核磁気共鳴分光法 (NMR) とマイクロ働く (MST) による球状と糸状のタンパク質の相互作用を測定

この方法は、タンパク質が小さな分子や大きな分子に直接結合するかどうかなど、タンパク質相互作用分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、原子レベルで直接相互作用を検出する簡単かつ迅速な方法です。エジック コマンド ej でエアー フローをオンにします。

これにより、磁石からサンプルが上がります。次に、開口部の磁石の上にスピナー内にサンプルを配置します。ij コマンドを使用して挿入します。

サンプルが磁石の中に落ち着くまで待ってから、先に進みます。edc コマンドを使用して新しいデータセットを作成し、実験 ZGPR を選択して標準の陽子 NMR パラメータを読み込みます。NAME、実験番号、および処理済みデータ フォルダ番号のフィールドを入力します。

[溶媒の設定]フィールドで溶媒を選択し、getprosol実行をクリックして、標準のプローブヘッドおよび溶媒依存パラメータを読み取ります。lockコマンドを使用して、サンプルを重水素化された溶媒にロックし、スイープが完了し、ロックを達成するまで待ちます。自動チューニングコマンド atma を使用してサンプルをチューニングすることにより、磁石の共振周波数を補正します。

自動チューニングが完了するまで、ぐらつきカーブを監視します。トップシムを使用して磁場をシム。シムミングは磁場を調整します。

サンプルの周囲の均一性を達成する。同じまたは類似のサンプルを使用する場合は、これをコマンド wsh で値に格納し、topshim の前に rsh を使用して読み取ることをお勧めします。これで、最大信号対ノイズ比を達成するために、rgaコマンドで受信機のゲインを調整します。

スペクトルの中心を水共振オフセットに置き、calibo1p1を用いて90度のプロトンパルスを高出力に設定します。ゼロgo zgコマンドを使用してプロトンスペクトルを収集し、efpで処理します。これには、指数乗算、ラインの広がり、FIDのフーリエ変換、位相補正を適用するpkを組み込んだ自由誘導減衰が含まれます。

統合オプションを使用して、自動位相補正 apk と自動ベースライン補正 absn を適用します。実験で SFHMQC3GPPH を選択して、SOFAST HMBC 実験用の新しいデータセットを作成します。最適化された P1 と O1 をプロトンスペクトルからコピーし、p1 が最適化された P1 値であるコマンド getprosol 1H p1 plw1 を使用して P1 に依存するパルスを設定します。ここで、CNST54定数を最適化して、アミド化学シフトのオフセットを設定します。

また、CNST55を最適化して、対象のスペクトル領域を包含するために帯域幅を定義し、受信機のゲインを最適化できるようにします。これらのパラメータを選択するには、2次元スペクトルから最初のFIDを抽出し、それらを定義するために観測された信号を探します。さらに、リラクゼーション遅延、スキャン数、ダミースキャンを変えて、gコマンドで許容可能な信号感度を得ることができ、ゴースキャンとスキャンでリアルタイムでデータ品質を監視できます。

最後に、ゼロゴーzgを使用してスペクトルを記録します。処理パラメータをスペクトルの直接 F2 次元および間接 F1 次元のサイズに設定し、間接ディメンションでオプションの線形予測を行います。ウィンドウ関数として QSINE を選択し、2 次元スペクトルを処理するために 2 の Sine ベルシフトを入力します。

ウィンドウ関数とフーリエ変換を使用して両方向のデータを処理するコマンド xfb を入力します。コマンド apk2d を使用して、両方向で自動位相補正を実行します。2D データの自動ベースライン補正関数 abs2 を使用してベースラインを修正します。

これにより、処理パラメータで定義された ppm 値の間に多項式関数が適用され、さらに解析するために 2D スペクトルが生成されます。相互作用データと他の分子との比較のためにシリアル処理を実行する場合は、処理パラメータをコマンド wpar に保存し、rpar で呼び出します。コマンド pp を入力して、ピークピッキングのプロセスを開始します。

予想ピークに基づいて、ppm 範囲、最小強度、最大ピーク数を定義します。次に、[OK] をクリックします。目視検査で結果を確認します。必要に応じて、スペクトルの品質に基づいて結果が満足できるまで、プロセスを再実行します。

pp コマンドを使用してピーク・リストを生成します。このピーク リストには、既定でデータの高さとピーク強度の情報が含まれています。ピークリストは、後続のスペクトルにエクスポートすることができ、他のプログラムによって読み取ることができます。

次に、別の分子との相互作用を示す化学シフトのピーク強度または動きの変化について、タンパク質HSQCスペクトルを観察します。相互作用分子が大きい場合は、いくつかのピークの消失と共にピーク強度の低下を期待する。ピーク・リストを次のデータ・セットにインポートするには、「ピーク」タブをクリックし、「ピーク」ウィンドウで右クリックしてインポートを選択します。

スペクトル上のピークを視覚化し、必要に応じて、新しい位置にそれらをシフトします。完全なテーブルのリセット強度をクリックして、強度を含むスペクトルのピークリストを生成します。このピークリストは、保存されたピークリストの位置情報を引き継ぐ。

異なるデータセットから、エクスポート関数を選択して分析用にスプレッドシートやその他の数学プログラムにピークリストをエクスポートします。関数のピーク強度の関数の複雑なスペクトル、各ピークのタンパク質スペクトルのピーク強度でピーク強度の変化を計算します。値は、100 を掛け合算することで変化率に変換できます。

ピークボリュームも有用ですが、ピーク強度は互いに近くに配置されているピークを測定しやすくなりますが、通常は比較的広いピークの密度が高いタンパク質の場合に当てはまる点です。N15HSCSは、VimRodの存在または不在中に、野生型E-PRDおよびR1914E変異体のために取得された。野生型E-PRDのスペクトルは、適切に折り畳まれたタンパク質を示す、よく解決されたピークの予想数を示しています。

VimRodの存在下で、スペクトルは広範囲のラインの広がりおよびピーク消失を示し、E-PRDとVimRodの間の結合に対応する。R1914E変異体のスペクトルとVimRodの添加時のスペクトル間にはほとんど変化が認められず、この変異体E-PRDへの結合の欠如を示す。ここでVimRodの存在と不在におけるE-PRDピーク強度を比較し、E-PRD複合体におけるピークの広がりの範囲を示す相対的なピーク強度としてプロットした。

VimRodとE-PRDの結合を検証し定量するために、蛍光赤トリスNTA色素を標的とするHis6-VimRodを用いたMST分析を、E-PRD配位子の減少濃度を用いて実施した。データは、ワンサイトリガンド結合の標準モデルに適合し、25.7プラスマイナス2.1マイクロモルのKDを与えた。この手順を試みる際には、同一の取得条件と処理条件を使用することが重要です。

NMRスペクトルの収集のための同位体標識タンパク質サンプルへのアクセスのために苦労します。この技術の影響は、癌、感染症、または神経変性疾患の治療に及ぶ。