Name: 属磁性の走磁性細菌の成長: MSR 1、AMB 1 MS 1 株 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: 学ぶ、Magnetospirillum属の磁性細菌MSR-1、AMB-1、MS-1株の液体・半固体培地での培養法。酸素濃度制御と無菌操作の最適化により、再現性のある研究が可能となる。

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電子顕微鏡施設 (マクマスター大学、訓練およびアクセス用 MTB 文化、アダム P. ヒッチコックとマクマスター大学で MTB 文化を設定中応援筱慧朱マルシア リードと彼の助けありがとうリチャード b. フランケル健康科学部)。この作品は、自然科学と工学研究会のカナダ (レベル) と米国立科学財団によって支えられました。

1. N2局設置
注: は、最小リークでガソリン タンクに接続することができます、1 mL プラスチック注射器のシリンダーがこのチューブにしっかりと収まるように、チューブの内径を選択します。給油完了 N2の図は、図 1で提供されます。
<ol><li>N2駅 (約 50 cm の長さ) を設定する十分なスペースがベンチの近くに N2ガスのタンクを安全にインストールします。</li>
	<li>タンクに駅が建設される領域に到達する十分な長さにチューブの部分を接続します。必要に応じて、任意の漏れを避けるためにタンクの出力にテフロン テープを適用します。</li>
	<li>同時に駅中のバブルの 5 本の対応を構築するための長さ約 5 cm のチューブの 4 つの部分をカットします。</li>
	<li>3 3 ウェイ T 形プラスチック継手とラインのチューブの部分を組み立てます。余分な T 字継ぎ手を介して N2タンクの出力でのチューブの部分にこの線の一方の端を接続します。もう一方の端で 90 ° エルボを追加します。</li>
	<li>構造を水平金属棒にアタッチする使用テープには、ベンチの上のおよそ 30 cm が配置されます。</li>
	<li>手順 1.4 のインストール付属品の無料出力するため (長さ約 20 cm) にチューブの 5 個を接続します。</li>
	<li>5 1.0 mL プラスチック注射器からピストンを外し、これらの注射器の大きい方の端をカット (すなわち。、反対側に針)、卒業の部分だけを維持します。余りに堅く、綿とこれらの注射器を入力します。</li>
	<li>チューブの 20 cm の縦に長い部分に注射器を挿入し、石鹸水を使用して N2を流れるときに漏れがないことを確認します。</li>
	<li>5 25 G 針 (0.5 mm × 25 mm) のキャップを取り外し、これらの針を細いチューブの 10 cm の部分に挿入します。針がしっかりとチューブに収まることを確認します。 注意: この手順中に刺しの危険性があります。ゆっくりと慎重にそれを行います。</li>
	<li>N2駅の注射器に準備手順 1.9 で針を取り付けます。N2は、すべて 5 つのラインを流れることを確認し、スタンドでのステーションを維持します。</li>
</ol>2. 成長培地の準備
注: それは 2.1.2、2.2.2 と 2.3.8 の手順で説明したように、調製した培地の量を調整することが可能です。水や化学薬品の量は、比例して調整するだけのニーズを使用しました。すべての培地成分の役割は、補足表 1で説明されます。
<ol><li>MSR - 1 液体の成長媒体の作製<ol>
<li>● クエン酸鉄の 0.245 g を 100 mL の脱イオン蒸留水に追加することによって 10 mM クエン酸第二鉄溶液を調製します。熱し、黄色のオレンジ色の明確な解が得られるまで溶解する攪拌します。オートクレーブの標準を使用して、ソリューション (121 ° C で少なくとも 15 分の露出) のサイクルし、暗闇の中で室温でこの原液を保存します。 注: は、沈殿物が明らかになるとき鉄のクエン酸液を捨てください。</li>
		<li>ビーカーに攪拌しながら順に以下の追加脱イオン蒸留水 1 L を含む: 1.0 mL の微量ミネラルを補うソリューション、KH2PO40.1 g、MgSO4.7 H2O の 0.15 g、HEPES、2.38 g ナノ3 0.34 g、0.1 グラム酵母抽出物、大豆豆ペプトン 3.0 g 4.35 mL 乳酸カリウム (60%/w 溶液) と 10 ミリメートル fe (iii) クエン酸原液 5 mL。 注: 小さい成長培地量が必要な場合それに比例して量を調整します。このプロトコルの手順 1 でビルドされるなど、同時にバブル 5 本ことができる N2駅の中の 300 mL を準備します。 警告: トレース鉱物と fe (iii) クエン酸在庫ソリューションを滅菌しておく必要があります。汚染を避けるためには、それら (火炎瓶ブンゼン バーナーを使用してのオープン トップ) を使用する場合、標準的な滅菌方法を使用し、調剤の滅菌ピペット チップを使用します。4 ° C で冷蔵庫にミネラル溶液を保存します。</li>
		<li>すべての化学薬品の添加後、1 M NaOH 水溶液で 7.0 に pH を調整します。125 mL の血清ボトルに作りたての媒体を調剤します。各ボトルの中の 60 mL を注ぐ。</li>
		<li>バブル N2溶存 O2を削除する 30 分の中に、小さなチューブを使用して手順 1 で記載されている N2駅に接続されています。各ボトルは、ボトルを終了する過剰なガスを許可するように小さな開口部を残して上にブチル ゴム栓を置きます。 注意: N2をバブリングしながら泡を形作るかもしれない。泡の生産を避けるためにガスの流れを調整します。</li>
		<li>圧着シール準備ストッパーとアルミ シール各ボトルです。アルミのシールによりボトルがプロトコルの残りの間に密封されたまま。</li>
		<li>N2駅から針と細いチューブを外し、清潔な針 (1 インチ、≤ 23 G) に置き換えます。ガスの穏やかな連続流れ終了 (約 50 mL/分) タンク N2タンクのバルブを調整します。 注意: 針 23 G より大きいストッパーの永久的な unsealable の穴になります。</li>
		<li>ゴム栓を介して、培地の瓶の中に N2タンクに接続されている針のいずれかを挿入します。すぐに同じボトルに別のきれいな針を挿入します。その他のボトルにこの手順を繰り返し、N2でボトル内の空気を交換する約 30 分の N2を流します。</li>
		<li>対応する針を削除することによって、N2駅からボトル 1 本を外します。培地のボトル内の圧力が大気圧に減るまで、数秒間待つし、2 つ目の針を抜きます。すべての残りのボトルのためには、この手順を繰り返します。 注意: O2を防ぐため、2.1.4 のステップの後成長培地のボトルを再入力してから、立て続けに 2.1.8 2.1.4 - の手順に従います。すべてのボトルは、同時に N2駅に接続することはできない場合、は、ボトルの最初のセットの手順 2.1.4-2.1.8 続行し、残りのボトルにこれらの手順を繰り返します。</li>
		<li>オートクレーブ ボトル。一晩室温にクールにさせて、その後室温で保管します。</li>
	</ol></li>
	<li>AMB 1、MS 1 液体の成長媒体の作製<ol>
<li>10 mM 鉄キナ酸溶液を調製します。最初脱イオン蒸留水 100 mL にキナ酸 0.19 g を溶解した FeCl3.6H2O. 攪拌溶解、暗い赤、明確な解決策が得られるまでに 0.27 g を追加します。オートクレーブ (121 ° C で少なくとも 15 分の露出) の標準的なサイクルを使用して、ソリューション。 注: は、ストック溶液を滅菌として暗闇の中で部屋の温度を鉄系ソリューションを格納します。沈殿物が明らかになる場合は、ソリューションを破棄します。</li>
		<li>ビーカーに攪拌しながら順に以下の追加脱イオン蒸留水 1 L を含む: 10.0 mL のビタミン サプリメント溶液、トレース ミネラルのサプリメント溶液、KH2PO4、コハク酸ナトリウム二塩基の 0.848 g 0.68 g 5.0 mL六水和物、ナトリウム ・酒石酸二水和物、0.45 mL 0.1% の酢酸ナトリウム三水和物の 0.083 g の 0.575 g 0.17 g ナノ3、0.04 g のアスコルビン酸、10 ミリメートル fe (iii) キナ酸原液の 3.0 mL の水溶液レサズリン。 注: 小さい成長培地量が必要な場合それに比例して量を調整します。このプロトコルの手順 1 でビルドされるなど、同時にバブル 5 本ことができる N2駅の中の 300 mL を準備します。 注意: ビタミン、微量ミネラルとキナ酸鉄 (iii) 溶液は滅菌しておく必要があります。汚染を避けるためには、調剤するとき標準的な無菌手技と滅菌ピペット チップを使用します。4 ° C で冷蔵庫にミネラルとビタミンがソリューションを格納します。</li>
		<li>すべての化学薬品の付加の後で 6.75 1 M 水酸化ナトリウム溶液を使用するために pH を調整します。</li>
		<li>手順 2.1.3-2.1.9 プロトコルの残りの部分を参照してください。</li>
	</ol></li>
	<li>MSR 1 半固体成長培地の調製<ol>
<li>K2HPO4 3.362 g と KH2PO4 100 mL の脱イオン蒸留水で 4.178 g を溶解して 0.5 M のリン酸バッファー溶液 pH 7.0 を準備します。PH が 7.0 の場合をチェックし、KH2PO4または必要な場合は水酸化ナトリウムと pH を調整します。密封されたガラス瓶 (プラスチックの酸素交換を避けるためにすることが望ましい) でソリューションを保存します。</li>
		<li>0.02 M 塩酸溶液 100 mL を準備します。このソリューションにした FeCl2.4H2O の 0.2 g を加え、10 mM 鉄塩化物溶液を得るために解散するかき混ぜます。密封されたガラス瓶の中の暗闇の中でソリューションを保存します。</li>
		<li>0.8 M 重炭酸ナトリウム溶液を準備するには、100 mL の脱イオン蒸留水に NaHCO3 6.72 g 溶解します。密封ガラス瓶でソリューションを保存します。</li>
		<li>オートクレーブ ソリューション 2.2.1 - 2.2.3 標準サイクル (121 ° C で少なくとも 15 分の露出) を使用しての手順で準備します。暗闇の中で滅菌溶液を保存します。</li>
		<li>ビーカーに攪拌しながら順に以下の追加脱イオン蒸留水 1 L を含む: トレース ミネラルのサプリメント溶液、0.2 mL の 1% 水溶液レサズリン溶液、NH4Cl、MgSO4.7H2 0.1 g 0.3 g, 塩化ナトリウム 0.4 g 5 mLO、CaCl2.2H2O、1 g ナトリウム、コハク酸、酢酸ナトリウム、酵母の 0.2 グラムの 0.5 g の抽出の 0.05 g、寒天の 1.6 g。</li>
		<li>アルミ箔とオートクレーブ 2.3.5 準備したソリューション ビーカーをカバーします。</li>
		<li>オートクレーブ サイクルの最後の直前に準備新鮮な 4% L cysteine·HCl·L cysteine· の 0.8 g を溶解することにより H2O ソリューションHCl·H2O 脱イオン蒸留水 20 mL に。5 M NaOH 溶液で Ph7.0 にソリューションを中和します。 注意: システインの酸化を避けるためにシステイン溶液を調製して新鮮なことが重要です。4 ° C で冷蔵庫にミネラル溶液を保存します。</li>
		<li>オートクレーブ後、50-60 ° C まで中を冷ます、ブンゼン バーナーの炎の下でビーカーをもたらします。アルミ箔を削除し、すぐに軽く攪拌しながら順に次を追加: ビタミン溶液、滅菌リン酸バッファー原液、滅菌鉄塩化原液、重炭酸ナトリウム滅菌株式 1.8 mL 3 mL の 2.8 mL 0.5 mLソリューション、ろ過殺菌されたシステイン溶液 10 mL です。 注: 小さい成長培地量が必要な場合それに比例して量を調整します。通常媒体の 120 mL のバッチを準備すると便利です。 注意: すべてのソリューションに将来使用するため無菌のままする必要があります。手順 2.3.8 無菌手技と滅菌ピペットを使用して調剤するときのヒントします。</li>
		<li>すべての化学薬品の付加の後で 16 mL 滅菌スクリュー キャップ ハンゲイト チューブに温かい媒体を転送します。各チューブに媒体の 12 mL を転送し、チューブをシールします。 注意: 汚染を防止するには、ブンゼン バーナーの炎の下で 2.3.9 ステップを実行します。媒体は 40 ° c 以上、寒天が固化する前にそれを実行します。</li>
		<li>チューブを寒天が固化なり、OAI 明らかに無色のインターフェイス、媒体の表面下約 1 〜 3 cm にピンクとして具体化するまで数時間行わないでください。 メモ: 媒体はチューブで無色にはゆっくりと。この遷移に必要な時間の量は可変して O2媒体に溶解した当初の量によって異なります。</li>
	</ol></li>
</ol>3。 MTB の接種
注: AMB-1 MS 1 および MSR 1 系統の文化商業的入手できます (テーブルの材料)。
注意: は、ブンゼン バーナーの炎の下で無菌の状態ですべての次の手順を実行します。
<ol><li>液体培地で MSR 1、AMB 1 MS 1 株の接種<ol>
<li>ブチル ゴム栓アルミシール圧着と空 125 mL 血清ボトルをシールします。ストッパーをボトルで 2 本の針を挿入し、それらの 1 つのステップ 1.7 のように注射器を接続します。O2 N の2駅の使用とチューブの同じタイプのシリンダーに注射器を接続します。</li>
		<li>O2を通過、約 30 分のためのびんをさせて、O2でボトル内の空気をすべてを置き換えることを確認します。ボトルとし、オートクレーブのわずかな重圧を可能にする両方の針を削除します。使用する前に室温に冷却するボトルを許可します。 注: 時間を節約するには、媒体の準備・ オートクレーブ媒体または貯蔵液と一緒にボトル中 3.1.1 と 3.1.2 の手順に従います。</li>
		<li>それらの上に 70% エタノール溶液数滴を適用するブンゼン バーナーの炎の中を渡すことによって新鮮な中瓶・ O2ボトル ストッパーのトップスを滅菌します。</li>
		<li>滅菌注射器と針を使って、O2ボトルから O2の 1 mL を抽出し、新鮮な培地ボトルにそれを転送します。針緊密に収まること注射器このステップの中に注射器で空気を避けるためにしていることを確認します。</li>
		<li>ガラス瓶で育った別の文化から接種材料を使用している場合は、それらの上に 70% エタノール溶液数滴を適用するブンゼン バーナーの炎の中を渡すことによって新鮮な中瓶の古い文化のボトル ストッパーを滅菌します。冷凍文化のチューブから菌を使用している場合ちょうどブンゼン バーナーの炎の下で密封された管とそれを室温まで温を知らせてください。</li>
		<li>ガラス瓶で育った別の文化から接種材料を使用している場合は、新鮮な媒体に古い文化の 1 mL を接種します。冷凍ストックから inoculate を使用している場合は、希釈、グリセロールまたはジメチル ジメチルスルホキシド (DMSO) 凍結の過程で使用する唯一の 0.1 mL を接種します。どちらの場合も、滅菌注射器、滅菌針を使用します。</li>
		<li>32 ° C で文化を孵化させなさい、それを 4 〜 7 日後新鮮な培地に接種します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>MSR 1 の O2グラデーション半固形培地での接種<ol>
<li>新鮮な媒体のチューブが無色のインターフェイスにピンクが具体化、明確に定義された OAI を表示されることを確認します。</li>
		<li>場合接種は別の O2濃度勾配半固体培養から来ている, 細菌によって形成されたバンドに配置滅菌ピペット チップ細菌の文化の 50 μ L 分注で収穫します。ゆっくりとインターフェイスの妨害を回避する新鮮な媒体 (ピンク/無色インターフェイス)、OAI でこれらの細菌を接種します。接種は、冷凍の文化から来ている場合、は、代わりに菌の 100 μ L と同じ方法で進みます。</li>
		<li>シール チューブと細菌は 25 ° C から 30 ° C 成長させバンド細菌の培地の表面に達する前に、同じ手順を使用して新鮮な媒体に転送します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 細菌の観察
<ol><li>それの上に 70% エタノール溶液を適用するブンゼン バーナーの炎を通過して文化の瓶の栓を消毒します。半固形培、ブンゼン バーナーの炎の下で管を開いてください。滅菌注射器、滅菌針を使用して、細菌を抽出します。</li>
	<li>絞首刑の使用は、細菌が磁気と運動の両方であることを確認する方法8をドロップします。 注: 位相差顕微鏡は、偉大な結果を与えるが、必須ではありません。倍率 10 X 60 X に至るまでが適しています。</li>
	<li>細胞の構造とで詳細8マグネトソームを観察するのに透過型電子顕微鏡 (TEM) を使用します。</li>
</ol>

<ol><li>Blakemore, R. P. <a target="_blank" href="https://www.annualreviews.org/doi/abs/10.1146/annurev.mi.36.100182.001245">Magnetotactic bacteria.</a> Annual Reviews in Microbiology. 36 (1), 217-238 (1982).</li>
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</ol>

著者が明らかに何もありません。

MTB 特有の O2濃度要件はように実験室で成長する非自明です。液体培地用のプロトコルの重要なステップは、O2、接種直前の明確なボリュームを追加して最終濃度を制御するために媒体からのすべての O2の初期の除去です。MSR 1 がほぼ完全に好気性の条件の下で育つ、しかし、細胞の磁性を大幅に削減、それを示されています。同じ調査の結果を示した、AMB 1 系統と MS-1 成長しない完全好気性条件6歳未満。MSR 1 の半固体培養、すべて O2はまずシステイン溶液による減少し、O2濃度勾配の表示されます、OAI の形成に 。文化も育たない、磁気ではない場合、O2濃度は最初に確認をする必要があります。
半固体成長培地が不明な MTB を分離する、または成長と安定勾配の存在を確実に自分の位置に細菌をことができます両方の O2と酸化還元勾配に非常に敏感な種のための興味深い選択最適な生育条件を提供...

走磁性細菌 (MTB) は、グラム陰性菌原淡水と海洋の水生生息地1のユビキタスの広い範囲を表します。これらの細菌は、マグネタイト (Fe3O4) ・ greigite (Fe3S4)、鎖の細胞の中に組み立てられるほとんどの場合は、磁気の結晶を生産する能力を共有します。この特定の構造モチーフは、機能を持ち、各結晶2を取り囲む脂質膜に細菌の細胞質にいくつかの特定の蛋白質の存在によるものです。それぞれの個々 の水晶とその周囲の膜小胞、磁性細菌と呼ばれる約 30 から 50 までサイズで及ぶ磁性種3nm。マグネトソームのチェーンの配置、ためこれらの細菌は、外部磁場と受動的に整列させる永久磁気双極子モーメントを所有しています。したがって、これらの細菌は、積極的に演技以上におそらく自走マイクロ コンパスは効果的に最も有利な条件を見つけて、磁力線に沿って泳ぐ (e.g。、O2濃度) の成長のため。
MTB の興味深いプロパティ化学・磁性細菌結晶の結晶構造解析の両方を調節できることです。ほとんどの系統はいくつか磁鉄鉱の greigite、比較的高純度結晶を生成 biomineralize 鉱物4両。すべてのケースでは、細菌は単一磁結晶の形状とサイズを正確に制御することができます。これは MTB がこのバイオミネラリゼーション プロセスを実行する方法のよりよい理解を開発する研究の偉大な量を実施する理由について説明します。このプロセスを理解する多くの商業および医療アプリケーションの磁気ナノ結晶をオーダーメイドするため研究が可能です。
MTB の広範な研究に相当な障害物は、実験室でそれらの成長の難しさをされています。この作業で使用する系統を含む、ほとんどの種は、偏性微好気 O2ターミナル電子受容体として成長してきたときです。これは、これらの細菌が好気、無酸素条件 (酸素-無酸素インターフェイス、OAI) 間の移行帯で最もよく見られる理由について説明します。これは明らかに MTB が明らかにこれらの有機体のための成長媒体を工夫を考慮する必要がある正確なの O2濃度要件であることを示しています。また、MTB の優れた既存の多様性は、異なる系統が異なるタイプの化学勾配と最適な成長を達成するために栄養素を必要がありますを意味します。
この作品で最も広く研究の MTB の 3 つの成長のための方法を述べる: , 一般講演(AMB 1 株)、 m. magnetotacticum (MS-1)、 m. gryphiswaldense (MSR-1)。これらの種系統プロテオ バクテリア門でAlphaproteobacteriaクラスに属する形態でヘリカル、セルの各端の極鞭毛を持っています。液体の O2濃度勾配半固体媒体、以前に発行された中レシピ5,6に基づく MSR 1 株の成長のためのプロトコルを提供します。変更された磁気スピリルム成長媒体 (MGSM)7の AMB 1 および MS 1 系統を成長のための詳しいプロトコルを提案する.

<table><tbody><tr><td>AMB-1</td><td>アメリカン タイプ カルチャー コレクション (ATCC)</td><td>ATCC 700264</td><td></td></tr><tr><td>MS-1</td><td>ATCC</td><td>ATCC 31632&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MSR-1</td><td>Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ)</td><td>DSM 6361</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸第二鉄</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3388-250G</td><td></td></tr><tr><td>微量ミネラルサプリメント</td><td>ATCC</td><td>MD-TMS</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</sub</td><td>>EMD</td><td>PX1565-1</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4.7 H2O</td><td>EMD</td><td>MX0070-1</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>BioShop Canada Inc</td><td>HEP001.250</td><td></td></tr><tr><td>NaNO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5506-250G</td><td></td></tr><tr><td>酵母抽出物</td><td>フィッシャー科学</td><td>DF210929</td><td></td></tr><tr><td>ペプトン</td><td>フィッシャー科学</td><td>DF0436-17-5</td><td></td></tr><tr><td>L-乳酸カリウム溶液 (60%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60389-250ML-F</td><td></td></tr><tr><td>D-(-)-キナ酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>138622</td><td></td></tr><tr><td>FeCl3.6H2O</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>I88-100</td><td></td></tr><tr><td>ビタミンサプリメント</td><td>ATCC</td><td>MD-VS</td><td></td></tr><tr><td>コハク酸ナトリウム六水和物</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>S413-500</td><td></td></tr><tr><td>酒石酸ナトリウム二塩基性二水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>228729-100G</td><td></td></tr><tr><td>酢酸ナトリウム三水和物</td><td>EMD</td><td>SX0255-1</td><td></td></tr><tr><td>レサズリン</td><td>Difco</td><td>0704-13</td><td></td></tr><tr><td>アスコルビン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544-25G</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Caledon</td><td>6620-1-65</td><td></td></tr><tr><td>FeCl2.4H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>44939-250G</td><td></td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム</td><td>EMD</td><td>SX0320-1</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Caledon</td><td>7560-1</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>EMD</td><td>1011450500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2.2 H2O</td><td>EMD</td><td>1023820500</td><td></td></tr><tr><td>寒天 A</td><td>バイオBasic Canada Inc</td><td>FB0010</td><td></td></tr><tr><td>L-cysteine.HCl.H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7880-100G</td><td></td></tr><tr><td>1.0 mL シリンジ</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>B309659</td><td></td></tr><tr><td>25G&nbsp; x 1 針</td><td>BD</td><td>305125</td><td></td></tr><tr><td>125 mL 血清ボトル</td><td>ウィートン</td><td>223748</td><td></td></tr><tr><td>20 mm アルミニウム シール</td><td>ウィートン</td><td>224223-01</td><td></td></tr><tr><td>20mm E-Z クリンパー</td><td>ウィートン</td><td>W225303</td><td></td></tr><tr><td>ブチルゴムストッパー</td><td>Bellco Glass, Inc.</td><td>2048-11800</td><td></td></tr><tr><td>ハンゲート管</td><td>ケムグラス (VWR)</td><td>CLS-4208-01</td><td></td></tr><tr><td>セプタムストッパー 13mm Hungate</td><td>Bellco Glass, Inc.</td><td>2047-11600</td><td></td></tr><tr><td>ガラス培養チューブコー</td><td>ニング(VWR)</td><td>9826-16X</td><td></td></tr><tr><td>塩酸36.5-38%、バイオ試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758-100ML</td><td>11.6-12 N</td></tr></tbody></table>

属磁性の走磁性細菌の成長: msr 1、amb 1 ms 1 株

Growing Magnetotactic Bacteria of the Genus Magnetospirillum: Strains MSR-1, AMB-1 and MS-1

走磁性細菌は、淡水と海洋の生息地におけるユビキタス グラム陰性、運動性、主に水生微生物です。彼らは biomineralize マグネトソーム磁気ナノ結晶マグネタイト (Fe3O4) または greigite (Fe3S4) の内脂質二重膜に囲まれたである彼らの能力によって特徴付けられる、細胞質。ほとんど知られている走磁性細菌の細胞質、細胞に永久磁気双極子モーメントを授与し、受動的外部磁気フィールドに合わせてそれらを引き起こしている中鎖マグネトソームをまとめます。走磁性細菌ではこれらの特定の機能のため商業・医療用大きな可能性があります。ただし、ほとんどの種は微好気、大腸菌など他の多くの細菌よりも日常的に成長するが難しくして特定の O2濃度要件をあります。走磁性バクテリア属磁性に属するすべての最も広く研究の系統の 3 つを成長のための詳しいプロトコルをご紹介します。これらのメソッド、彼らは正常に成長し、合成マグネトソームを確保するために、細菌に可能 O2濃度の正確な制御を可能にします。これらのプロシージャを使用して研究のための走磁性細菌の成長する微生物学の専門家である験者を必要はありません。この記事で紹介した一般的な方法も使えますを分離し、他の走磁性細菌文化成長媒体の化学組成を変更する必要がありそうだが。

成長媒体の成功の準備は、次のとおり評価できます。プロセスの最後に、ソリューションをクリア (すなわち。 任意の沈殿物の無料) 取得する必要があります (これは液体メディアと O2グラデーション半固体媒体の両方に当てはまります)。接種は図 2 aで見ることができる前に、MSR 1 液体培地の予想される側面を表示する画像。成功した O2濃度勾配の半固体媒体に管 (図 3チューブ A) の上部にピンクの媒体の 1-3 cm の存在によって示されるいくつかの時間後、OAI の形成によって通知されます。メディアの残りの部分は、無色にする必要があります。接種が、レサズリンの完全酸化の署名する前にすべてのピンク色中、したがって O2濃度勾配の失敗の準備。
液体媒体の...

成長媒体の 2 種類の磁性のいくつかの株の成長のための手順を紹介します。磁性 gryphiswaldense MSR 1 株で栽培されて液体と O2濃度勾配半固体メディアM. 細菌系統 AMB 1 およびM. magnetotacticum系統 MS 1 を液体培地で育つ。

属磁性の走磁性細菌の成長: MSR 1、AMB 1 MS 1 株

Magnetotactic bacteria are Gram-negative, motile, mainly aquatic prokaryotes ubiquitous in freshwater and marine habitats. They are characterized by their ...

この方法は、MSR-1、AMB-1、およびMS-1と呼ばれる磁気性細菌の3つの異なる種を成長させることができます。すべての淡水種、およびすべて磁気刺激性の属から。これは、これらの生物を含む再現性のある研究の任意の種類のための不可欠な第一歩です。磁気細菌は非常に特異的な酸素要件を有するため、磁気ナビゲーションシステムを開発しました。従って彼らが利用できる酸素の量を制御することは非常に重要である。このプロトコルのすべては淡水マグネトスピリラのいくつかの特定の株のために最適化されています。その詳細は、他の磁気性細菌の酸素と栄養要件に対応するために最適化することができます。窒素ステーションを設置するのに十分なスペースがあるベンチの近くに窒素ガスタンクを安全に設置してください。駅が建設されるエリアに到達するのに十分な長さのタンクにチューブの一部を接続します。必要に応じて、タンクの出力にテフロンテープを貼り、漏れを防ぎます。同時に5本の媒体をバブリングできるステーションを建設するには、無数に5センチメートルの長さのチューブ4個をカットします。3つの3ウェイT字型プラスチック継手でラインにチューブのピースを組み立てます。このラインの一端を、余分なT字型のフィッティングを通して窒素タンクの出力でチューブの一端に接続します。反対側に 90 度のエルボフィッティングを追加します。テープを使用して、ベンチの上に30センチメートル上に近接して配置された水平金属棒に構造を取り付けます。取付けられている継ぎ手の3つの出力に、長さが20センチメートルの無数のチューブの5枚を接続します。5つの1ミリリットルのプラスチック注射器からピストンを取り出し、これらのスポイトの大きな端を切り取り、卒業した部分だけを維持します。これらの注射器に綿を入れ、固く詰めすぎないように注意してください。長さ20センチメートルの縦のチューブに注射器を挿入します。ガスを入れ、石鹸水を使って窒素が流れ出るときに漏れがないようにします。5本の25本のゲージ針のキャップを取り外し、これらの針を10センチメートルの細いチューブに挿入します。準備した針を窒素ステーションの注射器に取り付けます。窒素が5本のラインすべてを通過していることを確認し、ステーションをスタンバイ状態に保ちます。10ミリモルのクエン酸フェリ酸フェクエン酸水を100ミリリットルの蒸留水に加えて、10ミリモルのクエン酸溶液を調製します。熱し、オレンジ色の透明溶液が得られるまで溶解して攪拌する。滅菌されたストック溶液を暗闇の中で室温で貯蔵する前に、摂氏121度で少なくとも15分の露出の標準サイクルを使用して溶液をオートクレーブする。MSR-1用の液体成長培地の5本のボトルを調製するには、300ミリリットルの蒸留脱イオン水を含むビーカーにテキストプロトコルに記載されている化学物質を追加します。滅菌技術を使用して、無菌のクエン酸およびミネラル溶液の添加は、ブンゼンバーナーの炎の下で行われなければなりません。滅菌状態は、他の細菌種による培養の汚染を避けるために不可欠である。すべての化学物質を添加した後、1つのモル水酸化ナトリウム溶液でpHを7.0に調整します。作りたての培地を125ミリリットルの血清ボトルに分配し、各ボトルに60ミリリットルの培地を注ぎます。窒素を30分間培地中に泡立て、窒素ステーションに接続された小管を用いて溶存酸素を除去する。各ボトルの上にブチルゴムストッパーを置き、余分なガスがボトルを出るように小さな開口部を残します。30分後、準備されたストッパーとアルミシールで各ボトルを圧着シールします。アルミニウムシールは、ボトルがプロトコルの残りの部分の間に密封されたままであることを保証します。窒素ステーションから針と薄いチューブを取り外し、清潔な針に交換します。ガスの穏やかで連続的な流れがタンクを出るように窒素タンクの弁を調節しなさい。次に、窒素タンクに接続された針の1つをゴム栓を通して媒体のボトルに挿入します。すぐに別のきれいな針を同じボトルに入れます。他のボトルについてもこのステップを繰り返し、約30分間窒素を流してボトル内の空気を窒素で置き換えます。30分後、対応する針を取り外して窒素ステーションからボトル1本を取り外します。培地のボトル内の圧力が大気圧に低下するまで数秒待ち、2番目の針を取り除きます。残りのすべてのボトルに対してこの手順を繰り返します。MSR-1用の半固体成長培地を120ミリリットル調製するには、ビーカーをアルミニウム箔で覆い、テキストプロトコルに記載されているように調製した溶液をオートクレーブします。オートクレーブサイクルの終了直前に、新しい4%システイン溶液を調製し、テキストプロトコルに記載されているように、5モル水酸化ナトリウム溶液でpHを7.0に調整します。オートクレーブした後、培地を摂氏50~60度まで冷やし、ブンゼンバーナーの炎の下にビーカーを持って来ます。アルミホイルを取り外し、静かにかき混ぜながら滅菌技術を使用してテキストプロトコルに記載されている化学物質を素早く追加します。1.2ミリリットルのフィルター滅菌システイン溶液を加えます。すべての化学物質を添加した後、16ミリリットルの無菌スクリューキャップハンゲートチューブに暖かい媒体を移します。各チューブに媒体の12ミリリットルを移し、チューブを密封します。液体媒体中のMSR-1、AMB-1、MS-1の菌株を接種するには、ストッパーにエタノールを塗布し、ブンゼンバーナーの炎を通して、酸素と新鮮なミディアムボトルの上部を炎上させます。滅菌注射器と針を使用して、酸素ボトルから1ミリリットルの酸素を抽出し、新鮮な媒体ボトルに移します。ガラス瓶で栽培された別の培養物の接種を使用する場合は、両方のボトルを炎上します。その後、古い文化の1ミリリットルを新鮮な培地に接種する。32°Cで培養し、4〜7日後に新鮮な培地に接種します。MSR-1を酸素勾配、半固体培地に接種するために、新鮮な媒体のチューブが、培地表面の約1〜3センチメートル下のピンクから無色の界面で具体化された明確に定義されたOAIを表示することを確認する。接種物が別の酸素濃度勾配半固体培養から来ている場合、細菌によって形成されたバンドに配置された滅菌ピペットチップで培養物の50マイクロリットルを吸引することによって細菌を収穫する。これらの細菌をOAIで新鮮な媒体でゆっくりと接種し、界面を乱さないようにします。チューブを密封し、細菌は摂氏25度と摂氏30度の間で成長させます。細菌が磁気とモーダルの両方であることを確認するには、顕微鏡カバースリップに培養液を一滴置きます。カバースリップをめくり、ガラススライドの上に置いたOリングに取り付けます。ドロップが下部のスライドに触れていないことを確認します。吊り下げ液を顕微鏡の下に置き、液滴の縁に焦点を合わせます。磁石の南極をその端に近づけ、細菌が縁に向かって泳ぐのを見ます。磁石を反転して、反対方向に泳ぎます。ここに示されているのは、接種前と細菌増殖後の液体培地のボトルです。第2のボトルの濁りは、細菌が成長していることを示しています。この2回の加速映画は、モーダルおよび磁気磁気磁気磁気性細菌培養のための吊り下げ実験の期待される結果を示しています。細菌は、磁場が印加されると、最初は液滴の端に向かって泳いだ。磁石の磁場方向が逆になると、細菌は磁場が加えられる縁から離れて泳いだ。ここに示されているのは、接種前および細菌増殖後の半固体培地のチューブである。予想通り、細菌のバンドはオキシアノキシック界面で形成され、酸素が消費され、界面が上に移動するにつれて時間の経過とともに移動します。ここに示されている磁気スピリルラムの代表的な電子顕微鏡写真である。旗エラは黒い矢印で示され、赤い矢印はマグネソソームを示しています。この手順を試みるとき,磁気学的細菌は適切に成長し,磁気ソーマを生成するためには非常に特異的な酸素レベルの要件を有することを覚えておくことが非常に重要です。このプロトコルは、これらの生物が好む微量条件を達成するために、成長培地中の酸素レベルを制御および監視する方法を示す。この方法に従って、高濃度の健康で高い磁気細胞が得られる。このようにして、大量の細菌を必要とする実験、例えば磁気抽出、ゲノムおよび遺伝学的研究、または顕微鏡による集団運動の観察が行われる。実験室で磁気性細菌を成長させる可能性は、科学者がこれらの生物の魅力的な生化学的および物理的性質を体系的に探求することを可能にしたものです。

growing-magnetotactic-bacteria-genus-magnetospirillum-strains-msr-1

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

ママはmagnetosome活性化に関与することが示されていたユニークなMagnetosome関連するタンパク質である。ここでは、からママ欠失変異体（MamAΔ41）の精製のプロトコールを提示...

の精製 M. magneticum株AMB - 1 Magnetosome関連タンパク質MamAΔ41

出典: Le Nagard, L., et al.マグネトスピリルム属の増殖する走磁性細菌 MSR‐1,AMB‐1,MS‐1株J. Vis.

マグネトスピリラム菌の増殖とその磁気移動性挙動の評価

我々は、天然水に適用できる磁性細菌（MTB）を収集する方法を示しています。...

当然のことながら環境から磁性細菌の発生の収集、分離、濃縮

マトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間型質量分析(MALDI-TOF MS)および分子技術(16S...

16S rRNAの遺伝子配列決定およびMALDI-TOF MSによるレア細菌性病原体の同定

コバルトドープマグネトフェリチンの合成とカチオン化のためのプロトコールと、カチオン化マグネトフェリチンで幹細胞を迅速に磁化する方法が紹介されています。...

細胞の超高速磁化のためのカチオン化Magnetoferritinの合成

このプロトコルの全体的な目標はポータブル、コスト効果の高い、機能的なナノセンサーを合成する、特にターゲットに磁気緩和と蛍光発光モダリティの組み合わせにより病原性細菌の迅速検出。...

E. 大腸菌o157: h7 の食品由来病原体のスクリーニングを使用して磁気蛍光ナノセンサー: 迅速検出

マイクロ流体リアクター、液体真空界面解析システムにより水和状態の化学マッピングのための in situ飛行時間二次イオン質量分析のためのバイオ フィルムの成長のための手法を提案します。緑色蛍光タンパク質を持つシェワネラ oneidensis氏 1...

その場でサルヴィ、TOF-SIMSシェワネラ oneidensis MR1 バイオ フィルムの特性

MAPS技術は、生体内の特定の調節RNAの標的を精査するために開発されました。目的のsRNAは、そのRNAパートナーの共精製とRNAシーケンシングによるそれらの同定を可能にするMS2アプタマーでタグ付けされます。この改変プロトコルは、特にグラム陽性菌に適しています。...

グラム陽性菌におけるRNAシーケンシングと結合したMS2-アフィニティ精製

このプロトコルでは、マイコバクテリウム・スメグマティス(Msm)の軸種培養からの天然マイコバクテリア細胞外小胞(mEV)の濃縮と、mCherry(赤色蛍光レポーター)含有組換えMsmEVsの設計と濃縮方法について詳しく説明します。最後に、結核菌のEsxAタンパク質を含むMsmEVを濃縮することで、新しいアプローチを検証します。...

マイコバクテリアの天然および組換え細胞外小胞の濃縮

液体ベースの培養および調剤のための手順...

蛍光とハイスループットスクリーニングとバイオセンシング C.エレガンス菌株

学ぶ、Magnetospirillum属の磁性細菌MSR-1、AMB-1、MS-1株の液体・半固体培地での培養法。酸素濃度制御と無菌操作の最適化により、再現性のある研究が可能となる。

属磁性の走磁性細菌の成長: MSR 1、AMB 1 MS 1 株

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