Name: 小角 x 線散乱による溶液中の高分子の構造研究 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: 学ぶ小角X線散乱法による溶液中の生体高分子の構造解析。ATSASプログラムスイートを用いたデータ解析パイプラインを視覚的に理解し、タンパク質のサイズ・形状・相互作用を生理学的条件下で研究する手法を習得できます。

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このプロジェクトは、アルバータ州プリオン研究所、キャンパス アルバータ州イノベーション プログラム (RCP-12-002 C) レベル RGPIN-2018-04994 に支えられてきた/ミズーリ州 TRP に授与されたアルバータ州革新バイオ ソリューション (201600018) の補助金は RNA のカナダの研究の椅子と蛋白質の生物 (201704) レベル検出グラント (RGPIN-2017-04003) を認めていると。TM は資金を供給されたトロピカルへのレベル検出交付金によって

1. 小角 x 線散乱試料調製及びデータ集録
<ol><li>サンプルの準備:<ol>
<li>小角 x 線散乱実験を必要とする均質な安定した、非凝集蛋白質のサンプル;安定性とサイズ排除クロマトグラフィー (S) とオリゴマーの状態観察 DLS および/またはデータの収集の前に AUC。</li>
		<li>サンプルの対象 (nidogen 1 とラミニン γ-1 このケースで) DL 解析とトリシン サンプル純度10を視覚化する SDS ページ。 注: サンプルのサイズ、自己会合などの安定性と共に彼らのソリューションの行動に応じて濃度 (1-4 mg/mL) の範囲をカバーすることがあります。ここでは、nidogen - 1, (139 kDa) 5 濃度 S 精製の等モルの複合体のラミニン γ 1 (109 kDa) の 3 と 4 は前述10として調製しました。</li>
	</ol>
</li>
	<li>データの収集:<ol>
<li>製造元または施設のガイドラインに従って社内システムやシンクロトロンを用いた小角 x 線散乱データを収集します。 注: この作業で使用するデータは収集された社内システムを使用して (材料の表を参照) を搭載した 3 ピンホール カメラ + 002 マイクロ フォーカス密閉管を含む (1.54 で Cu k α 放射 Å) と共焦点最大磁束 (CMF) 光学系・ w ・ 40 で動作システムはデータ収集のため 200 nm マルチ ワイヤ 2D 器が備わります。しかし、日常的に可能な集計/劣化、我々 は今からの単分散の準備の分離を容易にする S 小角セットアップへのアクセスを提供するとフランス、ドイツ、英国、米国、他の国で現代シンクロトロンの可用性放射光施設でデータを収集します。四重鎖 DNA G11の最近発行された記事は、S-小角 x 線散乱データ収集戦略の例です。この場合、小角 x 線散乱データは nidogen 1 3 時間 0.08 ≤ q ≤ 0.26 Å の範囲で収集された (2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mg/mL);ラミニン γ 1 (1.5、2.0、2.5 mg/mL) と、複雑な (0.8、1.0、1.25、1.5 mg/mL)。</li>
		<li>バッファーの処理ソフトウェア システムに固有を使用してサンプル データを減らします。プライマス/qt12 (図 2 a) のようなプログラムを使用して蛋白質データからバッファーの貢献を減算します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. データ解析
注: 現在、ある小角 x 線散乱データの分析に便利ですいくつかのソフトウェア パッケージは、: ScÅtter ATSAS スイート13bioXtas 生44,43 (www.bioisis.net で利用可能なダウンロード)。このセクションでは、生小角 x 線散乱の分析、ATSAS を使用してデータをプログラム スイートと ATSAS 2.8.1 から具体的な手順が取られるときに実行する一般的な手順の概要をダウンロードします。他のプログラムは使用でき、については簡単に後述します。
<ol><li>バッファー減算 注: これらの手順は静的の小角 x 線散乱のサンプルのみです。<ol>
<li>プリムス/qt で「開く」メニュー オプションを選択し、利息のデータ ファイルを選択します。データ ファイルは、最初の列が s ベクトル軸の ASCII 形式でする必要があります、2 番目の列は強度に注意してください。バッファー自体で同じメニューにこのデータを挿入することによって収集されたデータのためには、この手順を繰り返します。</li>
		<li>興味の高分子から散乱のみを表す減算散乱曲線を生成するデータ処理ウィンドウで「減算」を選択します。各濃度の場合に、この手順を繰り返します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>Guinier 解析<ol>
<li>Guinier 分析を実行、バッファーをロードするには、プリムス/qt 2.1.1 の手順で前述のように散乱曲線を減算します。</li>
		<li>プリムス Guinier ウィザードを開くときに続行されます「旋回の半径」をクリックln(I) 対q2のプロットが表示されます。</li>
		<li>取得するには、予備Rgは外部モジュール組み込まプリムス/約検索"Autorg"ボタンをクリックして"AUTORG"関数を使用します。</li>
		<li>それらすべてを強調表示し、右側に、2.1.1 に非常に似たようなメニューにそれらを挿入する複数のファイルを一度に入力します。</li>
		<li>データの品質を評価するために以前に作成した Guinier プロットを使用します。Guinier プロットの下で緑の線は、フィットの直線性を表す残差プロットを示しています。Guinier 解析における非線形性サンプル集計の徴候であることができるそれ以上の分析はここでは実行しないように注意してください。 注: 線形 Guinier フィットを与える誤差の少ない、 Rg (< 5%) し、高品質のサンプルを提案します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kratky 分析<ol>
<li>前述のように同様の方法で視覚化されるデータを読み込みます。</li>
		<li>データのファイル名の横に「選択ボックス」をクリックします。これは、別のウィンドウでデータがプロットされます。</li>
		<li>続いてドロップ ダウン メニューで「Kartky プロット」選択"プロット"ボタンをクリックします。</li>
		<li>これは「q2 L(q) 対qx」としてデータがプロットされます。タンパク質はピークではなく高原を表示し、双曲線プロット17のように中に球状蛋白質がガウスのピークを表示こと注意してください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>データのマージ<ol>
<li>ステップ 2.1.1 のようにもう一度、プリムス/qt の各濃度のデータを読み込みバッファーに減算されます。</li>
		<li>データをマージするには、処理ウィンドウの「マージ」ボタンをクリックします。</li>
		<li>各曲線と私のスケールの番号は、元のサンプルから作られた希釈と相関関係を調べます。 注: 高濃度でのサンプルは、曲線の尻尾領域にノイズの少ないを表示します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>P(r) 分布<ol>
<li>P(r) のプロットを生成するには、プリムス/qt 前述のように差し込んだデータ曲線を読み込みます。</li>
		<li>右側に散乱光対 qとペア距離分布関数のプロットの強度の結合されたデータの表示新しいウィンドウを開く」距離分布」ボタンをクリックします。 注: 右側の情報はペア距離分布関数計算の全体的な品質を示します。</li>
		<li>生データの末尾に任意の顕著な騒音を避けるために差し込みデータのデータ範囲を調整します。</li>
		<li>低 q 地域におけるビーム停止に近いデータ ポイントを省略します。</li>
		<li>~ 5 倍のRg Guinier 解析から得られた範囲でD最大の開始を決定します。P(r) プロット突然 y 軸の 0 にドロップされませんし、ゼロに近づく前に長い尾がないまでこの値を徐々 に減少します。</li>
		<li>確認実験Rg/私0 (Guinier 近似から派生) とP(r) Rg/私0番号が似ています。 注: 場合によっては、さらにデータ、データ ポイント、およびアルファ (プログラムと比較実験データをフィッティングすると分布の滑らかさが注目されてどのくらいの比率に指示する正則化パラメーター) の範囲の操作が質の良いP(r) プロットを取得する必要な21 。</li>
	</ol>
</li>
</ol>モデリングと平均 3b 原理ビーズ
<ol><li>複数の濃度で収集されたデータを結合すると、や S 小角を使って収集したデータを最小化すると、Kratky のプロット、 P(r) プロットと Guinier 解析が確認されて、高分子の低解像度の構造を計算し、彼らの複合体。このパイプラインはソリューション構造や核酸、蛋白質および核酸蛋白質または蛋白質の複合体10、11,21,22,23 の相互作用を研究する使用ことができます。 ,24,25,26,27,28,29,30,31,32 ,33,34。最も人気のあるプログラムの 1 つは DAMMIN、Svergun35と予備入力Rg Dmaxについてシミュレートしたアニーリング プロトコルを採用し、ATSAS パッケージ13部によって開発されました。.原則、第一原理計算モデリング アプローチを説明で詳細他18,36。</li>
</ol>

著者は宣言する開示があります。

この紙含むバッファー減算 Guinier 解析、Kratky 解析、データのマージ、P(r) 配布プロトコルのセクションで概説した小角 x 線散乱データ分析の重要なステップです。経験的ビーズ モデリングはここで詳しく説明する多岐にのみ簡単に説明されて、したがって.
シンクロトロン (例えばドイツで DESY、英国のダイヤモンド、フランスの ESRF)、それは非常に小さな端数の小角 x 線散乱データを収集することが可能 (~ 数 μ L) 分数としてそれぞれのサンプルの s 列から溶出されるがそれは接続されている行内 (図 1 を参照).弾性散乱 SAXS データはバッファーの減算は、場所を取ることができる前に、楽器の製造元または放射によって提供されるパッケージを使用を平均して放射状。結果の 1 次元データY(私(q)) での散乱光の量を表します-軸と散乱角度 (q= 4πsinθ/λ、λ はXの事件の波長-光線) と図 1に記載されています。プリムス/qt12プログラムは直接バッファーにより任意の背景を減算するために使用、セクション 1.1 で説明。他のプログラムなど。ScÅtter43 https://www.youtube.com/channel/UCvFatdC5HcZOLv6OSjblfeAと bioXtas 生44 (で利用可能な https:// で利用できるチュートリアル ( www.bioisis.netで利用可能なダウンロード)bioxtas-raw.readthedocs.io/en/Latest/index.html) ATSAS パッケージに代わるものとして活用することができます。
Guinier 分析では、サンプル集計、均質性、低s地域14から小角 x 線散乱データに基づく興味の高分子の旋回半径 (Rg) を提供することについて説明します。Q 1.30 までの最大範囲とカーブフィッティングに続いて、各濃度から得られた小角 x 線散乱データのプロットを構築プリムス/qt とRgx。非線形 Guinier の集計結果プロット15,16に対し、単分散試料はこの地域 (図 2 D) の線形 Guinier プロットを提供しなければなりません。Guinier 解析は線形、剛体モデルを実行または低解像度モデルのアンサンブルを構築するかどうかを決定する際に便利です Kratky プロットと関心の高分子の"unfoldedness"の度がご覧いただけます。球状タンパク質は、分子を拡張に対し、釣鐘型の曲線にプロットや展開のペプチドが高原あるいはq広範囲の増加し、ベル形状 (図 2) を欠いているに表示されます、Kratky に表示されます。
1 D の散布 (図 2 D) の低q領域からデータ ポイントに限れば Guinier 分析からRgを取得、ただし、それは間接フーリエ変換を実行するほとんど、データセット全体を使用することln (I (q))対(q) の逆空間情報DmaxやRgに関する情報を提供する実空間距離分布関数 (P(r)) に変換するには(図 2 b)P(r) プロットの形状は、金利18,19の高分子の総ソリューション構造を表します。逆空間データの実空間データへの変換が重要ですが、詳細な説明は本稿の範囲内でないです。したがって、各パラメーターを理解する Svergun20の記事を参照してください。
バッファー減算個々 の濃度のデータはRg、Kratky 解析を用いた折り畳みパターンの調査に続いての一貫性のある値を持つ Guinier 分析を介して処理されます、これらのデータをマージすることができます。マージされたデータ nidogen 1、ラミニン γ-1、および、複雑なは、上記のように処理された結果 P(r) プロットの2 b を図で掲載されています。理想的には、1 つもペア距離分布関数と同様RgとD最大値各濃度の小角 x 線散乱データを提供する場合を決定する各濃度 P(r) を計算する必要があります。RgおよびDmaxは濃度の広い範囲にわたって同様のまま、ユーザーが選択ください。信号によっては、データをデータのマージ前に切り捨てることができることに留意。調査中の高分子の分子量や濃度が低い場合しばしばケースです。
様々 なモードで DAMMIN を使用して低解像度形状解析を行うことが (例えば高速、低速、エキスパート モードなど)。高速モードは、P(r) のプロットは、質の良いモデルを提供している場合を評価するための理想的な最初のステップです。通常、少なくとも 10 モデルは χ (0.5 〜 1.0 の値は良いと考え私たちの広範な仕事に基づいてと呼ばれる適合パラメーターの低い良さと、低解像度構造の観点からの再現性のある結果が得られるかどうかをチェックする各 P(r) プロットの得する必要があります。)、実験的に収集したデータとモデルから派生したデータ間の契約を記述する値。文書の目的のため我々 は通常遅いまたはエキスパート モードを使用し、少なくとも 15 のモデルを計算します。DAMMIN、ほかそれ DAMMIF37と同様、GASBOR38の高速バージョンにも選択肢であります。さらに、蛋白質蛋白質や蛋白質・核酸酸錯体を研究するため、高分子として、複雑な個々 の小角 x 線散乱データの同時適合を容易に、MONSA プログラム35を使用することが可能です。RNA 蛋白質の相互作用の調査のためにまた高解像度モデルの計算の詳細については、パテルら3で最近の記事を参照してください。
SAXS は間違いなく他の構造生物学のツールと結果を独自に使用することができます低解像度の構造データまたは情報を明らかにする高解像度技術と組み合わせて高い相互補完法ですが理論的には単純です高分子構造のダイナミクス。高分子およびその錯体の単分散準備を取得できる限り、ソリューションの構造やあらゆる種類の生体高分子との相互作用を研究する小角 x 線散乱を利用できます。ここで説明する複雑な場合、それは驚くべきその少ない両蛋白質のドメインの残りの部分は、他との対話を自由にアクセスできるに対し窒素 1 およびラミニンの全体的なアクセス可能な表面領域の 10% より γ 1 はこの複合体に埋葬されました。その構造的な剛性 (図 3) を維持するために細胞外のマトリックス蛋白質。複合体のような情報の取得 ~ 240kDa の x 線結晶構造解析、NMR、Cryoem 顕微鏡など他の構造生物学の技術を使用して非常に困難でしょう。
X 線結晶構造解析や NMR 経由で暴く蛋白質の構造は本質的に時間のかかるプロセスです。構造決定のこのネックは SAXS が構造の手法としてその強さを示しています 1 つの領域単一の小角 x 線散乱実験用データ集録は、1 時間未満を取ることができる、合理化された解析ソフトウェアの助けを借りて、分析することができる迅速かつ効率的に。小角散乱による高解像度データが使用できる前に、それは高分子構造の低解像度モデルを提供するためスタンドアロン技術として構造研究のスループットを大きく可能性があります。他の構造技術への障壁は、長い期間にわたってタンパク質発現と安定性の高いレベルを必要とするデータ集録について非常に純粋な集中されたサンプルの要件です。小角 x 線散乱のサンプル純度、濃縮をする必要も、試料の液量が約 100 μ L の小角 x 線散乱解析その他の構造技術と比較して比較的安価な方法を作るします。また、サイズ排除クロマトグラフィーと相まって SAXS なっている追加の品質管理手順を提供します。最近柔軟なシステムを解明するアンサンブル最適化法 (EOM)45,46を使用して NMR と x 線溶液散乱データの組み合わせで強力な進歩がずっとあります。メルテンスと Svergun47による最近の論文、NMR と組み合わせて使用されている小角 x 線散乱データの他の多くの例と共に、NMR との組み合わせで EOM 小角 x 線散乱の複数の最近の例を述べる。小角 x 線散乱の分野で進歩が見られ継続的に、新しい技術が小角 x 線散乱と組み合わせて使用するため開発された、ないだけ無料で、その他の構造の技術。その結果、柔軟性によって関数が定義されている動的システムを特徴付けるため NMR と組み合わせて特に時間をかけて小角 x 線散乱の需要は増えるだけと考えています。

細胞は、シグナル伝達カスケード構造の整合性の維持などの細胞機能を遂行する分子機械として機能する蛋白質の複雑なネットワークを含んでいます。これらの異なるコンポーネントが移動し、三次元空間での対話の方法は高分子の特定の機能をもたらします。蛋白質の構造、ダイナミクス、および関数の決定における相互作用の重要性は、これらの特性を測定する継続的に進化し、複雑な技術の必要性を提供しています。これらの核磁気共鳴 (NMR) や x 線結晶構造解析 (半値幅) 最近、クライオ電子顕微鏡法 (CEM) 高分解能構造について説明します。しかし、半値幅や CEM 生体分子の多くの州の 1 つの構造をもたらすし、NMR による立体構造決定は通常小さい球状蛋白質立体構造のダイナミクスに関する情報が不足します。これらの制限を克服する方法の 1 つは、大規模なマルチ ドメイン、または複合系の分子の封筒を作成し、グローバルを解明する高解像度の硬質高分子構造を結合小角 x 線散乱 (SAXS) を利用するにはアーキテクチャと動的機能。
小角 x 線散乱だけでなく構造も複雑なを表示する動的特性に洞察力を与える約 10-20 Å の1, の解像度を持つ高分子複合体の低解像度エンベロープが生成されます。小角 x 線散乱は、分子構造を明らかにする x 線を利用して、溶液中の粒子のランダムな等方性方向に回折することはなく、散乱原子分解能をもたらすことはできませんもたらさないという点で半値幅とは異なりです。代わりに、巨大分子表示の構造の平均を表す「封筒」巨大分子の電子が生成されます。この情報は、領域の単一タンパク質またはサブユニット組織の柔軟性や大きい、多蛋白質複合体のダイナミクスを推論する以前解決原子分解能構造の直接フィッティングで使用できます。シンクロトロン高エネルギー単色 x 線を用いたまたは秒単位のサンプル露出時間 (図 1) ではなく、数時間を必要とする弱い x 線源を提供する社内のソースからのデータが収集されます。小角 x 線散乱データは単一の実験のセットアップとバッファー、システム上有用なデータのラウンドを収集するために長時間を必要とするいくつかのサンプルから収集されました。サンプルする必要があります、したがって、不安定になり非集約動的光散乱 (DL) など分析超遠心機 (AUC) 解析を高品質小角 x 線散乱データ2を用いて検証可能な品質管理手法に基づく少なくとも数時間,3ここで簡潔にの第一原理計算を用いたモデリング感動的原理を使用、利点、制限と試料調製とフォーカスには多額のデータ収集と分析、小角 x 線散乱の実用的な説明を一緒に提供、。細胞外マトリックス蛋白質 nidogen 1 とラミニン γ-1 実験例として。
原則、利点、および SAXS の制限:
小角 x 線散乱の背後にある基本原理は比較的簡単です: 興味の macromolecule(s) の単分散準備のソリューション キャピラリー内に配置され、高エネルギー単色 x 線ビームにさらされています。光子は、同じエネルギーと波長の放出される球面波の結果、振動を開始する原子殻の電子を引き起こします。以来、すべての電子が振動すると、一定の背景は達成され、高分子の電子密度の結果の背景に対照的であります。2Θ 散乱角の関数として生じる散乱強度を収集 (図 1)。
その他のテクニック一方 XRC NMR および CEM は原子レベルでの構造情報を提供するなど、他の技術を提供することはできません小角に複数の利点があります。小角 x 線散乱はほぼすべてのバッファーで実行できる、特別な前処理を必要としません。これは、モノラルまたは二価陽イオンや pH4、5の変化の有無など、さまざまな条件下での高分子の構造と挙動の勉強に特に重要です。小角散乱による高分子6、何か他の上場の技術することができます闘争の柔軟な領域に関する情報を提供する機能があります。強力な無料技術高分子の安定した部分と全体高分子や CEM、NRM XRC 研究または複雑な小角 x 線散乱と低解像度の分析など様々 な分析ツールを使用する結合としたがって、SAXS が使用できます。FoXSDock7や8CRYSOL。小角 x 線散乱ソリューション手法ですが、以降は半値幅から得られたものなどの静的構造が解決策6で一貫したかどうかを確認するよく使用されます。小角 x 線散乱では、比較的少量のサンプル投資 (通常 50-100 μ L) と実験時間 30 分 (1 h) の比較的少量を必要とする技術であることの利点もあります。
小角 x 線散乱の最大の制限は、サンプル集計および/または不適切な構造の予測につながることができる低下する脆弱性です。集計、5% としても低い最大粒子寸法 (Dmax) と (Rg) 断面二次半径の過大評価につながる、非常に高い量で光が散乱することができます。その一方で、サンプルの劣化は、分子特性の過小評価につながります。この脆弱性は、小角 x 線散乱されて平均法、つまり信頼性と再現性のある結果を達成するために重要なサンプルの均質性から発生します。小角 x 線散乱によって分析されるサンプルは浄化と変化とネイティブ電気泳動, サイズ排除クロマトグラフィー, 動的光散乱法など、同質性のチェック方法の複数を受けるべきである、したがってと分析遠心。多くの場合、小角 x 線散乱ビームラインは、最終の品質管理としての高速液体クロマトグラフィーによるサンプルの小角 x 線散乱 (SAXS-S)3,9前にステップ実行されます。複数濃度の小角 x 線散乱データが収集され、各データ セットのRgを比較して必要があります、粒子間相互作用の粒子の過大評価の結果集計を行いを避けるために近い類似性を確保寸法、不正確なデータ分析につながるとモデリングします。濃度と粒径に依存する散乱、小さい高分子濃度範囲のより詳細な最適化を必要があります。これは、相反定理、大きなサイズが小さな角と角の大きいに向かって小さいサイズに向かって散布です。これは IOは6R に比例して粒子半径 R は、データ コレクションで明示します。小角 x 線散乱の最終的な制限は、露光データの歪みにつながることができます中にサンプルに照射損傷の可能性です。これが発生していないことを確認する小角 x 線散乱サンプル照射前後にサンプルの質を比較することをお勧めします。

<table><tbody><tr><td>HEK 293 EBNA Cell Line</td><td>In-Lab</td> <td>availability-Cell</td> <td>line used to overexpress(s)</td></tr><tr><td>Ni Sepharose High Performance histidine-tagged protein purification resin</td><td>GE Healthcare</td><td>17524801</td><td>Affinity protein purification resin</td></tr><tr><td>Superdex 200 Increase 10/300</td><td>GE Healthcare 28990944</td><td></td><td>SEC Column</td></tr><tr><td>&Auml;KTA Pure FPLC</td><td>GE</td><td></td> <td>Healthcare-FPLCシステム</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Nanodrop</td><td>-</td><td>分光光度計</td></tr><tr><td>基本試薬(NaCl、Tris-HClなど)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>S-MAX3000</td><td>Rigaku-SAXS</td><td></td> <td>ピンホールカメラシステム</td></tr><tr><td>Zetasizer Nano-S</td><td>Malvern Instruments</td> <td>Ltd-Dynamic</td> <td>Light Scattering instrument</td></tr><tr><td>0.1&micro;DLS</td>の前に<td>サンプルを濃縮するために使用される</td>フィルター<td>ミリポア</td><td>JVWP04700</td></tr><tr>トロン<td>ビン切断キット</td><td>abcam</td><td>ab207000</td><td>彼のタグを除去するトロンビン切断</td></tr><tr><td>Strep-Tactinセファロースカラム</td><td>IBA</td><td>2-1201-010</td><td>Strep-Tag Affinity Purification</td></tr><tr><td>D-desthiobiotin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>533-48-2</td><td>Strepタグタンパク質</td></tr><tr><td>の溶出Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SAXGUI</td><td>Rigaku-Data</td><td></td> <td>Collection for SAXS and data reduction</td></tr><tr><td>ATSAS Suit</td><td>Franke et al., 2017-SAXS</td><td></td> <td>Data Analysis Software program suite</td></tr><tr><td>PRIMUS</td><td>Konarev et al., 2003-Buffer</td><td></td> <td>Subtraction</td></tr><tr><td>GNOM</td><td>Svergun, 1992-Rg</td><td></td><td>, Dmax and p(r) Calculation</td></tr><tr><td>DAMMIF</td><td>Franke and Svergun, 2009</td><td>-</td><td>Ab initio モデル計算</td></tr><tr><td>DAMAVER</td><td>Volkov and Svergun, 2003-Averaged</td><td></td> <td>Solution Conformation calculations</td></tr><tr><td>MONSA</td><td>Svergun, 1999-Simultaneous</td><td></td> <td>model fitting for the complex</td></tr><tr><td>GASBOR</td><td>Svergun et al., 2001</td><td>-</td><td>代替のAb initioモデル計算</td></tr><tr><td>DTSソフトウェア V6.20</td><td>Malvern Instruments</td> <td>Ltd-DLS</td><td>は、</td></tr><tr><td>PyMOL</td><td>Schrodinger, LLC</td>に供給した機器ソフトウェアです。<td>-</td><td>The PyMOL Molecular Graphics System V2.0</td></tr><tr><td>The Protein Data Bank</td><td>Berman et al., 2000-PDB</td><td></td> <td>ID: 1NPE</td></tr></tbody></table>

小角 x 線散乱による溶液中の高分子の構造研究

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

複数の球状ドメインを持つタンパク質を含むタンパク質間相互作用は、どのような複合体のフォームと、どのようにドメイン指向位置を決定するための技術課題を提示します。ここでは、第一原理計算モデルを用いた多成分系である特定のドメインの仲介する相互作用を解明するため潜在的なプロトコルが記述されています。高分子とそのアセンブリの溶液構造を計算するこの方法は x 線小角散乱 (SAXS)、クロマトグラフィー、およびハイブリッド アプローチで一緒に原子分解能の構造からのデータを統合することを含みます。具体的な例は、フルレングス nidogen 1、細胞外マトリックス蛋白質を組み立てると拡張、湾曲したナノ構造の複合体のことです。その球状ドメインの 1 つにラミニン γ-1、基底膜の構造をアタッチします。これは柔軟なマルチ ドメイン蛋白質複合体の正確な構造を決定するための基礎を提供、自動化ロボットとサイズ排除クロマトグラフィー システムと相まってシンクロトロン源によって可能です。これにより、迅速分析直前の小角 x 線散乱データ コレクション複数のオリゴマー状態が区切られています。分析には、半径の旋回、粒子分子形状寸法とドメイン間のペアリング情報が得られます。また構成タンパク質の高分解能構造のあてはめによる複合体の 3 D モデルを生成するためのプロトコルであります。

上記データの分析アプローチに nidogen 1、ラミニン γ-1、およびP(r) 関数を使用して、複雑なのRgとD をmaxの計算に利用されました。私たちはそれぞれ 7.20 (に対してプラス マイナス 0.10) nm、8.10 (±0.20) nm nm まで (± 0.4) 10.9 nidogen 1、ラミニン γ 1 と、複雑なRg値を得られる (図 2 aB)。さらに、24 のD最大値 26 nm nm と 35 nm の nidogen 1、ラミニン γ-1、および、複雑なのためそれぞれ (図 2)10を得た。Nidogen 1 およびラミニンの低解像度構造を取得する DAMMIF プログラムを用いて γ 1、両蛋白質がソリューションで拡張形状を採用することが示唆されました。Nidogen-1 (~ 1 と 0.8) とラミニン γ 1 のXと NSD 値 (~0.9 および 0.8 それぞれ) も許容範囲内であった。高分解能構造体の配置、nidogen 1 の 2 つのドメインとラミニン γ - 1, 小角 x 線散乱を用いて低解像度構造に 2 つの N 末端と C 末端領域10の識別を使用できます。
Nidogen 1 はラミニン γ 139,40の相互作用パートナーとして識別され、相互作用のサイトは、C 末端ドメイン41x 線結晶構造解析を利用したマップされました。ただし、高分解能の構造が関与するは、フルレングスの nidogen 1 や全体ラミニン γ 1 アームではなく、相互作用するドメインのみ。したがって、複雑な含む nidogen-1 (全長) と両蛋白質の N 末端領域の相対的な回転方向を研究する相互作用の地域を識別するラミニン γ 1 腕を精製しました。複合体の小角 x 線散乱データをもたらした、 Rg 10.9 (± 0.4) nm と、 Dmaxの 35 nm。我々 は確かに、両蛋白質の C ターミナル地域のみに参加することの相互作用を仲介するドメインの残りの部分は、遠く離れてお互いに (に対し提案全体の複合体の低解像度の構造を取得する MONSA を利用図 3、ビデオ 1)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58538/58538fig1.jpg"> 図 1.小角散乱によるセットアップの模式図。高エネルギー x 線の露出に続いて生体分子やその複合体の単分散製剤を用意しています。ソース (例えば、社内対放射光)、x 線の源の距離にサンプルのエネルギーによって異なります。X 線の散乱パターン (つまり生体分子の形とサイズに依存します) を記録および放射状の散乱角度に関して散乱光の強度に関する情報が含まれています 1 次元プロット (1 D) を取得する平均します。バッファーの分子はまた光が散乱、興味の分子の散乱パターンを取得するこれらの分子からの貢献が減算されます。また通常のラインでサイズ排除/高速クロマトグラフィーを使用して新たに浄化手順の実行シンクロトロン小角 x 線散乱データの収集前に (トップ ビュー)。この手順は、コンプレックスから任意の非連結の生体分子を削除する同様、総計及び/又は劣化の製品を削除する重要です。1 次元の散乱プロットは、回転半径と生体分子の最大粒子寸法を提供する電子対距離分布図 (P(r) プロット) に変換されます。このプロットは場合の生体分子、または他のパッケージ (すなわちSASREF/コーラル) 低解像度構造を取得する、経験的モデリング パッケージ (すなわちDAMMIN/DAMMIF) の入力ファイルとして使用の部分の高分解能構造生体分子や複合体の個々 の生体分子が知られています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58538/58538fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58538/58538fig2.jpg"> 図 2 。(A) 散乱角散乱光対の強さのプロット (q = 4πsinθ/λ、nm-1) の生体分子 (低域) と生体分子の形状 (高域) 品質を示唆しています。(B) 電子対距離分布P(r) 散乱データから決定は、捜査 (ラミニン γ 1、nidogen-1、および、複雑な) 生体分子の細長い形状をお勧めします。(C) Kratky プロットを示唆その nidogen 1 とラミニン γ 1 蛋白質は展開ではありません。(Nidogen-1、ラミニン γ - 1 D) Guinier プロットと、複雑な低散乱角度データを用いた旋回半径の決定のための線形領域を示します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58538/58538fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58538/58538fig3.jpg"> 図 3.Nidogen-1 とラミニン γ-1 プログラム MONSA を使用してマージされたデータの解析によって得られた複合体の低解像度の構造。配色パターンは、図 2と同じです。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58538/58538fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Movie 1" src="/files/ftp_upload/58538/58538movie1.jpg"> ビデオ 1。Nidogen 1 およびラミニンの低分解能の構造 γ 1 複雑。この映画は、複合体の様々 な構造的特徴を視覚化するソフトフェアを使用して準備されました。ラミニン nidogen 複合体の結晶構造 (PDB ID: 1NPE)、この複雑なサイト相互作用する強調表示リボン漫画として表示されます。配色パターンは、図 2と同じです。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58538/complex_movie.mpg" target="_blank">してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)</a>

ここでは、小角 x 線散乱 (SAXS) を高分子の構造を表す低解像度の封筒に情報を取得する利用できる方法を提案します。X 線結晶構造解析や核磁気共鳴などの高分解能構造技術と組み合わせて使用すると、小角はマルチ ドメイン蛋白質および高分子複合体の溶液に詳細な洞察力を提供できます。

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

この方法は、生体分子とその複合体の大きさ、形状、立体構造の変化などの生化学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、生体分子が安定している環境で生理学的に関連する緩衝条件下で実験を行うことができる点である。SAXSは、他の多くの生物物理学的および構造的生物学の方法に対する無料の技術です。SAXSとこれらの方法を組み合わせることで、構造ベースの治療薬の開発に役立ちます。この方法は生体分子複合体に関する洞察を提供することができますが、ナノパートシカルや薬物送達の椎骨の研究などの他のシステムにも適用できます。一般的に、この方法に新しい個人は、生の散乱データから低解像度構造に移動する、圧倒的で複雑なプロセスとして表示されるため、苦労します。この方法の視覚的なデモンストレーションは、生データから構造モデルを取得するためのデータ分析のパイプラインは、ソフトウェアの多くの異なるパッケージの使用を含むので、学習することが困難であるため、重要です。SAXS データ分析に役立つソフトウェア・パッケージがいくつかあります。これには、スキャッター、バイオエクスタスRAW、ATSASスイートが含まれます。このビデオでは、ATSAS プログラム スイートを使用して、生の SAXS データを分析する際に実行する一般的な手順の概要を説明します。開始するには、ATSAS プログラム・スイートをインストールしてロードします。PRIMUS/Qtプログラムを開き、メニューを開くオプションに移動します。ここでは、対象のデータファイルを最大13個選択します。データ ファイルは ASCII 形式である必要があり、最初の列は s ベクトル軸、2 番目の列は強度です。この手順をバッファのみのデータに対して繰り返し、このデータを 2 つ目の [ツール] メニューに挿入します。次に、[データ処理] ウィンドウに移動し、[減算] を選択します。これにより、目的の高分子からの散乱のみを表す減散曲線が生成されます。ギニエ解析を実行するには、まず、PRIMUS/Qt にロードされたバッファー減散乱曲線から開始します。次に、Primus Guinierウィザードを開くジャイロの半径をクリックします。この時点で、強度と散乱角度の自然対二乗角度を示すプロットが表示されます。ジャイロの予備半径を取得するには、コマンド プロンプト ウィンドウを見つけて、Autorg 関数を使用します。Autorg を押した後、上限を 1 つ上にクリックし、次に下に押して、プログラムに統計測定値を強制的に更新します。または、同じ開いているプロンプトをクリックし、前述と同じ方法でハイライト表示して複数のデータファイル名を選択して、複数のファイルを一度に入力します。クラッキー分析を開始するには、データ ファイル名をクリックして選択します。これにより、ウィンドウにデータがプロットされます。次に、[印刷] を選択します。次に、[プロット]ボタンの下で、[クラッキープロット]をクリックします。その結果、球状タンパク質はGALC-eanピークを表示し、展開されたタンパク質はピークの代わりに高原を表示し、ここに示すような双曲線プロットに似ています。プリムス/Qtの濃度ごとにデータを引いたデータを読み込みバッファが再度行いました。[処理] タブで[スケール]をクリックし、各曲線とiスケール数を調べます。検査の後、処理ウィンドウのマージボタンをクリックしてデータをマージします。距離分布プロットを生成するには、マージされたデータ曲線を PRIMUS/Qt にロードし、[解析]タブの[距離分布]をクリックします。マージされたデータのデータ範囲を調整して、生データの末尾で大きなノイズが発生しないようにします。また、低い範囲値を選択して数値を増やすことにより、低q領域のビームストップに近いデータ点を省略します。Dmax を決定するには、ギニエ解析から得られたジャイロ半径の 5 倍の範囲から開始します。次に、距離分布プロットが y 軸上で急激にゼロに落ちなくなり、長い尾がゼロに近づくまで、この値を徐々に小さくします。ギニエ近似と、旋回と強度数の距離分布半径から導出される、旋回対強度プロットの実験半径が類似していることを確認します。ここで、散乱光の強度は散乱角度に対してプロットして示され、生体分子のニドゲン−1、ラミニンγ−1およびそれらの複合体の両方の品質、ならびにそれらの形状を示唆している。散乱データから決定された電子対距離分布は、生体分子が細長い形状を有することを示唆しており、クラツキープロットは、データが高原に傾向がある、あるいはより大きなq範囲で増加し、ベル曲線形状を欠いているため、タンパク質が折り畳まれた状態にあることを示唆している。さらに、低散乱角でデータを使用するギニエプロットは、ニドゲン-1、ラミニンγ-1およびそれらの複合体についてここに示されているジャイロ半径の決定のための線形領域を示しています。タンパク質複合体を研究するために、MONSAはニドゲン-1ラミニンγ-1複合体全体の低分解能構造を得るために使用され、両方のタンパク質のC末端領域のみが媒介相互作用に関与しているのに対し、残りのドメインは互いに離れていることを示唆した。シンクロトロン放射の操作は非常に危険であり、各異なるビームラインによって概説された予防措置と安全性は、初期データ収集を行う際に必ず取られるべきだということを忘れないでください。

structural-studies-macromolecules-solution-using-small-angle-x-ray

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

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