ガラス化と地球温暖化の手順中に胚盤胞の行動の客観的評価のための形態のプロトコル

この形態測定プロトコルは、以前のガラス化介入および温暖化後の回復の間に胚盤胞収縮および再膨張の強度を監視することを可能にし、ウイルスガラス化方法の有効性に関する洞察を提供する。この技術の主な利点は、高度な画像編集ソフトウェアを備えたタイムラプス顕微鏡とコンピュータを備えた体外受精研究所に適用できることです。拡張の5日目または6日目には、少なくとも数個の内細胞塊細胞と凝集性の栄養計皮を有する胚盤胞を0.4~0.7ミリ秒のレーザーパルスに当て、直径4.3~9.4マイクロメートルの穴径を有する。

その後、ブラストコアを5分間完全または部分的に崩壊させます。次に、小さなピペットを使用して、タイムラプス顕微鏡と記録のために特別に設計された9ウェルシャーレのマイクロドロップレット領域の穴に平衡培地を無菌的に追加します。すべての培地を添加したら、マイクロドロップレット領域を約30マイクロリットルの平衡培地に重ね合わせます。

そして、マイクロドロップレット皿の1つのマイクロドロップレットウェルの底に平衡培地にレーザー処理された胚盤胞を沈めます。胚盤胞が移るとすぐに、カウントダウンタイマーを10分間開始します。そして、カメラ装備の顕微鏡のステージ上でマイクロドロペレット皿を転送します。

200 X倍率を使用して、マイクロドロペレット皿を調整して、胚盤胞が記録ウィンドウの中心近くになるようにします。そして、記録が開始されたカウントダウン時間を記録する顕微鏡記録ソフトウェアで記録を開始する。胚盤胞を貯蔵するには、胚をガラス化ストローにロードした後、ストローを密封し、80〜110秒の負荷の間に液体窒素に突っ込み、胚盤胞をマイナス196°Cに置く。

平衡期に監視された胚盤胞の断面積を測定するには、胚盤胞の端に触れるまでブラストシストの内側に素早く選択ツールマーカーを置き、左マウスボタンを繰り返しクリックして保持し、胚盤胞の断面積全体が選択されるまで胚盤胞の外側の縁を輪郭を描きます。次に、タイムラインウィンドウで、測定ログをクリックし、測定値を記録します。胚盤胞の再拡張のために、ガラス化胚盤胞を含むHSVストローを貯蔵から液体窒素充填されたポータブル貯留層に素早く移します。

そして、色付きのハンドリングロッドを露出させるのに十分な高さわらを持ち上げるために鉗子を使用してください。自己調整ワイヤーストリッパーを使用して、色付きハンドリングロッドの高さでストローをカットします。そして、迅速に制御された動きでわらからハンドリングロッドを抽出します。

すぐに37°Cの解凍溶液の容器にハンドリングロッドの湾曲したへらを突き落とします。そして、優しく胚盤胞を取り外すためにハンドリングロッドを渦巻きます。1分後、胚盤胞をシーケンシャルな4分間の浸漬液と希釈液で洗います。

洗浄液1、及び洗浄液2。次に、温めた胚盤胞を新鮮な回復培地を含む4つのウェルディッシュに移し、ピペットを使用して3滴の培地で胚盤胞を洗浄する。最後の洗浄後、胚盤胞を回復培地を含む9つのよくタイムラプス皿に移します。

そして、37°C、6%CO2と5%O2インキュベーターでタイムラプスカメラの下に9つの井戸料理を置きます。今、タイムラプス録画ソフトウェアを開き、録画カメラを選択します。ライブモードを選択し、画像上にカーソルを置きます。

スクロールして画像を拡大し、マウスの左ボタンを使用して、画面の中央に胚盤胞を含むウェルを配置します。焦点を合わせる下で、矢印を使用して胚盤胞の記録面を焦点を合わせ、光強度の下で画像の光強度を設定します。顕微鏡のパラメータをクリックして、露光時間とガンマを設定し、[閉じる]をクリックします。

[プロジェクトの開始] をクリックして、プロジェクト データを入力します。カルチャディッシュタイプを選択し、記録する料理以外のすべてのポジションのチェックを外します。次に、5分ごとに写真を撮るようにキャプチャタイミングを設定し、[承認]をクリックして、少なくとも150分間胚盤胞の再拡張を記録します。

この代表において、連続的に監視され、無傷の胚、無傷の胚盤胞は、平衡溶液中で完全に崩壊せず、平衡溶液への10分間の曝露後、元の大きさの約70%に再拡張した。これに対し、この人工的に崩壊した胚盤胞は、レーザー治療直後にブラストコアを完全に空にし、平衡溶液への10分間の曝露の間に有意な再膨張は認められなかった。高濃度の凍結保護剤を含むガラス化培地による処理の際、この平衡型胚盤胞は、ブラストコエルの段階的な減少を受けた。

温暖化後、回収培地に曝された際に再び拡大した。しかし、このレーザーパルス胚盤胞は、平衡またはガラス化ステップ中に回収されなかったレーザーによる治療時にブラストコアの即時崩壊を示し、崩壊した胚盤胞に対してこのような長い平衡段階の必要性を疑問視した。このプロトコルはまた、胚盤胞が温暖化後に胚芽球を回復する能力に関する洞察を与える。

例えば、加温後の芽球再膨張は、線形であり得る、またはいくつかの大きいまたはより小さい収縮で中断することができる。この手順を試みる間、胚は記録中にシャーレの底にできるだけ少ない時間を残さなければならないことを覚えておくことが重要です。高濃度の凍結保護剤は胚にとって有毒である可能性があることを忘れないでください。

各開発の後、この技術は、凍結生物学の分野の研究者が体外受精プログラムにおける凍結保存プロトコルの有効性を探求する道を開いた。