロリットルで満たされたガラス皿の女性の腹部を解剖する。
交尾した男性の精子を含むスペルマティカを崩壊させる。スペルマティカの組織を剥がし、昆虫ピンを使用して女性の組織から精子を分離する。マイクロパイパッドを使用して、100マイクロリットルのチル剤を含む1.5ミリリットルマイクロチューブに精子を移す。
Fゼロクイーンと精子のサンプルを摂氏95度で20分間インキュベートします。フラッシュセントロはマイクロチューブを融合し、サンプルを摂氏4度で保存します。siv-mateF-oneクイーンによる卵の生産を確認した後、小屋の翼または1つの中足と遺伝子型を使用して女王のDNAを抽出する。
次に、片足をジェノタイピングしてF-One雄のDNAを抽出する。近親交配クロスからのオスアリの生殖能力を評価するために、鉗子を使用して400マイクロリットルのPBS溶液を含むガラス皿の内生殖器官を解剖する。その後、PBSを取り出し、マイクロパイパッドを使用して4%パラホルムアルジドに交換します。
PFAでサンプルを室温で40分間インキュベートして組織を固定します。固定後、マイクロパイパッドを使用して400マイクロリットルのPBSで組織を5回洗浄します。PBSで1ミリリットル当たり1ミリグラムにDAPI溶液を希釈.
PBSを取り除き、希釈したDAPI染色液を約300マイクロリットルを組織に加えます。暗い条件下で室温で15分間組織をインキュベートする。インキュベーションに続いて、400マイクロリットルのPBSで組織を5回洗浄し、鉗子を使用してガラススライドの中央に組織を移す。
次に、TRITCテトラメチルrhodaアミンを含む実装媒体に組織を取り付けます。最後に、20または60の3倍の対物レンズを使用して、共焦点レーザー走査顕微鏡でサンプルを観察します。ハプロイド男性対エメリの精巣の顕微鏡画像は、健康な線維組織を示さなかったディプロイド男性対エメリに存在しない健康な線維組織または精子を示す。
ディプロイド男性対エメリの男性生殖器官は精子を産生せず、精巣は発達せず、近親交配十字架で産生される男性は無菌であることを示唆している。その開発後、この技術は、私たちが速いタイミングアリ種のためにボレンホビアエメリで一定のセックスミカトニーを探求するための道を開きました。
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概要
本記事では、アリの一種であるVollenhovia emeryiにおける近親交配の誘導および評価のための詳細なプロトコルを提示し、アリの性決定に関する遺伝学的および分子生物学的研究を可能にします。本手法は、アンドロゲネティックなオスやメスの翅の多型など、V. emeryi固有の生物学的特性を利用することで、室内交配と表現型の同定を容易にするものです。
研究の主要構成要素
科学分野
- 遺伝学
- 分子生物学
- 昆虫学
- 生殖生物学
背景
- ミツバチの性決定メカニズムは十分に研究されていますが、アリのような他の膜翅目ではほとんど解明されていません。
- 複雑なライフサイクルや実験上の課題が、モデル生物ではない膜翅目分類群における遺伝学的研究の妨げとなっています。
- V. emeryiは、実験室での近交系作成や遺伝学的解析を簡便にする独自の生物学的特徴を備えています。
- アリの性決定を理解することは、膜翅目の遺伝学に対するより広範な知見を提供し得ます。
研究目的
- V. emeryiアリにおける近交弱勢を誘導するための信頼性の高いプロトコルを確立すること。
- アリの性決定に関する遺伝地図の作成および分子研究を促進すること。
- 近交交配による繁殖力および生殖結果を評価すること。
使用した手法
- 制御された条件下での人工巣におけるV. emeryiコロニーの収集および維持。
- 新しい女王およびオスの出現を促進するための給餌および飼育プロトコル。
- 脚の除去および制御交配を用いた、世代の物理的なマーキングと分離。
- ジェノタイピングのための女王およびオスからの解剖およびDNA抽出。
- 生殖能を評価するための、オスの生殖器官の解剖、固定、DAPI染色、および共焦点顕微鏡観察。
主な結果
- 実験室条件下におけるV. emeryiの近交系の導入に成功した。
- 野生下ではオスが季節的に生産されるのに対し、近交交配ではオスが継続的に生産された。
- 顕微鏡観察により、近交交配による二倍体オスは正常な精子を欠き、精巣が発達しており、不妊であることが明らかになった。
- 本プロトコールにより、生殖器官の発達に基づいて半数体オスと二倍体オスを明確に区別することが可能になる。
結論
- 本プロトコルは、V. emeryiをモデルとしてアリの性決定を研究するための堅牢な手法を提供する。
- 誘導近交系は、遺伝学的および分子生物学的解析において有用である。
- このアプローチは、他のアリや膜翅目種の性決定システムを探索するために応用可能である。
よくある質問
業界における重要性
Vollenhovia emeryiにおいて近交交配を誘導および評価することで、非モデル膜翅目種における正確な遺伝子マッピングと性決定経路のメカニズム解析が可能になります。この手法は、生殖生物学の遺伝的および分子的な決定要因を詳細に検討するための扱いやすい系を提供し、初期の発見に向けた取り組みを支援します。また、このアプローチはターゲット検証における予測の信頼性を高め、より広範な昆虫モデルに関連する性決定メカニズムのトランスレーショナルリサーチにおけるリスクを軽減します。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 管理された実験室環境において、性決定経路の遺伝学的解析を容易にする。
- 近交系化と表現型解析を通じて、候補遺伝子の機能的検証を可能にする。
- 半数体オスと二倍体オスの表現型を区別することで、メカニズム上のリスク低減をサポートする。
- 非モデル昆虫系における経路解明のためのモデルを提供する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 後続の遺伝学的および分子生物学的アッセイのための、再現性のある近交系を確立します。
- 翅の多型および生殖器官の解析を用いて、表現型の同定を標準化します。
- 共焦点顕微鏡観察とDAPI染色により、雄の妊孕性の定量的な評価を可能にします。
- 信頼性の高いスクリーニングワークフローに向けて、検証済みの生物学的材料を調製します。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- ラボでの知見をフィールドに関連する生殖表現型と整合させ、トランスレーショナルな連続性を確保します。
- 二倍体オスにおける不妊結果を確認することで、リスクを調整した遺伝的ターゲットの推進を支援します。
- 膜翅目種間での比較研究のためのプラットフォームを提供します。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、初期探索と前臨床遺伝学的検証の境界を統合するものであり、性決定メカニズムの仮説駆動型解析を可能にし、昆虫モデルシステムにおけるリード同定を支援します。
- 発見生物学：制御された近交系交配を通じて、性決定遺伝子の機能に関する帰無仮説検定を可能にする。
- スクリーニング：アッセイ開発および化合物評価のために、標準化され再現性のある表現型出力を提供する。
- 分析：顕微鏡観察およびジェノタイピングにより、雄の生殖能の定量的な読み取りと、遺伝子型と表現型の相関関係を提示する。
- トランスレーショナルリサーチ：研究室での遺伝学的知見と、フィールドに関連する生殖結果を橋渡しする。
- エンタープライズ再利用：より広範な遺伝学的研究に向けて、他の膜翅目モデルに適応可能な再利用可能なプロトコルを提供する。
運用および企業への影響
- 科学的価値：遺伝的ターゲット検証における予測信頼性を高め、性決定研究におけるメカニズムの曖昧さを軽減する。
- 運用的価値：近交系作成およびフェノタイピングのワークフローを標準化し、再現性と拡張性を確保する。
- 戦略的価値：遺伝的ターゲットに対するgo/no-go判断を改善し、初期段階の研究における資本効率を向上させる。
- ポートフォリオへの影響：リスク調整に基づいた遺伝的経路の優先順位付けを可能にし、種を超えたトランスレーショナルな取り組みを支援する。
実施上の検討事項
- アリのコロニー維持、解剖、および共焦点顕微鏡観察の専門知識が必要です。
- 制御環境チャンバーおよび分子生物学的なインフラストラクチャへのアクセスが必要です。
- 表現型および遺伝型評価において、チーム間での厳格な標準化が求められます。
- 他の種に適用する場合、交配および表現型解析プロトコルの最適化が必要になる場合があります。
- 制限事項として、種特有の生殖生物学および近交系における不妊の可能性が挙げられます。
