分離、固定およびマウス副腎の蛍光イメージング

免疫蛍光は、副腎帯状の帯状疱疹、細胞の同一性および機能に関する副腎分野の重要な質問に答える助けとなる基本的な方法です。この技術の主な利点は、副腎組織の形態を維持しながら、複数のタンパク質の研究を可能にすることです。マウス副腎を取り除くために、周囲の脂肪組織の周りに切断し、氷の上に新鮮なPBSを含む24マルチウェルプレートの1つの井戸に腺を置きます。

解剖顕微鏡下でペトリ皿またはガラスのサポートに腺を移し、隣接する脂肪組織を取り除くために2本の25ゲージ針を使用する。すべての脂肪が取り除かれたら、4%パラホルムアルデヒドで4%パラホルムアルデヒドを摂氏4度で2時間揺らげます。インキュベーションの終わりに、1回の洗浄につき新鮮なPBSの1〜2ミリリットルで摂氏4度で3回の15分の洗浄で腺をすすぐ。

最後の洗浄後、4°Cの2つの連続したエタノール浸漬で腺を脱水し、インキュベーションごとに2時間揺れます。副腎組織を処理用に準備するには、腺をガーゼで包み、副腎を組織埋め込みカセットに囲みます。次に、カセットを処理するまで摂氏4度の貯蔵のために70%エタノールで満たされた瓶に入れます。

組織を処理するには、カセットをテーブルに示されているように処理するために、組織処理装置に挿入する。プログラムの最後に、溶融した65度のパラフィンを充填した埋め込みステーションにカセットを移し、一対の鉗子を使用してガーゼをアンラップします。埋め込み型の基部の中心に適した位置に副腎を穏やかに移し、溶かしたパラフィンを腺に注ぎます。

次に、パラフィンの硬化を容易にするために、埋め込み型を冷却トレイに慎重に移動します。回転式ミクロトームで切り離す前に、一連の顕微鏡スライドにラベルを付け、37°Cスライドウォーマーの上にスライドを置きます。オートクレーブタイプ1の超純水を約450マイクロリットルずつスライドに分配し、マイクロトームの断面切断厚を5マイクロメートルに設定します。

埋め込まれた組織を切断ブロックにロードし、サンプルがマイクロトームブレードの端に面するまでパラフィンブロックを下げます。安定したリズムでハンドホイールを回転させ、最初のトリミングを行ってパラフィンを除去し、副腎組織を露出させます。次に、鉗子を使用して副腎の端を通る5マイクロメートルの切片を獲得し、各セクションを収集される前にラベル付けされたスライドの1つに水滴に移す。

顕微鏡で切片に組織が存在することを確認した後、ホットプレートのスライドを約2時間乾燥させ、水が見えなくなるまで37°Cのスライドトレイで少なくとも一晩焼きます。乾いたら、スライドを室温でスライドボックスに保管します。免疫蛍光抗原検索の場合、スライドを2つの5分間100%キシレン浸漬で脱パラフィン化し、続いて降順エタノールおよび水浸性系列で再水和します。

水浸漬後、スライドを金属製のスライドホルダーに移し、ホールダーを沸騰0.01モルクエン酸のビーカーに10分間置きます。インキュベーションの最後に、ホットプレートからビーカーを取り出し、20分間冷却させ、すべての副腎セクションがまだ緩衝液で覆われているように注意してください。ビーカーが冷却されたら、スライドをコプリン瓶に移し、穏やかなロッキングで新鮮なPBSで10分間の3回のスケをします。

最後の洗浄後、各スライドの表面を組織の切片を損傷することなく慎重に拭き取り、疎水性マーカーを使用して各セクションの周りに円を作ります。スライドを加湿したチャンバーに入れ、少なくとも50マイクロリットルのブロッキング溶液を各セクションに素早く加え、室温で1時間のインキュベーションを行います。ブロッキングインキュベーションの最後に、スライドを新鮮なPBSで1回5分間ロッキングで洗浄し、スライドをチャンバーに戻します。

次に、摂氏4度で一晩インキュベーションするために、各セクションに関心のある一次抗体カクテルを追加します。翌朝、1回の洗浄ごとに新鮮なPBSで3回の15分間の洗浄でサンプルを洗浄し、適切な二次抗体溶液でスライドに光から保護された1時間のラベルを付けます。インキュベーションの最後に、光から保護されたロッカーに3回の15分間の洗浄でサンプルを洗浄し、最後の洗浄後に光から保護された室温で7分間DAPIでセクションの核を標識します。

3つの5分間のPBSを揺らして3回のPBSの後、サンプルごとに1つのカバーガラスの表面に沿って免疫蛍光に適した60マイクロリットルの取り付け剤を加え、各スライド組織セクションをカバーガラスの上に軽く押し下げ、泡を避けるように注意します。次いで、各スライドを暗い容器に平らにして、イメージングの前に少なくとも24時間室温で硬化させる。脂肪除去プロセス中に, 脱水が組織構造を損傷する可能性がありますので、副腎を乾燥させないことは重要です.

周囲の脂肪組織の除去に成功した後、副腎は余分な目に見える脂肪なしで容易に検出可能であるべきです。実証された副腎切片の免疫染色は、副腎皮質細胞の核ステロイド発生因子1染色、髄質細胞のチロシンヒドロキシラーゼ染色、外嚢の非ステロイド性細胞の核のDAPI染色、および副腎皮質および髄質細胞との共染色を明らかにする。この手順を試みる場合、マウス副腎は小さく、その位置は多少可変であり、検出が困難であることを覚えておくことが重要です。

したがって、解剖中にエリアの明確なビューを持つことは重要です。これらの手順は、生体内の副腎の研究のための基本的な技術です。これらに従って、免疫染色の追加の方法は、特定の科学的ニーズを満たすために行うことができる。

その開発後、免疫染色は、生物医学分野の研究者が、多くの分野や分野で有用なツールであるその場でタンパク質発現を探求する道を開きました。