標的プラスミドDNA送達に対するメチオニン機能性生体適合性共重合体

カチオンポリマー薬物キャリアは、良好な安定性、低免疫原性、およびファシリティ調製および修飾の利点を有する。ここでは、その合成のための迅速かつ簡単な方法を提供します。可逆的な付加フラグメンテーション連鎖移動重合法は、制御された分子量および構造および担持官能基を有するブロックポリマーを降伏させるために適用可能な方法である。

これらの薬剤運搬船は、同時に癌、炎症、および他の疾患の協調治療を達成するために異なる薬物を運ぶことができます。IFT重合は古典的な方法であり、このプロトコルは遺伝子治療におけるその応用の例を示す。このポリマーの合成の成功の鍵は、正確に反応温度を制御することです。

水風呂よりもオイルバスを使用することをお勧めします。この手順を開始するには、ゴム栓と磁性攪拌機を用いたラウンドボトムフラスコを得て、重合ボトルとして使用します。重合ボトルの蒸留水1ミリリットルにビスヒドロキシHEMAの1.87グラムを溶解します。

5ミリリットルビーカーで、0.03グラムのCTPと0.02グラムのACVAを0.5ミリリットルの1、4-ジオキサンに溶解する。この混合物を重合ボトルに加えます。次いで、凝縮液トラップを用いて、溶液を重合ボトルに凍結する。

ボトルを鉄の支持体に固定し、針でつまずいた導管を使用して、反応混合物に窒素を真空し、注入します。次いで、重合ボトルを密封し、室温で溶液を30分間解凍した。このフリーズポンプ解凍サイクルを3回繰り返します。

この後、ボトルを摂氏70度のオイルバスに入れ、窒素雰囲気下で24時間反応させます。翌日、重合ボトルを摂氏0度で冷やし、ゴム栓を開けて重合反応を終了します。次に、マイナス20°Cの冷蔵庫で2時間予冷し、50対1の比で重合ボトル中の反応液と混合する。

この混合物を8、200回gで遠心分離し、アセトンを取り除き、沈殿物を回収した。合成したポリビスヒドロキシHEMAを精製するために、集めた沈殿物を2ミリリットルの純水に溶解する。次に、1~50の比率で100ミリリットルの予冷アセトンと混ぜます。

8、200回gで溶液を遠心分離し、沈殿物を回収した。この精製プロセスを繰り返して、沈殿物を溶解、混合、遠心分離します。まず、精製されたポリビスヒドロキシHEMAの0.96グラムと精製ポリビスヒドロキシHEMAの0.93グラムを10ミリリットルのビーカーに5ミリリットルの蒸留水で溶解します。

0.01グラムのACVAを0.5ミリリットルの4-ジオキサンに溶解し、これをAPMAおよびポリビスヒドロキシHEMA溶液に加えます。この混合物を重合ボトルに移し、乾燥窒素で1時間換気する。次いで、重合瓶を70°Cのオイルバスに入れ、窒素雰囲気下で24時間反応させた。

翌日、重合ボトルを摂氏0度で冷やし、ゴム栓を開けて重合プロセス溶液を終了します。まず、MCF-7細胞を6ウェルプレートのウェルに播種し、密度は20,000個の細胞をウェルあたり20,000個とします。加湿インキュベーターで細胞を摂氏37度で5%の二酸化炭素で12時間培養します。

この後、窒素対リン比の異なる比率のカチオン性ポリマーおよびpDNAポリプレックスポリプレックスを含む新鮮な培養培地と培地を置換する。細胞を6時間培養し、次いで培地を2ミリリットルの新鮮なRPMI 1640培地に置き換えた。48時間培養を続けます。

次いで、細胞を採取し、フローサイトメーターを用いて緑色蛍光を検出する。本研究では、可逆的付加断片化連鎖伝達法を介してメチオニン機能性生体適合性ブロックコポリマーを調製し、得られたmBGのプラスミドDNA錯体化能とそのトランスフェクション効率を調べた。mBG/pDNAポリプレックスの平均粒子径とゼータ電位は、それぞれ124ナノメートルとプラス15.7ミリボルトで、N対P比は16です。

電気泳動遅滞は、ゼロのN対P比を有するpDNAがアガロースゲルで拘束されずに動き、ゲルイメージャーでストライプとして観察されることを明らかにする。pDNAがmBGと複合化すると、pDNAの動きが遅くなり、その後、バンドの明るさが低下します。これは、N~Pが4より高い場合に、mBGがpDNAを完全に複雑にする可能性があることを示しています。

mBG/pDNAポリプレックスの細胞毒性は、標準的なMTTアッセイを用いて測定されるこれらの結果は、mBG/pDNAポリプレックスが4、8、16、および32のN-P比でPEI/pDNAポリプレックスよりも細胞毒性を有することを示している。また、見られるように、mBG/pDNAポリプレックスの細胞毒性は、N対P比の増加とともに増加する。この増加した細胞毒性は、正に帯電したGPMA成分の結果である。

pDNAトランスフェクション実験で使用されるN対P比は、細胞毒性結果に従って選択される。mBG1、mBG2、およびmBG3のトランスフェクション能力をGFP蛍光強度を測定して比較し、mBG3が最適な遺伝子キャリアであることを示した。シルト丸底フラスコから空気を排出し、反応温度を維持することが重要です。

得られたポリマー薬物担体は、薬剤耐性癌を相乗的に治療するために化学療法薬および遺伝子薬剤の共送に適用することができる。遺伝子薬と化学療法薬の組み合わせの分子機構は、薬剤耐性腫瘍の治療のためにさらに探求することができる。アセトンは、その急性毒性のために毒性が低いと評価されています。

キー、吸入、または目や皮膚との接触は避けるべきです。加熱手順中に、スケーリングのリスクを避けてください。