Name: 分離、固定およびマウス副腎の蛍光イメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-02T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: 学ぶマウス副腎の分離・固定および免疫蛍光染色法。組織形態を保持しながら多タンパク質解析と副腎帯状構造・細胞アイデンティティの研究に応用できます。

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我々 は彼の有用な提案およびこのプロトコルの確立でテクニカル サポートを博士モハマド ズバイルをありがちましょう。この作品は、国立糖尿病・消化器病・腎臓病、健康研究助成の国立機関 2R01-DK062027 (G.D.H) にによって支えられました。

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著者が明らかに何もありません。

このプロトコルでは、準備とともにマウス副腎の分離およびパラフィン包埋切片のマウス副腎の染色方法について説明します。
我々 がテストした他のプロトコルと比較して、この蛍光プロトコルは当研究室で使用される抗体の大部分に適して証明されています。しかし、特定のケースでそれは染色の結果を改善するためにいくつかの調整を必要があります。簡単に変更およびテストすることができます 1 つの変数は、固定の長さです。本研究室では、4% でインキュベーション PFA は異なります 1 h に 4 h 12-24 h16他の所で固定期間を延長中。私たちの手でただし、固定時間が長く増加バック グラウンド ノイズにつながった、日常的に私たちの研究で使用されるいくつかの抗体に最適でした。
抗原検索の pH も染色の成功の役割を果たすことができます。PH クエン酸 (pH 6)、エチレンジアミン四酢酸 (EDTA、pH 8) などの酸性、アルカリ性と同様に他の社内作られたバッファーからトリス EDTA と市販ソリ...

免疫組織化学は、共役抗体1を検出する後続の染色技術および特定の細胞分子に対する抗体を使って組織のコンポーネントを検出するための手法です。この免疫組織化学プロシージャは、特定の固定を必要とする、特定の抗原のため多くの場合経験的に決定される組織の処理、組織および抗体利用2。固定は、組織とそれによってそのまま携帯および細胞レベル下の構造と発現パターンを維持することの「オリジナル」の状態を維持するために重要です。さらに処理およびプロシージャの埋め込みは、薄切り免疫組織学的研究に使用される区分のために組織を準備する必要があります。
免疫染色は発色や蛍光検出を実行できます。発色検出には、水溶性の基質を不溶性の着色された製品に変換する酵素の利用が必要です。この酵素は、抗体 (一次抗体) の抗原を認識する共役することができます、(すなわち、二次抗体) の一次抗体を認識する抗体にはそれをより頻繁に活用します。この手法は非常に敏感です。あるの酵素反応から生じる色の製品は、イメージングのため明視野顕微鏡だけを必要とします。ただし、共存して、1 つの色の沈着は他の 1 つの沈着を隠すことができるので 2 つのタンパク質を視覚化しようとしたとき、発色染色は適切なできません。共同染色の場合蛍光がより有利であると証明しました。蛍光抗体法の出現はアルバート ・ クーンズと付いている蛍光抗体と組織抗原を識別し、紫外光3下の断面組織でそれらを表示するシステムを開発した同僚に起因します。蛍光は励起後の光を発する蛍光体と共役抗体に基づいています。(No か少しオーバー ラップ) と異なる波長での排出量といくつか fluorophores が存在するため、この検出方法は複数のタンパク質の研究に最適です。
副腎は腎臓の上にあるし、間葉系の被膜に囲まれた 2 つの発生のコンポーネントによって特徴付けられる一対の臓器です。内側の髄質は、神経堤に由来はドーパミン、ノルアドレナリン、アドレナリンなどのカテコールアミンを作り出す間、雌雄の中間中胚葉由来、外の副腎皮質はステロイド ホルモンを分泌します。副腎皮質は, 組織学的および機能的で分けられる各ゾーンの異なるクラスのステロイド ホルモンを分泌、3 つの同心円ゾーン: 外側球状 (zG) 生成ミネラルコルチコイド電解質の恒常性を調節して血管内ボリューム中間ゾナ副腎皮質 (zF)、直接、zG 下を; 血糖を増加するエネルギー店の動員を介してストレス反応を仲介するグルココルチコイドを分泌します。内部網状 (zR) を合成するセックス ステロイド前駆体 (すなわち,デヒドロエピアンドロステロン (DHEAS))4。
種間副腎皮質帯状のいくつかのバリエーションがある: 例えば、ハツカネズミは、zR を欠いています。M. 毛様体筋のユニークな生後 X ゾーンは、好酸性細胞質5小さな脂質に乏しい細胞によって特徴付けられる胎児の大脳皮質の残骸です。X ゾーンは思春期の雄マウスと妊娠の最初のメスのマウスの後に消えるかない繁殖雌6,7で徐々 に退化。また、蛇行と zG 展示物の厚さは、末梢幹・前駆細胞の組織が、zG に隣接すると種の間の変化をマークしました。他の齧歯類とは異なり、ラットは zG と zF の間目に見える未分化ゾーン (zU) 幹細胞ゾーンおよび/または一時的な前駆細胞の増幅のゾーンとして機能します。ZU はラットに固有またはより単に目立つように組織的な細胞群かどうかは不明な8,9です。
副腎皮質の細胞には、すべてのステロイド ホルモン10,11の前駆体としてコレステロールエステルを格納する脂肪滴が含まれています。 「妊」という用語は、コレステロールを介して一連のステロイド産生因子 1 (SF1) 式はステロイド ホルモン産生の潜在的なマーカー活動を含む酵素反応からのステロイド ホルモン生産プロセスを定義します。副腎、Sf1 式は12の皮質の細胞にのみ存在です。興味深い研究は、副腎皮質ステロイド ホルモン産生の潜在的な13セルにおける内因性ビオチンの式を発見しました。この特性をステロイド産生を区別するためにも用いることができるこれがビオチンとストレプトアビジンに基づく染色法、内因性ビオチンとストレプトアビジン、抱合抗体による検出のための高い背景の原因になります。他のと内にある、副腎、すなわち、内皮細胞、莢膜、髄質細胞の集団からの細胞。
交感神経節前ニューロンによって支配されている、副腎髄質は、エピネフリンとノルエピネフリンを含む粒状の細胞質で好塩基性細胞によって特徴付けられます。髄質細胞酸化14後茶色の色素を形成するカテコールアミン含有量が高いため「髄質」と呼びます。チロシンヒドロキシラーゼ (TH) は、カテコールアミンの合成、および副腎の律速段階を触媒する、延髄15でのみ表される酵素です。
ここでマウス副腎、パラフィンと区分、および蛍光抗体法を構成する細胞の種類を識別するために副腎のセクションに染色を実行するメソッド内に埋め込むための処理の隔離のためのプロトコルを提案する、副腎皮質と髄質。このプロトコルは、定期的に本研究で使用される複数の抗体を用いた免疫染色の研究室で標準です。

<table><tbody><tr><td>24ウェル細胞培養プレート</td><td>Nest Biotechnology Co.</td><td>0412B</td><td></td></tr><tr><td>使い捨て針 25 G x 5/8インチ</td> <td>Exel International</td><td>26403</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>パラプラストプラス&nbsp;</td><td>マコーミック科学</td><td>39502004</td><td>組織包埋用パラフィン</td></tr><tr><td>シャンドン生検カセットII 蓋付き</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td></td><td>組織処理用1001097カセット</td></tr><tr><td>ハイプロファイル ミクロトームブレード</td><td>Accu-Edge</td><td>4685</td><td>使い捨てステンレス製ブレード</td></tr><tr><td>ピール・ア・ウェイ 使い捨てプラスチック組織包埋金型</td><td>Polysciences Inc.</td><td>18986</td><td>切り捨てられた、22 mm四方の上部が12 mmの下部に先細りに</td></tr><tr><td>スーパーフロストプラス顕微鏡スライド</td><td>フィッシャーブランド</td><td>12-550-15</td><td>75 mm x 25 mm x 1 mm</td></tr><tr><td>キシレン</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>X5P1GAL&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>200プルーフエタノール</td><td>デコンラボ株式会社</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Certi-Pad ガーゼパッド&nbsp;</td><td>Certified Safety Mfg, Inc</td><td>231-210</td><td>3インチ x 3.滅菌ラテックスフリーガーゼパッドMOM</td></tr><tr><td>キット&nbsp;</td><td>ベクターラボ</td><td>BMK-2202</td><td>マウス組織上のマウス一次抗体の検出用</td></tr><tr><td>KimWipes</td><td>Kimtech</td><td>34155</td><td>Wipes 4.4 inch x 8.4 inch</td></tr><tr><td>Super PAP PEN</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>00-8899</td><td>スライドに描くペン</td></tr><tr><td>顕微鏡カバーガラス&nbsp;</td><td>フィッシャーブランド</td><td>12-544-D</td><td>サイズ:22 x 50 x 1.5</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>シグマ</td><td>D9542&nbsp;</td><td>(20 mg / mLストックで調製)</td></tr><tr><td>ProLong Gold 退色防止試薬</td><td>Molecular Probes</td><td>P36930</td><td>免疫蛍光用封入剤</td></tr><tr><td>X-cite シリーズ 120Q</td><td>Lumen Dynamics</td><td></td><td>光源</td></tr><tr><td>Coolsnap Myo</td><td>Photometrics</td><td></td><td>Camera</td></tr><tr><td>Optiphot-2&nbsp;</td><td>ニコン</td><td></td><td>顕微鏡</td></tr><tr><td>ミクロトーム</td><td>American Optical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tissue embedder</td><td>Leica</td><td>EG1150 H&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ティッシュプロセッサー&nbsp;</td><td>ライカ</td><td>ASP300S</td><td></td></tr><tr><td>正常ヤギ血清</td><td>Sigma</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>マウス 抗TH</td><td>ミリポア</td><td>MAB318</td><td>一次抗体</td></tr><tr><td>ウサギ 抗SF1</td><td>Ab プロテインテックグループ (PTGlabs)</td><td>&nbsp;オーダーメイド</td><td>の一次抗体</td></tr><tr><td>Alexa-488 Mouse IgG&nbsp; 飼育ヤギ</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-545-003&nbsp;</td><td>二次抗体</td></tr><tr><td>Dylight-549 Rabbit IgG raised goat</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-505-003</td><td>二次抗体</td></tr><tr><td>クエン酸無水</td><td>Fisher Chemical</td><td>A940-500</td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements 基礎研究&nbsp;</td><td>ニコン</td><td></td><td>イメージングソフトウェア</td></tr></tbody></table>

分離、固定およびマウス副腎の蛍光イメージング

Isolation, Fixation, and Immunofluorescence Imaging of Mouse Adrenal Glands

蛍光抗体法蛍光色素標識された抗体の雇用組織抗原の検出のための確立された技術、アプリケーションの広範なスペクトルです。抗原の検出は、複数の細胞のタイプの特性と同定のためことができます。副腎腺は発生学的起源の異なる 2 つの異なる組織、腎中間中胚葉由来外側皮質と神経によって構成する内分泌器官、腎臓の上に位置し、間葉系細胞の層でカプセル化された、家紋由来髄質。副腎髄質カテコラミン (アドレナリン、ノルアドレナリン) を生成するのに対し、副腎皮質ステロイド (すなわちミネラルコルチコイド、糖質コルチコイド、性ホルモン) が分泌されます。副腎研究を行いながら、異なる機能を持ったユニークな細胞を区別することが重要です。ここでプロトコルを提供副腎の細胞の種類を特徴付けるため蛍光抗体法の取得に必要な一連のステップのシリーズを説明する私たちの研究室で開発されました。まず、固定、処理およびパラフィン包埋組織の periadrenal 脂肪の微視的除去マウス副腎の解剖に着目します。回転式ミクロトームのティッシュのブロックの区分を述べる。最後に、私たちは最適な信号を達成するために非特異抗体の結合と蛍光の両方を最小限に抑えることを開発した副腎の蛍光汚損のためのプロトコルを詳しく説明します。

図 1は、上記で説明したプロトコル全体の概略を表します。副腎はマウスから収穫される、解剖顕微鏡の下で隣接する脂肪組織が削除され、副腎は 4% で固定し、PFA。この手順の後副腎、処理されますと、パラフィンに埋め込まれた臓器を顕微鏡スライド上に堆積薄いスライスにカットするミクロトームの断面します。セクションの乾燥後蛍光抗体法が行われ、顕微鏡でのセクションが作成されます。
隣接する脂肪 (図 2A) の除去は、さらなる処理と副腎の断面を促進するため重要です。周囲の脂肪組織の成功の除去は、図 2B副腎は容易に検出、余分な脂肪が表示されていないに表示されます。重要ですこの手順中に、ただし、副腎を乾燥またはこれを聞かせ...

マウス副腎の分離、組織を修正、セクション、それらを免疫蛍光染色を実行する方法をご紹介します。

Immunofluorescence is a well-established technique for detection of antigens in tissues with the employment of fluorochrome-conjugated antibodies and has ...

免疫蛍光は、副腎帯状の帯状疱疹、細胞の同一性および機能に関する副腎分野の重要な質問に答える助けとなる基本的な方法です。この技術の主な利点は、副腎組織の形態を維持しながら、複数のタンパク質の研究を可能にすることです。マウス副腎を取り除くために、周囲の脂肪組織の周りに切断し、氷の上に新鮮なPBSを含む24マルチウェルプレートの1つの井戸に腺を置きます。解剖顕微鏡下でペトリ皿またはガラスのサポートに腺を移し、隣接する脂肪組織を取り除くために2本の25ゲージ針を使用する。すべての脂肪が取り除かれたら、4%パラホルムアルデヒドで4%パラホルムアルデヒドを摂氏4度で2時間揺らげます。インキュベーションの終わりに、1回の洗浄につき新鮮なPBSの1〜2ミリリットルで摂氏4度で3回の15分の洗浄で腺をすすぐ。最後の洗浄後、4°Cの2つの連続したエタノール浸漬で腺を脱水し、インキュベーションごとに2時間揺れます。副腎組織を処理用に準備するには、腺をガーゼで包み、副腎を組織埋め込みカセットに囲みます。次に、カセットを処理するまで摂氏4度の貯蔵のために70%エタノールで満たされた瓶に入れます。組織を処理するには、カセットをテーブルに示されているように処理するために、組織処理装置に挿入する。プログラムの最後に、溶融した65度のパラフィンを充填した埋め込みステーションにカセットを移し、一対の鉗子を使用してガーゼをアンラップします。埋め込み型の基部の中心に適した位置に副腎を穏やかに移し、溶かしたパラフィンを腺に注ぎます。次に、パラフィンの硬化を容易にするために、埋め込み型を冷却トレイに慎重に移動します。回転式ミクロトームで切り離す前に、一連の顕微鏡スライドにラベルを付け、37°Cスライドウォーマーの上にスライドを置きます。オートクレーブタイプ1の超純水を約450マイクロリットルずつスライドに分配し、マイクロトームの断面切断厚を5マイクロメートルに設定します。埋め込まれた組織を切断ブロックにロードし、サンプルがマイクロトームブレードの端に面するまでパラフィンブロックを下げます。安定したリズムでハンドホイールを回転させ、最初のトリミングを行ってパラフィンを除去し、副腎組織を露出させます。次に、鉗子を使用して副腎の端を通る5マイクロメートルの切片を獲得し、各セクションを収集される前にラベル付けされたスライドの1つに水滴に移す。顕微鏡で切片に組織が存在することを確認した後、ホットプレートのスライドを約2時間乾燥させ、水が見えなくなるまで37°Cのスライドトレイで少なくとも一晩焼きます。乾いたら、スライドを室温でスライドボックスに保管します。免疫蛍光抗原検索の場合、スライドを2つの5分間100%キシレン浸漬で脱パラフィン化し、続いて降順エタノールおよび水浸性系列で再水和します。水浸漬後、スライドを金属製のスライドホルダーに移し、ホールダーを沸騰0.01モルクエン酸のビーカーに10分間置きます。インキュベーションの最後に、ホットプレートからビーカーを取り出し、20分間冷却させ、すべての副腎セクションがまだ緩衝液で覆われているように注意してください。ビーカーが冷却されたら、スライドをコプリン瓶に移し、穏やかなロッキングで新鮮なPBSで10分間の3回のスケをします。最後の洗浄後、各スライドの表面を組織の切片を損傷することなく慎重に拭き取り、疎水性マーカーを使用して各セクションの周りに円を作ります。スライドを加湿したチャンバーに入れ、少なくとも50マイクロリットルのブロッキング溶液を各セクションに素早く加え、室温で1時間のインキュベーションを行います。ブロッキングインキュベーションの最後に、スライドを新鮮なPBSで1回5分間ロッキングで洗浄し、スライドをチャンバーに戻します。次に、摂氏4度で一晩インキュベーションするために、各セクションに関心のある一次抗体カクテルを追加します。翌朝、1回の洗浄ごとに新鮮なPBSで3回の15分間の洗浄でサンプルを洗浄し、適切な二次抗体溶液でスライドに光から保護された1時間のラベルを付けます。インキュベーションの最後に、光から保護されたロッカーに3回の15分間の洗浄でサンプルを洗浄し、最後の洗浄後に光から保護された室温で7分間DAPIでセクションの核を標識します。3つの5分間のPBSを揺らして3回のPBSの後、サンプルごとに1つのカバーガラスの表面に沿って免疫蛍光に適した60マイクロリットルの取り付け剤を加え、各スライド組織セクションをカバーガラスの上に軽く押し下げ、泡を避けるように注意します。次いで、各スライドを暗い容器に平らにして、イメージングの前に少なくとも24時間室温で硬化させる。脂肪除去プロセス中に, 脱水が組織構造を損傷する可能性がありますので、副腎を乾燥させないことは重要です.周囲の脂肪組織の除去に成功した後、副腎は余分な目に見える脂肪なしで容易に検出可能であるべきです。実証された副腎切片の免疫染色は、副腎皮質細胞の核ステロイド発生因子1染色、髄質細胞のチロシンヒドロキシラーゼ染色、外嚢の非ステロイド性細胞の核のDAPI染色、および副腎皮質および髄質細胞との共染色を明らかにする。この手順を試みる場合、マウス副腎は小さく、その位置は多少可変であり、検出が困難であることを覚えておくことが重要です。したがって、解剖中にエリアの明確なビューを持つことは重要です。これらの手順は、生体内の副腎の研究のための基本的な技術です。これらに従って、免疫染色の追加の方法は、特定の科学的ニーズを満たすために行うことができる。その開発後、免疫染色は、生物医学分野の研究者が、多くの分野や分野で有用なツールであるその場でタンパク質発現を探求する道を開きました。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

副腎髄質クロマフィン細胞培養システムは、in...

マウス副腎髄質クロマフィン細胞分離

このビデオでは、同じ宿主種由来の一次抗体を用いてマルチプレックス免疫染色を行うアッセイを実演しています。この方法では、副腎組織切片が2段階の免疫染色プロセスを経ます。最初に、切片を皮質のマーカーに特異的な抗体で染色し、続いて結合した抗体を剥がし、髄質のマーカーに特異的な抗体で再染色します。...

同一宿主種由来の一次抗体を用いたマルチプレックス免疫染色法

成体マウスのリンパ節における120μmの深さまでの造影による高解像度の生体内イメージングは​​、空間的に多重焦点二光子顕微鏡の励磁パターンを調節することによって達成される。 100μmの深さでは、このように散乱や回折限界を回避し、（横）487 nmおよび551 nmの（軸方向）の解像度を測定した。...

胚中心の高解像度生体内ストライプ照明顕微鏡

エキソサイトーシスの後、融合した原形質膜はエンドサイトーシスとして知られるプロセスを通じて回収されます。このメカニズムは、次の放出ラウンドのために新しいシナプス小胞を再構築します。個々のエンドサイトーシスイベントは、マウス副腎クロム親和性細胞の細胞付着容量記録を使用して捕捉および分析されます。...

マウス副腎クロマフィン細胞における細胞 - 添付容量測定のための方法

この資料に記載されている間接免疫プロトコルは、検出およびマウス乳腺中のタンパク質の局在を可能にします。完全な方法は、乳腺のサンプルを調製するために蛍光顕微鏡により画像を、組織切片の免疫組織化学を実行し、画像を再構成するために与えられています。...

マウス乳腺の凍結切片の間接免疫

我々は、マウスウォルフ管（WD）の単離および培養のための方法を提示します。また、蛍光タグ付けされた抗体を用いて培養/単離されたばかりのWDSのホールマウント免疫染色のための詳細な手順を示しています。一緒に、これらの技術は、WDの開発、コイリング、および分化の研究を可能にします。...

器官培養とマウスウォルフダクトの全マウント免疫蛍光染色

下垂体腺の解剖し、マウスを開発から下垂体のコロナ...

郭清とコロナのスライス標本マウス下垂体腺の開発

同じ宿主種からの一次抗体を用いた多重免疫染色に対して、いくつかの異なる方法が確立されている。ここでは、ホルマリン固定パラフィン組み込みマウス副腎切片でのマルチプレックス免疫染色中の抗体クロス反応性を遮断するためのマイクロ波媒介抗体ストリッピングおよびフルオロフォア・チラミドの使用について説明する。...

マウス副腎のマルチプレックス免疫染色のためのマイクロウェーブおよび蛍光色素-Tyramide - 同じ宿主種からの非共役一次抗体を使用

このプロトコルは、ウシ副腎クロマフィン細胞における3つの融合モードを検出するための共焦点イメージング技術を記述する。これらの融合モードには、1)融合孔の開閉を伴う近接融着(キスアンドランとも呼ばれる)、2)融合孔の開口および開放された細孔の維持を伴うステイ融合、および3)融合小胞収縮を伴う収縮融合が含まれる。...

副腎クロマフィン細胞における融合細孔ダイナミクスの3つのモードを測定するための共焦点顕微鏡

このプロトコルは、酵素解離および蛍光活性化細胞ソーティングによるトゲマウス(Acomys)からの骨格筋および心筋線維脂肪形成前駆細胞(FAP)の単離を概説しています。このプロトコルから得られたFAPは、筋線維芽細胞および脂肪細胞に効果的に拡大および分化させることができます。...

とげマウスモデルからの線維脂肪形成前駆細胞の単離、拡大、および分化

マウス副腎皮質に対して、ゾナ・グロメルローサおよびゾナ・ファシキュラータ富む細胞の2次元一次培養を確立するための堅牢かつ再現性の高いアプローチが開発されました。このシステムは各ゾーンの主要な分子および機能的特徴を保存し、シグナル伝達経路、ホルモン産生、副腎皮質細胞の行動をアウト...

マウス副腎皮質からのゾーン強化一次培養の確立

学ぶマウス副腎の分離・固定および免疫蛍光染色法。組織形態を保持しながら多タンパク質解析と副腎帯状構造・細胞アイデンティティの研究に応用できます。

分離、固定およびマウス副腎の蛍光イメージング

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