腎糸球体と腎糸球体細胞表面タンパク質の標識体内の分離
January 18th, 2019
ここでマウスの体内でビオチンと腎糸球体細胞表面タンパク質のラベリングのためのプロトコルを提案する.このプロトコルは、マウス腎臓の灌流、腎糸球体に分離および興味の蛋白質の内因性の免疫沈降を実行する方法について説明します。
この方法は、タンパク尿性腎臓病ではなくタンパク尿性における細胞表面タンパク質の人身売買の役割に関する腎臓学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、生体内での細胞表面タンパク質の密売の研究を容易にし、実験ごとに複数のタンパク質を分析できることです。この方法は糸球体細胞表面の人身売買に関する洞察を提供することができるが、また、浸透し、分離技術によってアクセス可能である他の器官系に適用することができる。
つまみつまみへの応答の欠如を確認し、麻酔マウスの腹側を70%イソプロピルで消毒することから始めます。骨盤から胸骨まで皮膚を切り抜け、ピンセットを使って腹部筋膜から皮膚を取り除きます。腹部の中線の両側の皮膚を切断し、膀胱からxiphoidに腹筋層を通して媒体を作る。
はさみと鉗子を使用して筋肉を4つの象限に分割し、2つの外科用クランプを使用して動物の首に向かって上の2つの象限を固定します。動物を解剖顕微鏡の下に置き、無菌スワップを使用して内臓を脇に移動します。細かいはさみを使用して、肝腎靭帯を切断します。
細かい外科用ピンセットを使用して、腎動脈の肝性腸間膜動脈発膜の周りに1つの縫合を置く。そして大動脈の周り, 腎動脈に近位, 副腎で.鼻隠しから遠位大オルタを解放します, 脂肪や他の組織.
次に、分岐の高さで大動脈と大動脈を包み込み、腎動脈の大動脈遠位の周りに別の縫合を配置する。ピンセットを使用して近位大動脈縫合を引き締め、血流を減衰させ、大動脈の直径の半分を大動脈に小さな穴を切断し、腎動脈に遠位する。5ミリリットルの氷冷PBSとカルシウムとマグネシウムを含む10ミリリットルのシリンジに取り付けられた10センチメートルのカテーテルを大間に挿入します。
そして、準備された合字でカテーテルを固定します。その後、毎分流量2ミリリットルで腎臓を浸透させ始める。細かいはさみを使って腎動脈の腎静脈に穴を開け、肝および腸間膜動脈の周りの縫合を引き締める。
PBSの全容が配信された後、パーフューズを5ミリリットルの氷冷PBSに加え、表面標識用のミリリットルビオチンあたり0.5ミリグラムを補ったカルシウムとマグネシウムに置き換えます。毎分流速2ミリリットルで腎臓を浸透させ続ける。全容が送達されたら、5ミリリットルの氷冷PBSに加えて、100ミリモルグリシンを添加したカルシウムとマグネシウムをカテーテルに含む注射器をカテーテルに取り付けます。
グリシン溶液の5ミリリットルすべてを毎分流量2ミリでグリメルリをクエンチする。その後、5ミリリットルの氷冷PBSに加えて、カルシウムとマグネシウムを1ミリリットル当たり200マイクロリットルの磁気ビーズで1分2ミリリットルの流量で腎臓に浸透させます。褐色の磁気ビーズによる糸球体の塞栓は腎臓表面に見える。
すべてのビーズが配信されたら、腎臓のカプセルを取り除き、ヒラムで腎臓を収穫します。15ミリリットルのPBSとカルシウムとマグネシウムを含む10センチメートルの細胞培養皿に腎臓を入れます。新しい両刃の刃を使用して、腎臓を可能な限り小さな部分に切ります。
コラゲターゼA1ミリリットルを含む2ミリリットルのチューブに30分間摂氏37度で組織を移し、消化前後の組織溶液を修正された1000マイクロリットルピペットチップと穏やかに混合する。インキュベーションの終わりに、100ミクロンの細胞ストレーナーを通して消化された組織をフィルター処理する。細胞スクレーパーと氷冷PBSに加えて、カルシウムとマグネシウムを使用して、残りの組織を細胞ストレーナーを通してつぶします。
新鮮な氷冷PBSプラスカルシウムとマグネシウムで腎臓単細胞懸濁液の最終量を最大50ミリリットルにし、遠心分離によって腎臓細胞を収集します。上澄み液を取り除き、1.5ミリリットル未満の氷冷PBSとカルシウムとマグネシウムでペレットを再中断し、糸球体懸濁液を新しい2ミリリットルチューブに移します。糸球体を洗うために、チューブを磁石に入れ、糸球体を凝集します。
1分後、上清を取り除くために1000マイクロリットルのピペットを使用してください。そして、磁石からチューブを取り外します。組織にPBSとカルシウムとマグネシウムの1ミリリットルを追加します。
糸球体を1回上下にピペットし、細胞を渦巻く。マグネットにチューブを戻し、ちょうど実証したように、グロメルリをもう一度洗います。試料純度が40〜100倍倍での光顕微鏡分析により少なくとも90%に達するまで。
次いで、遠心分離により精製糸球体を精製した磁気ビーズを回収する。95%以上の純度を達成するためには、糸球体は実証したように十分に洗浄する必要がありました。ビオチン灌流は、ビオチンの毛細管ループの標識を容易にするが、制御された浸透マウス腎臓を促進しない。
糸球体抽出物のビオチン分画の免疫沈殿は、糸球体膜貫通タンパク質ネフリンおよびポドカリキシンがビオチンで免疫沈降するが、対照画分ではないことを明らかにする。ストレプトアビジンによる免疫沈降分の染色は、浸透したビオチン中のビオチンの沈殿したネフリンの存在をさらに確認するが、浸透した動物を制御しない。血管内皮内膜内皮内膜内接着分子2と内皮内タンパク質もビオチン画分内で免疫沈降する。
腎毒性腎炎の初期段階では、細胞表面の減少した発現は、コントロールと比較して腎毒性腎炎動物で観察される。確かに密度分析は、コントローラーと比較して腎毒性腎炎動物におけるビオチンのラッドネフリンの有意な減少を示す。全腎リンとアクチン比の定量分析は、マウスのコントロールと腎毒性性腎炎との間に有意な差がないことを明らかにしている。
さらに、同量のポドサイトが腎毒性腎炎および対照動物において観察される。後期腎毒性腎炎では、腎毒性のネフリティック動物は、コントロールマウスとネフロー毒性ネフリティックマウスとネフロー中毒性ネフリンマウスの間で測定した細胞表面ネフリンに有意な差がなく、ネフリン発現の回復を示し、ネフロー毒性ネフリティック動物の全体的な全ネフリン減少を示す。また、制御動物に比べてポドサイト数が減少する。
この手順を試みる間、糸球体の空気塞栓症を避け、腎臓灌流が始まったら氷冷状態で働くために、接続中に注射器の泡を自由に保つことを忘れないでください。この手順に従って、糸球体RNAおよびタンパク質の単離のような他の方法は、健康で病気の腎臓におけるタンパク質発現または相互作用に関する追加の質問に答えるために行うことができる。
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概要
この記事では、ビオチンを用いてマウスの糸球体細胞表面タンパク質のin vivoマーキングを行うプロトコルを紹介します。マウスの腎臓の灌流、糸球体の単離、免疫沈降の実行手順を詳しく説明します。
主要な研究構成要素
科学分野
- 腎臓学
- 細胞生物学
- タンパク質トラフィッキング
背景
- 細胞表面タンパク質トラフィッキングの理解は腎臓病研究において重要です。
- この方法は様々な器官系に適用できます。
- 1回の実験で複数のタンパク質を分析できます。
- in vivo研究はin vitro法では不可能な洞察を提供します。
研究目的
- 腎臓病における細胞表面タンパク質トラフィッキングの役割を調査すること。
- 糸球体タンパク質を研究するための信頼できるプロトコルを開発すること。
- タンパク尿性および非タンパク尿性腎臓疾患の理解を深めること。
使用した方法
- マウスの腎臓をビオチンで灌流すること。
- 腎臓から糸球体を単離すること。
- 標的タンパク質の内因性免疫沈降。
- マウスの麻酔および手術準備の確認。
主要な結果
- このプロトコルは糸球体細胞表面タンパク質を正常にマーキングします。
- 複数のタンパク質を同時に分析できます。
- タンパク質トラフィッキングメカニズムに関する洞察が得られました。
- この方法は他の器官系にも適応可能です。
結論
- このプロトコルは腎臓学研究に貴重なツールです。
- in vivoでのタンパク質トラフィッキング研究のためのフレームワークを提供します。
- 将来の研究では他の疾患への応用を拡大できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Studying glomerular cell surface protein trafficking in vivo provides mechanistic insights into kidney disease pathogenesis, supporting target validation in nephrology. This method enables semi-quantitative analysis of surface protein abundance under physiologic and pathophysiologic conditions, enhancing predictive confidence in preclinical models. It facilitates biomarker discovery and pathway clarification relevant to proteinuric disorders.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by tracking cell surface protein dynamics in intact glomeruli.
- Operational Value: Supports functional target validation through direct observation of nephrin and podocalyxin trafficking in disease models.
- Predictive Value: Provides quantitative readouts for assessing target engagement and pathway modulation in vivo.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates purified glomerular fractions suitable for downstream immunoprecipitation and protein interaction analysis.
- Reproducibility: Standardized perfusion and magnetic bead isolation yield consistent glomerular preparations across experiments.
- Multiplex Capability: Allows simultaneous analysis of multiple surface proteins per experiment, increasing screening efficiency.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Captures dynamic changes in nephrin expression during early and late phases of nephrotoxic nephritis.
- Translational Continuity: Links in vivo protein trafficking observations to podocyte loss and disease progression.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed protein changes reflect surface trafficking versus total expression shifts.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation to preclinical evaluation by providing functional, in vivo data on glomerular protein behavior.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on protein trafficking mechanisms in kidney disease models.
- Screening: Delivers quantitative, biotin-dependent immunoprecipitation outputs for comparing protein surface exposure.
- Analytics: Enables semi-quantitation of glomerular cell surface abundance via streptavidin-based detection.
- Translational Research: Connects surface protein dynamics to histologic and functional outcomes in nephritis models.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other perfused organ systems, supporting cross-indication target validation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by distinguishing surface trafficking from total protein expression changes.
- Operational Value: Standardized perfusion and isolation workflows improve reproducibility across laboratories.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by revealing target accessibility and modulation in physiologic contexts.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on in vivo surface protein behavior.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine surgery, vascular perfusion, and tissue dissection under sterile conditions.
- Dependent on perfusion equipment, magnetic separation tools, and immunoprecipitation reagents.
- Necessitates standardization of biotin perfusion timing, flow rate, and quenching steps for consistent labeling.
- Adaptation to other organ systems requires validation of accessibility and perfusion efficiency.
- Practical limitations include tissue fragility during digestion and the need for high-purity glomerular isolation (>95%) for reliable downstream analysis.
