Name: 浄化、体外(p) ppGppクロストリジウム ・ ディフィシルから合成酵素の活性 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: 学ぶ ヒスチジンタグ付きピロホスホキナーゼ酵素の精製と薄層クロマトグラフィーによる活性評価法。Clostridium difficile由来の酵素動態解析に適用可能で、リン酸転移反応の研究に有用です。

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この作品は、NIAID 1K22AI118929-01 によって賄われていた。EBP はオールド ドミニオン大学、ノーフォーク、バージニア州、アメリカ合衆国での調査のオフィスから夏研究フェローシップ プログラム助成金によって支えられました。

1. 誘導ヒスチジン付けられた蛋白質過剰発現
<ol><li>Difficile C. R20291 ゲノム DNA からrshを増幅します。<ol>
<li>高品質なポリメラーゼを使用し、製造元の指示に従ってください。</li>
		<li>C. ディフィシル rshのプライマーを用いて増幅します。 rsh_F (カリフォルニア州GGTACCGGTTATATGCATGATAAAGAATTACAAG) と rsh_R (CCCTGCAGCTAATGGTGATGGTGATGGTGATTTGTCATTCTATAAATAC)、C 末端 hexahistidine タグを紹介します。 注: KpnI とプライマー シーケンス内のサイトをカット PstI は、太字で表示されます。</li>
		<li>Pstl、KpnI 制限 45 分の 37 ° C でサイトをカット pMMBneo ベクトルとrsh his6 PCR の製品を消化します。</li>
		<li>一直線に並べられたベクトルと agarose のゲルの電気泳動および DNA ゲル抽出キットのそれに続く浄化による PCR のフラグメントを浄化します。</li>
		<li>280 nm の吸光度 (280) ベクターと増幅 PCR の製品を測定します。式を使用して<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58547/58547eq1.jpg">各 DNA 断片の DNA 濃度を決定します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>式の pMMBneo にrshを縛る。<ol>
<li>消化 PMMBneo ベクトル、125 の結合 25 ng rsh his6遺伝子産物、リガーゼ バッファー x 10 の 2 μ、1 μ L の DNA のリガーゼの ng。ヌクレアーゼ フリー水を使用すると、20 μ L に容量を調整できます。16 h 16 ° C で孵化させなさい。 注: 結紮術の有効性フラグメントのサイズに依存し、製造元プロトコルに基づいて調整する必要があります。</li>
		<li>大腸菌dh 5 位 α またはプラスミッド メンテナンス系統別recA -結紮のベクトル積に変換します。100 μ g/mL カナマイシンと LB の版に変換されたセルを選択し、37 ° C で 16-24 時間インキュベート</li>
		<li>変換プレート (s) から 4 つのコロニーをピックアップし、それぞれの DNA の隔離のための 100 μ g/mL カナマイシンを含む新鮮なプレート上を連勝します。16-24 h 37 ° C で新しい板をインキュベートし、後続の蛋白質の表現の 1 つの分離を選択します。</li>
		<li>そのままrsh蛋白質コード領域の結紮を確認するには、水の 20 μ L を選択したの植民地に分離の選択は 10 分 95 ° C で熱し、確証的遺伝子を増幅するために使用同じプライマーを用いた PCR のテンプレートとして使用します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>高収量タンパク質生産のためのエシェリヒア属大腸菌BL21 システムにエシェリヒア属大腸菌細菌プラスミドの変換のための標準的な変形のプロトコルに従って検証されたプラスミドを変換します。</li>
	<li>エシェリヒア属大腸菌の RSH His6 を表現します。<ol>
<li>PMMBneo で形質転換大腸菌BL21 の単一コロニーを選択::rshと 50 μ g/mL カナマイシンと LB 培地 2 mL を接種します。37 ° C で 12-16 h 250 rpm で揺れながら。</li>
		<li>一晩かけて培養細胞増殖とタンパク質発現のための 0.5 mL で 50 μ g/mL カナマイシンを含む LB 培地 500 mL に接種します。</li>
		<li>37 ° C でインキュベーター シェーカー 250 rpm 式文化をインキュベート細胞密度、外径600 0.167 37 ° c に達するまで</li>
		<li>30 ° C にインキュベーター温度を減らし、培養温度をドロップするための 30 分を待ちます。</li>
		<li>0.5 mM の最終的な集中にイソプロピル β-D-thiogalactoside (IPTG) を追加することで RSH 式を誘導します。250 rpm で揺れ、30 ° C で一晩 (16-18 h) のための場所を取るに誘導を許可します。</li>
		<li>4 ° C で 30 分間 3,080 × g で遠心分離によってペレットします。 メモ: ペレットは、蛋白質収量や酵素活性の顕著な損失なし翌日ターゲット蛋白質を浄化するための-20 ° C で一晩保存できます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2 ニッケルのアフィニ ティー ・ クロマトグラフィーによって蛋白質の浄化
注: は、直接細胞ライセートを明確にした下記タンパク質精製の手順に進みます。格納する明らかに 4 ° C にて一晩後続タンパク質精製蛋白質収量が減少するため。
<ol><li>重力列に 1 mL のニッケル-Nitriloacetic 酸 (Ni NTA) 樹脂を使用して蛋白質を浄化します。<ol>
<li>前日に使用、2 mL の平衡バッファー (10 mM トリス塩酸 pH 7.79、300 mM の NaCl、50 mM NaH2PO4、0.5 mg/mL リゾチーム、MgCl25 mM、10 mM のイミダゾール、0.25 mM DTT、5 mM phenylmethane スルホニル 4 ° C で一晩コラムを平衡させフッ化物 (PMSF) 10% グリセロール)。</li>
		<li>次の日は、列をもたらす明らかにしを読み込む前に RT 4 ° C からライセートとそれの略 ~ 2-3 h。 注: は、列内で形作る空気泡を避けるために重要な熱平衡に列をもたらすことです。</li>
		<li>換散バッファー (10 mM トリス塩酸 pH 7.8, 5 mM MgCl2、50 ミリメートル NaH2PO410% グリセロール、0.5 mg/mL リゾチームの 300 mM NaCl、10 mM のイミダゾール、0.25 mM DTT と 5 mM PMSF) の 1.3.6 のステップで得られたペレットを再懸濁します。</li>
		<li>8 x 10 の間隔、30 を一時停止するため氷の上細胞を超音波パルス間 s。</li>
		<li>遠心機を使用しての 4 ° C で 30 分間 3,080 × g で遠心分離によってライセートを明確に。</li>
		<li>換散バッファーの平等なボリューム lysate を準備し、適用、準備中の列に lysate を明らかにし、フローを介して収集します。</li>
		<li>ライセート フロースルー列とセカンダリの流れを通して収集する適用を明らかに。</li>
		<li>洗浄バッファー 1 (10 mM トリス-HCl (pH 7.79) 300 mM 5 mM MgCl2、50 ミリメートル NaH2PO4、30 mM のイミダゾール 10% グリセリン, 塩化ナトリウム) を洗い流します。流れを収集します。 注: 5 mM MgCl2洗うと溶出バッファー内の介在物は浄化された蛋白質の酵素の活動のために重要。</li>
		<li>洗浄バッファー 2 (トリス-HCl (pH 7.79) 300 mM NaCl、5 mM MgCl2、50 ミリメートル NaH2PO4と 50 mM のイミダゾール 10 mM) を洗い流します。流れを収集します。</li>
		<li>2 mL の溶出バッファー (トリス-HCl (pH 7.79) 300 mM 塩化ナトリウム、NaH2PO4、50 ミリメートル 10% グリセロールと 75 mM のイミダゾール 10 mM) を適用します。1 mL の 2 つの分数のフロースルーを収集します。 注: この手順後カラムは、同じタンパク質は次の浄化法で浄化される場合、4 ° C で平衡バッファーに格納します。列は、適切に保存されている場合 3 回まで使用できます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>SDS-PAGE による純度の列の分数を評価します。<ol>
<li>蛋白質の浄化の質的評価、170 V で 60 分 4/10% ポリアクリルアミドゲルの列のすべての分数の 20 μ 因数を実行します。</li>
		<li>5 h、ベンチトップ ロッカーに穏やかに揺れるため室温で 0.1 %coomassie 青いゲルの汚れ。</li>
		<li>40% メタノール、ベンチトップ ロッカーの揺動、室温で一晩 10% 氷酢酸で脱色します。 注:図 1の代表的なゲルの写真です。</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dialyze 4 ° C で一晩 2 画分を溶出<ol>
<li>1 mL の透析装置を用いた 20 kDa の分子量カットオフ (MWCO) 200: 1 の比率で透析バッファー (15.7 mM トリス-HCl (pH 7.6), 471.9 mM NaCl、15.69 mM MgCl2、1.57 mM DTT、1.5 mM PMSF、15.7% グリセロール) に対して dialyze します。</li>
		<li>280 で吸光度を測定することにより透析蛋白質のサンプルの濃度を決定する nm と計算される分子吸光係数 82085 M-1cm-1 20を使用しています。</li>
		<li>使用するまで因数-80 ° C で透析の蛋白質のサンプルの 5 μ 因数を格納します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 薄層クロマトグラフィーによるタンパク質活性測定法
<ol><li>薄層クロマトグラフィーのプレートを準備します。<ol>
<li>反応を実行する、前に準備ポリエチレンイミン (PEI)-脱イオン水洗浄によるセルロース板。~0.5 cm の深さに二重蒸留水とガラス室でプレートを配置します。</li>
		<li>プレートの上部に移行するために水を許可します。 注: 皿を洗うプレートがないとされることがありますが、洗濯は、結果の画像の鮮明さを向上は、厳密に必要はありません。さらに 2 つの垂直方向に板を洗浄により任意の汚染物質を樹脂の存在がプレート (図 2) の一角に分離されます。</li>
		<li>ガラス室からプレートを持参し、一晩の乾燥 (12-18 h) する卓上ラックに残します。</li>
		<li>サンプルを TLC に適用されますを示す柔らかい鉛筆で 1 つの端から 2.0 cm 乾板をマークします。2 μ L サンプル、適用サンプル 1.0 cm 以上離れて (図 2)。 メモ: これは信号定量化のために重大である隣接するスポット間の明確な分離をできます。セルロース樹脂は傷、小さい限り、表面に鉛筆マークが溶媒の移行を妨げない。</li>
		<li>実験を計画するときは、常に未使用各プレートに 1 つのスポットを残します。 注: これはサンプルの定量化 (図 2) の空白のレーンを提供します。20 cm TLC プレート、19 点のための部屋があります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>酵素活性測定法<ol>
<li>50 mM トリス-HCl (pH 7.5) 25 mM 10 mM KCl、1 mM DTT と 0.6 mM ATP 酢酸アンモニウムを含む 5 x バッファー ミックスを準備します。 注: このミックスが大量に用意して、後で使用のための 10 の μ 因数で冷凍します。複数の凍結融解にミックスを与えないでください。</li>
		<li>3 μ M 1.2 mM MgCl21 x バッファー ミックス、0.6 mM、GDP、RSH を含む個々 の反応を準備します。Γ -32P ATP 反応の 10 μ L あたり 1.0 μCi を追加し、ヌクレアーゼ フリー水を使用して適切なボリュームまで反応をもたらします。ヌクレオチドを含むミックスに RSH の添加酵素活性アッセイを開始、他の成分が混合されている後に、RSH を追加します。 メモ: 最終的な反応体積が縦長サンプリングの数によって異なります。2 μ L/timepoint のサンプル、各 4 縦長の反応混合物の 10 μ L をアセンブルしてください。</li>
		<li>汚染のヌクレアーゼ活性からの ATP 加水分解を制御するには、タンパク質を含まない 10 μ L 反応を組み立てるし、並列で孵化します。T で 2 μ L のサンプルを見つける = 0 と ATP を蛋白質の不在でなく加水分解したことを確認するための実験の終わりに。</li>
		<li>RSH の追加が、直ちに 2 μ L と t としてラベル付けされた PEI セルロース プレート上にスポット 0 分サンプルを =。</li>
		<li>必要な縦長で 2 μ 因数を取り外し、37 ° C で反応を孵化させなさい。 注: 酵素活性はサンプルはセルロース プレートに吸着したときに停止します。最後のスポット完全な吸着とサンプルの乾燥を確実に開発する前にプレートを追加した後は、10-30 分を待ちます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>薄層クロマトグラフィー<ol>
<li>クロマトグラフィーのチャンバーを 1.5 M 1.5 M KH2PO4 (pH 3.64) 0.5 cm の深さに。 注意: ボリュームがクロマトグラフィー タンクの寸法によって異なりますが必要があります。曲げず TLC プレートの挿入を許可するように十分な幅がレベル下で任意のガラス容器は、カバーの添加による現像槽として使用可能性があります。TLC プレートは、プラスチック フィルムで覆われているガラス ビーカーでの開発を可能にするきれいな黒人と狭いストリップにカットできます。</li>
		<li>溶媒中でプレートの下端を浸します。プレート (〜 90 分) の上部に移行すること。 注意: 溶剤移行はプレートの上部に停止しますが、サンプルは失われたまたはより長い液浸の間に一緒に実行されません、プレート残さないように溶媒中で一晩。バッキング プレートからデタッチし、信号の損失につながる樹脂はめ込み 4 h よりも長い可能性があります。</li>
		<li>クロマトグラフィー タンクからプレートを削除し、卓上型物干しラックの上に置きます。</li>
		<li>空気にプレートを一晩で乾燥できます。 注: は、ヘアー ドライヤーを使用して加速されることがあります乾燥します。乾燥は、濡れたとき暗くなります樹脂および完全に乾く未使用プレートの色に戻るの色によって評価できます。</li>
		<li>プレートを乾燥後、イメージングのカセットへの放射性物質の転送を避けるために、(図 3) オートラジオグラフィーによって分析プラスチック フィルムでプレートをラップします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>データ分析<ol>
<li>室温で 4 h 用 phosphorimager カセットに区切られた反応を含む PEI セルロース プレートを公開します。 注: これは示された新鮮な γ-32P ATP 濃度を使用して非常に明確なイメージを生成するための十分な露出です。放射性標識基板の下の量を使用する場合 12-16 h に露光時間を増やせます。</li>
		<li>画像は phosphorimager のカセット。</li>
		<li>イメージング ソフトウェアを使用すると、グラフィカル ユーザー インターフェイスと、四角形の描画を選択して長方形・ ロワ (図 3 車線内に約 1 つの全体の車線および ATP と ppGpp スポットを描画するマウスを使用して関心領域 (Roi) を描く).</li>
		<li>選択、コピー、および貼り付けコマンド (または使用しているイメージング ソフトウェアに基づいて対応するコマンド) を使用して、Roi は、各レーンの同一エリア内の信号を測定できるように他の車線内で同一・ ロワを描画します。空白として使用される未使用レーンから Roi を含んでいます。</li>
		<li>分析、を使用して |ツール |ROI マネージャー |追加イメージング ソフトウェアのコマンドは PEI セルロース プレートに描かれた陰影のすべてを選択します。</li>
		<li>分析、を使用して |測定の設定 |メジャーコマンド、各 ROI 内の信号強度を定量化し、測定値をスプレッドシート (図 3) としてエクスポートします。実験的信号から空白の ROI 値を減算します。</li>
		<li>ATP と ppGpp の数式を使用に起因する各車線内でブランク信号の割合を計算します。<img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/58547/58547eq2.jpg"> 注: ・ ロワ描かれるかもしれません、商用ソフトウェア、phosphorimager と互換性のあるまたは自由に利用できる ImageJ ソフトウェア (健康の国民の協会) を使用して量的に表わされます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Cheek, S., Ginalski, K., Zhang, H., Grishin, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+update+of+the+sequence+and+structure+classification+of+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">A comprehensive update of the sequence and structure classification of kinases.</a> BMC Structural Biology. 5 (1), 6(2005).</li>
<li>Porath, J. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/104659289290001d">Immobilized metal ion affinity chromatography.</a> Protein Expression and Purification. 3 (4), 263-281 (1992).</li>
<li>Arnau, J., Lauritzen, C., Pedersen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+strategy%2C+production+and+purification+of+proteins+with+exopeptidase-cleavable+His-tags%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Cloning strategy, production and purification of proteins with exopeptidase-cleavable His-tags.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2326-2333 (2006).</li>
<li>Porath, J., Carlsson, J., Olsson, I., Belfrage, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metal+chelate+affinity+chromatography%2C+a+new+approach+to+protein+fractionation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation.</a> Nature. 258 (5536), 598-599 (1975).</li>
<li>Smith, M. C., Furman, T. C., Ingolia, T. D., Pidgeon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chelating+peptide-immobilized+metal+ion+affinity+chromatography.+A+new+concept+in+affinity+chromatography+for+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Chelating peptide-immobilized metal ion affinity chromatography. A new concept in affinity chromatography for recombinant proteins.</a> Journal of Biological Chemistry. 263 (15), 7211-7215 (1988).</li>
<li>Graslund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+production+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein production and purification.</a> Nature Methods. 5 (2), 135-146 (2008).</li>
<li>Booth, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+an+N-terminal+Polyhistidine+Tag+on+Protein+Thermal+Stability%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Omega%22%5BJournal%5D)">Impact of an N-terminal Polyhistidine Tag on Protein Thermal Stability.</a> ACS Omega. 3 (1), 760-768 (2018).</li>
<li>Thielges, M. C., Chung, J. K., Axup, J. Y., Fayer, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+histidine+tag+attachment+on+picosecond+protein+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Influence of histidine tag attachment on picosecond protein dynamics.</a> Biochemistry. 50 (25), 5799-5805 (2011).</li>
<li>Chaga, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Twenty-five+years+of+immobilized+metal+ion+affinity+chromatography%3A+past%2C+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemical+and+Biophysical+Methods%22%5BJournal%5D)">Twenty-five years of immobilized metal ion affinity chromatography: past, present and future.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 49 (1-3), 313-334 (2001).</li>
<li>Ma, H., Deacon, S., Horiuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+challenge+of+selecting+protein+kinase+assays+for+lead+discovery+optimization%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+opinion+on+drug+discovery%22%5BJournal%5D)">The challenge of selecting protein kinase assays for lead discovery optimization.</a> Expert opinion on drug discovery. 3 (6), 607-621 (2008).</li>
<li>Tamayo, R., Tischler, A. D., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+EAL+domain+protein+VieA+is+a+cyclic+diguanylate+phosphodiesterase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The EAL domain protein VieA is a cyclic diguanylate phosphodiesterase.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (39), 33324-33330 (2005).</li>
<li>Purcell, E. B., McKee, R. W., McBride, S. M., Waters, C. M., Tamayo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+Diguanylate+Inversely+Regulates+Motility+and+Aggregation+in+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Cyclic Diguanylate Inversely Regulates Motility and Aggregation in Clostridium difficile.</a> Journal of Bacteriology. 194 (13), 3307-3316 (2012).</li>
<li>Purcell, E. B., Tamayo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+cyclic+nucleotide+phosphodiesterases%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of cyclic nucleotide phosphodiesterases.</a> Methods in Molecular Biology. 1016, 235-243 (2013).</li>
<li>Ross, P., et al. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0008621500903720">Control of cellulose synthesis Acetobacter xylinum. A unique guanyl oligonucleotide is the immediate activator of the cellulose synthase.</a> Carbohydrate Research. 149 (1), 101-117 (1986).</li>
<li>Potrykus, K., Cashel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%28p%29ppGpp%3A+still+magical%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">(p)ppGpp: still magical?</a> Annual Review of Microbiology. 62, 35-51 (2008).</li>
<li>Boutte, C. C., Crosson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+lifestyle+shapes+stringent+response+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacterial lifestyle shapes stringent response activation.</a> Trends in Microbiology. 21 (4), 174-180 (2013).</li>
<li>Nanamiya, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+functional+analysis+of+novel+%28p%29ppGpp+synthetase+genes+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Identification and functional analysis of novel (p)ppGpp synthetase genes in Bacillus subtilis.</a> Molecular Microbiology. 67 (2), 291-304 (2008).</li>
<li>Gaca, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+Levels+of+%28p%29ppGpp+in+Enterococcus+faecalis%3A+the+Magic+beyond+the+Stringent+Response%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Basal Levels of (p)ppGpp in Enterococcus faecalis: the Magic beyond the Stringent Response.</a> mBio. 4 (5), (2013).</li>
<li>Sebaihia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multidrug-resistant+human+pathogen+Clostridium+difficile+has+a+highly+mobile%2C+mosaic+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">The multidrug-resistant human pathogen Clostridium difficile has a highly mobile, mosaic genome.</a> Nature Genetics. 38 (7), 779-786 (2006).</li>
<li>Gasteiger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ExPASy%3A+The+proteomics+server+for+in-depth+protein+knowledge+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">ExPASy: The proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis.</a> Nucleic Acids Research. 31 (13), 3784-3788 (2003).</li>
<li>Purcell, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nutrient-regulated+cyclic+diguanylate+phosphodiesterase+controls+Clostridium+difficile+biofilm+and+toxin+production+during+stationary+phase%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">A nutrient-regulated cyclic diguanylate phosphodiesterase controls Clostridium difficile biofilm and toxin production during stationary phase.</a> Infection and Immunity. , (2017).</li>
<li>Mechold, U., Murphy, H., Brown, L., Cashel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intramolecular+Regulation+of+the+Opposing+%28p%29ppGpp+Catalytic+Activities+of+RelSeq%2C+the+Rel%2FSpo+Enzyme+from+Streptococcus+equisimilis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Intramolecular Regulation of the Opposing (p)ppGpp Catalytic Activities of RelSeq, the Rel/Spo Enzyme from Streptococcus equisimilis.</a> Journal of Bacteriology. 184 (11), 2878-2888 (2002).</li>
<li>Dalebroux, Z. D., Svensson, S. L., Gaynor, E. C., Swanson, M. S. <a target="_blank" href="http://mmbr.asm.org/content/74/2/171.short">ppGpp Conjures Bacterial Virulence.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 74 (2), 171-199 (2010).</li>
<li>Bartlett, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clostridium+difficile%3A+progress+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Clostridium difficile: progress and challenges.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1213, 62-69 (2010).</li>
<li><a target="_blank" href="https://www.hhs.gov/">US Department of Health and Human Services</a>. , Centers for Disease Control and Prevention, US Department of Health and Human Services. Atlanta, GA. (2013).</li>
</ol>

著者はない競合する金銭的な利益やその他の利害の関係を宣言します。

ここで報告difficile C.から彼の付けられた RSH の浄化と radiolabeled 薄層クロマトグラフィーを用いた活動の定量化手法を提案します。このメソッドは、以前のdifficile C.、(p) ppGpp 合成酵素、ヌクレオチド酸シクラーゼ、キナーゼ diguanylate 酸シクラーゼ酵素と他の生物から11,12 ホスホジエステラーゼの酵素活性を評価するために使用されています ,,1321。メソッドは、小説ではない、それは多くのタイプの試金に広く適用し、我々 研究者が役立つことを願ってそのプレゼンテーション ビデオ形式で。
プロトコルの中で最も重要な手順は、蛋白質の浄化 (手順 2.1.3–2.1.10)、反応薄層クロマトグラフィー (手順 2.2 – 2.3)、準備とデ...

キナーゼとピロホスホキナーゼ (または diphospho キナーゼ) の酵素はヌクレオチド三リン酸 (NTP) 前駆体から基質分子にリン酸塩を転送します。基板は他のヌクレオチド、アミノ酸や蛋白質、炭水化物および脂質1を含めることができます。酵素の同種基板や基板の特徴酵素に類似度に基づく情報の解析が予測できる時が、実験による検証が必要です。同様に、その substrate(s) のレートでそれは蛍光体転送反応を触媒する酵素の親和性と共同の要因、阻害剤、または他の酵素のエフェクタの効果は実験的決定する必要があります。その他の ATP 消費の酵素を細菌の細胞質に存在して ATP 前駆体の枯渇を避けるため、定量的活性アッセイは浄化された蛋白質を要求します。
金属アフィニ ティー ・ クロマトグラフィー蛋白質の浄化は、文献2,3徹底的に覆われています。N- または C 末端の組換え蛋白質を追加 6 連続ヒスチジン残基から成るヒスチジン タグは、金属親和性クロマトグラフィー4,5,6による急速な浄化を許可します。これらのシーケンスが彼らは時々、タンパク質の安定性や酵素反応速度論7、8を変更すること、彼らは変更し、タンパク質の機能にほとんど影響を持つ通常のタンパク質に比べて小さいです。ヒスチジン タグで N と C-末端同じ蛋白質の問題の蛋白質の構造を知らなくても予測することは困難である、さまざまな効果を持つことができます。ヒスチジンのタグは、通常ケーブルをどちらかすぐに六つのヒスチジン残基をエンコードのプライマーを設計することによって、3' ATG 開始コドンにまたはすぐに 5' 停止コドンに開いたリーディング ・ フレームの組換え蛋白質のクローン作成中に組み込まれています。増幅後、hexahistidine を含む遺伝子は誘導性プロモーターの制御の下でベクトルに、大腸菌の実験室で、通常表されます。組換えタンパク質は、固定化の二価陽イオン (通常ニッケルまたはコバルト)9を含む親和性の樹脂で分離できます。ネイティブ金属結合蛋白質の汚染は、競争力のある連結蛋白質2を転置するイミダゾールを滴定法によって削除できます。最後に、ターゲット蛋白質はイミダゾールの高濃度の列から溶離されます。固定化金属陽イオン樹脂のいくつかの商業源があるし、メーカーは、バッファー条件とイミダゾールの集中のための推奨事項を提供します。溶出後タンパク質ナトリウム dodecyl 硫酸塩-ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) を用いて、透析、または機能の試金ですぐに使用します。
ATP のリン酸結合の加水分解を解放または励起、蛍光、化学発光を生成します 2 番目の反応に結合することによって直接にキナーゼ活動を監視する方法はいくつかありますが、これらの反応は複数の可動部が、することができます。ロジスティック困難である10。特に蛍光体転送アクティビティを測定する最も簡単な方法は直接の監視から市販の γ-32radiolabeled リン酸基の転送 -P、非標識基板11に NTP 前駆体,12,13。 標識基板と製品の混合物を分離および薄層クロマトグラフィー (TLC) による定量化できます。TLC は、毛管作用によって、溶質の混合物の吸着14をされている表面 (固相) に移行する溶媒 (液相) により溶媒中の溶質の差分のモビリティを利用しています。小さいや固相との良好な相互作用が不足する溶質移行より高い分子量またはソリッドの偉大な親和性と溶質それぞれ初期の場所から長い距離。蛍光体転送の検討、リン酸基は彼らを追加する、中性または酸性 pH11,12,14負イオン電荷を追加分子の分子量を増やします。これは PEI セルロースなどの基本的な面で自分たちのモビリティを減らします。酸性カリウム リン酸バッファーに開発され、モノ、ジ、トリ、テトラ-、pentaphosphate 種の混合物は、PEI セルロース、(図 2 図 3) 各種の定量化を可能に容易に分離できます。関心の酵素を含むセル lysates を使用してこのようなアッセイを行うことが、これは基板や製品を破壊する他のキナーゼ、ホスファターゼ、および一般的な Atpase の活動の可能性を含まれています。酵素活性の定量の in vitro評価、関心の酵素を浄化するために必要です。
グアノシン四リン酸 (ppGpp) とグアノシン pentaphosphate (pppGpp) は、リボヌクレオチド シグナリング分子、ピロリン酸の移動によって形成されたグループ アデノシン三リン酸 (ATP) の前駆体から、それぞれ、グアノシン二リン酸 (GDP) またはグアノシン四リン酸 (GTP) 基板15。(P) ppGpp と総称するこれらの単一リボヌクレオチド信号は、多様な細菌種15,16で厳格な応答として知られている環境ストレスへのセル全体の応答を仲介します。形成を触媒する酵素の 2 つの保存されたクラス (p) ppGpp15,17 Rel/Spo の相同物 (RSH) 酵素が 'long' 二官能性 (p) ppGpp 合成酵素/加水分解酵素関連やスポット (p) が彼らの類似の名前 ppGpp 代謝小さな alarmone 合成酵素 (SAS) 酵素がグラム陽性菌15,排他的に見られる短い単シンテターゼ、合成酵素、加水分解酵素、および規制のドメインを含む大腸菌由来の酵素17,18. 胞子形成グラム陽性菌クロストリジウム ・ ディフィシルは、RSH と SAS の推定の遺伝子19をエンコードします。C. ディフィシルRSH 酵素が触媒活性を示す (p) ppGpp 合成酵素であることを確認する初期活性測定法を紹介します。

<table><tbody><tr><td>Inducible overexpression of a histidinine-tagged protein</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phusion polymerase</td><td>New England Biolabs (NEB)</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>QIAEX II DNA Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>20021</td><td></td></tr><tr><td>KpnI restriction</td><td>enzyme NEB</td><td>R0142S</td><td></td></tr><tr><td>PstI restriction</td><td>enzyme NEB</td><td>R0140S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNAリガーゼ</td><td>NEB</td><td>M0202</td><td></td></tr><tr><td>NEB&reg; 5-αコンピテント&nbsp;大腸菌&nbsp;(高効率)</td><td>NEB</td><td>C2987I</td><td></td></tr><tr><td>BL21 (DE3) 有能な E. coli</td><td>NEB</td><td>C2527I</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10724815001</td><td></td></tr><tr><td>JXN-26 遠心分離機 JLA 10.500 ローター付き</td><td>ベックマン・コールター</td><td></td> D3024<td></td></tr><tr><td>/D3024R ローター付き</td><td>Scilogex-MaxQ</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>SHKE6000インキュベーター</td><td>Thermo Scientific</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>超音波プロセッサー</td><td>Sonics</td><td>VC-750</td><td></td></tr><tr><td>ニッケルアフィニティークロマトグラフィー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA樹脂</td>によるタンパク質精製 <td>G Biosciences</td><td>786-940/941</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Disposable Gravity columns, 10 mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>29924</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Spectra/ Por float-A-lyzer G2透析装置(MWCO:20-kD)</td><td>スペクトル</td><td>G235033</td><td></td></tr><tr><td>ミニプロティアン電気泳動細胞</td><td>BioRad</td><td>1658004</td><td></td></tr><tr><td>薄層クロマトグラフィーによるタンパク質活性アッセイ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>薄層クロマトグラフ(TLC)開発タンク</td>General <td>Glass Blowing Company</td><td>80-3</td><td></td></tr><tr><td>ポリエチレンイミン(PEI)-セルロースプレート(20 cm x 20 cm、100 &mu;m 厚さ) ポリエステル支持体付き</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z122882-25EA</td><td></td></tr><tr><td>ATP, [&gamma;-32P]- 3000 Ci/mmol 10mCi/ml 鉛, 100 &mu;Ci</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEG002A</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine 5'-triphosphate (ATP) 100 mM</td><td>Bio Basic Canada</td><td>AB0311</td><td></td></tr><tr><td>グアノシン-5'-二リン酸二ナトリウム塩 (GDP)</td><td>Alfa Aesar</td><td>AAJ61646MC/E</td><td></td></tr><tr><td>Storage 蛍光体スクリーン</td><td>GE Healthcare ライフサイエンス</td><td>BAS-IP TR 2040 E Tritium screen</td><td></td></tr><tr><td>Storm 860 phosphorimager</td><td>GE Healthcareライフサイエンス-</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

浄化、体外(p) ppgppクロストリジウム ・ ディフィシルから合成酵素の活性

A Purification and In Vitro Activity Assay for a (p)ppGpp Synthetase from Clostridium difficile

酵素キナーゼとピロホスホキナーゼは、ヌクレオチド三リン酸前駆体から γ リン酸または β-γ ピロリン酸基をリン酸化製品を作成する基板に転送します。使用-p NTP 前駆体をラベル付けにより、γ-32のラジオグラフィによる基板の利用と製品の形成を同時にモニタリングします。薄層クロマトグラフィー (TLC) セルロース プレート上では、迅速な分離と基板と製品の定量法をことができます。アッセイの精製 (p) ppGpp 合成酵素のピロホスホキナーゼ活動に薄層クロマトグラフィーを利用するための方法を提案します。このメソッドは以前環状ヌクレオチド及び還元型酵素の活動の特性に使用されています、ヌクレオチドの三リン酸塩結合を加水分解するまたは端末に転送する酵素の活性の特性を広く適切ですリン酸リン酸ドナーから別の分子へ。

クロストリジウム ・ ディフィシルとその酵素活性の評価から (p) ppGpp 合成酵素の親和性の浄化のための方法を提案する.金属アフィニ ティー ・ クロマトグラフィーにより蛋白質の浄化を図 1に示します。この精製から 2 番目の溶出 (E2) 分数は透析、酵素活性アッセイに使用します。図 2は、準備し、薄層クロマトグラフィーによる pyrophosphotransferase の試金を遂行するに必要な手順を説明します。図 3は、これらの実験からのデータを適切なブランキングと信号強度の割合への変換に重点を置いて測定する方法を示しています。図 4 a c. ディフィシル(p) ppGpp 合成酵素精製 RSH を使用して (p) ppGpp 合成酵素試金の代表的な TLC オートラジオグラフィーを提案...

ここでは、放射性標識基質と酵素活性の生体外の試金する製品の薄層クロマトグラフィーによるヒスチジン ピロホスホキナーゼ酵素の浄化法について述べる.酵素活性測定法はキナーゼ、ヌクレオチド酸シクラーゼ、またはその機構を含むヌクレオチド三リン酸加水分解蛍光体移動反応に広く適用可能。

浄化、体外(p) ppGppクロストリジウム ・ ディフィシルから合成酵素の活性

Kinase and pyrophosphokinase enzymes transfer the gamma phosphate or the beta-gamma pyrophosphate moiety from nucleotide triphosphate precursors to ...

この方法は、酵素基質特異性および反応動態を含むリン酸化酵素に関する重要な質問に答える助けとなる。この手法の主な利点は、非常に一貫性のある複数のデータセットを迅速に収集できるため、酵素活性の統計的に堅牢な定量が可能です。この方法の視覚的なデモンストレーションは、TLCプレートに反応を発見し、反応中の放射性種を定量化することは、説明するよりもはるかに簡単に実証できるため、非常に重要です。アスタに加えて、この手順を実証するのは、私の研究室のもう一人の大学院生であるアジア・プーデルです。テキストプロトコルに記載されているように、ヒスチジンタグ付きタンパク質の誘導可能な過剰発現でこのプロトコルを開始します。重力カラムにニッケルニトリロ酢酸樹脂を1ミリリットル用意して、タンパク質を精製します。使用前日、2ミリリットルの平衡バッファーで一晩4度でカラムを平衡化する。翌日、明確化されたライセートをロードする前に、カラムを摂氏4度から室温に戻し、約2〜3時間放置します。次に、リシスバッファー内のペレットを再懸濁します。氷上の細胞を10秒間隔で10回超音波処理し、パルス間で30秒間一時停止します。マイクロ遠心分離機を用いて摂氏4度で30分間3,080回gの遠心分離により、ライセートを明らかにする。同じ量のリシスバッファーで明確化したライセートを準備し、その後、準備された、明確化されたライセートをカラムに適用し、フロースルーを収集します。明確化されたライセートフロースルーをカラムに再適用し、二次フロースルーを収集します。その後、5ミリリットルの洗浄バッファー1でカラムを洗浄し、フロースルーを収集します。5ミリリットルの洗浄バッファー2でカラムをもう一度洗い、フロースルーを収集します。今、溶出バッファーの2ミリリットルを適用します。フロースルーをそれぞれ1ミリリットルの2つの部分で収集します。タンパク質精製の際、精製バッファーに塩化マグネシウムを含めることが、製造業者のプロトコルに対する変更であり、酵素活性に不可欠です。SDS-PAGEによるタンパク質精製を定性的に評価するには、4%スタッキングで全てのカラム分画の20マイクロリットルのアリコートを実行し、10%は170ボルトで60分間ポリアクリルアミドゲルを実行します。室温で0.1%クマシーブルーでゲルを5時間染色し、ベンチトップロッカーで穏やかに揺れます。その後、ゲルを室温で一晩40%メタノール-10%氷酢酸でデステインし、ベンチトップロッカーで揺れる。200:1比で透析バッファーに対して溶出した分画2を、摂氏4度で一晩で20キロダルトンの分子量カットオフを有する1ミリリットル透析装置を使用して透析バッファーに対して透析する。280ナノメートルで吸光度を測定し、計算されたモル絶滅係数を使用して、透析タンパク質サンプルの濃度を決定します。透析タンパク質サンプルの100マイクロリットルのアリコートを使用するまでマイナス80°Cで保存します。反応を行う前に、脱イオン水で洗浄して、薄層クロマトグラフィープレートのPEIセルロースを調製します。プレートをガラスチャンバーに入れ、二重蒸留水を約0.5センチメートルの深さまで入れます。水がプレートの上部に移動することを許可した後、ガラスチャンバーからプレートを持ち出し、ベンチトップラックに残して一晩乾燥させます。乾燥したプレートを1つの端から2センチメートル離れた場所に柔らかい鉛筆でマークし、サンプルがTLCに適用される場所を示します。2マイクロリットルのサンプルの場合、1センチメートル以上離れたサンプルを適用します。実験を計画する場合は、各プレートに常に1つのスポットを未使用のままにして、サンプル定量用の空白のレーンとして機能させます。酵素活性アッセイを行うために、テキストプロトコルに記載されているようにγP32 ATPを用いて個々の反応を調製する。ヌクレオチド含有混合物にRSHを添加すると酵素活性アッセイが開始されるように、他の成分が混合された後にRSHを添加する。ヌクレアーゼ活性を汚染することからATP加水分解を制御するには、タンパク質を含みずに10マイクロリットル反応を組み立て、それを並行してインキュベートする。T等しいゼロで2マイクロリットルのサンプルを見つけ、実験の最後にATPがタンパク質の不在時に加水分解されていないことを確認します。RSHを添加した直後に、2マイクロリットルを取り除き、Tがゼロ分サンプルに等しいようにラベル付きPEIセルロースプレートにスポットを当てる。摂氏37度で反応をインキュベートし、所望の時点で2マイクロリットルのアリコートを取り除く。すべてのアリコートが収集された後、0.5センチメートルの深さまで1.5モル単塩基性リン酸カリウムでクロマトグラフィーチャンバーを充填することにより、薄層クロマトグラフィーを行います。プレートの底辺を溶媒に浸し、約90分間にわたってプレートの上部に移動させます。クロマトグラフィータンクからプレートを取り出し、ベンチトップの乾燥ラックに置き、一晩空気乾燥します。プレートが乾燥したら、プラスティックフィルムでプレートを包み込んで、放射性物質を撮像カセットに送り込むのを避け、自動ラジオグラフィーで分析します。分離反応を含むPEIセルロースプレートをリンイメージカセットに室温で4時間露出させます。露光後、リンイメージャー上にカセットを画像化します。グラフィカルユーザーインターフェースを備えたイメージングソフトウェアを使用して、最初に矩形を描画を選択して目的の領域またはROIを描画し、マウスを使用して1車線全体の周りに長方形のROIを描き、そのレーン内に含まれるATPおよびグアノシン-テトラリン酸スポットを描きます。[選択]、[コピー]、[貼り付け]コマンドを使用して、他のレーン内に同一のROIを描画し、ROI が各レーン内の同一領域内で信号を測定していることを確認します。未使用のレーンの ROI を含めます。解析、ツール、ROI マネージャ、イメージング ソフトウェアの追加コマンドを使用して、PEI セルロース プレートに描画されたすべての ROI を選択します。解析、測定の設定、測定コマンドを使用して、各ROI内の信号強度を定量化し、測定値を拡散シートとしてエクスポートします。スプレッドシートで、実験信号から空白のROI値を減算します。異なるタンパク質のバッチまたは異なるガンマP32 ATPで異なる日に収集されたデータセットが一貫しており、統計的な厳格さのためにプールすることができるので、データをグアノシン-テトラリン酸合成率に変換することが重要です。この漫画は、サンプル中の総放射性信号と関心のある成分のATPおよびグアノシンテトラリン酸塩領域を含む車線を定義するために関心のある領域がどのように使用されているかを示しています。ATPおよびグアノシン四リン酸シグナルは、放射性基質のピペット化誤差または崩壊がサンプル中の全シグナルに影響を与える可能性があるが、酵素活性に影響を与えないため、絶対値を報告するのではなく、全信号に正規化される。ここに示されているのは、精製されたC.difficile RSHを用いて行われる反応の実際のTLCプレートである。タンパク質を含み込んだ制御反応は、非触媒ATP加水分解の定量を可能にし、一方、ブランクレーンは正確な信号定量を可能にする。ATPおよびグアノシン-テトラリン酸塩スポットでは、酵素はATP基質からGDP前駆体に放射性リン酸を移し、放射性グアノシン四リン酸を作り出す。これは、C.difficile由来のテトラリン酸テトラリン酸酵素が活性酵素であることを確認する。反応を一間隔でサンプリングすることで、進行を観察することができる。ここで生信号は各時点で観察される。ATPが減少し、グアノシン四リン酸が増加しています。ここに示されているのは、正規化されたデータです。正規化はピペット処理エラーを占めるため、誤差範囲ははるかに小さくなります。この手順を試みる間、これは溶媒の移動を妨げる可能性がありますので、TLCプレート上の樹脂を傷つけないように注意することが重要です。これは、酵素活性の堅牢な定量を迅速に提供できる、簡単なデータ分析を備えた非常にアクセス可能な手法です。我々は、クロストリジウム・ディフィシルがグアノシン四リン酸を合成することを確認するためにそれを使用しました, これは以前に報告されたことがない.放射能を扱うことは非常に危険であり、この手順を実行しながら放射性物質の貯蔵と使用に関する機関の規則に従わなければならないことを忘れないでください。この方法は、グアノシンテトラリン酸合成に関する洞察を提供することができますが、タンパク質キナーゼ活性および環状デグアニル酸合成を含む他のホスホトランスファー反応にも適用できます。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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マルチ酵素ハイスループット遺伝的酵素スクリーニングシステムを用いたスクリーニング

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Escherichiaからの非変性条件下でのコドン最適化されたヒトcis-プレニルトランスフェラーゼの過剰発現および精製のための簡単なプロトコール 大腸菌は 、酵素活性アッセイと一緒に、記載されています。このプロトコールは、機構的研究に適した量および質の他のシスプレニルトランスフェラーゼタンパク質の産生のために一般化することができる。...

ヒトの過剰発現と精製シス - プレニルトランスフェラーゼ大腸菌

マイクロチター皿における放射標識細菌培養物の成長は、(p)ppGppを含むヌクレオチドプールの豊富さの複数の技術的および生物学的複製アッセイを可能にする高スループットサンプリングを促進する。生理的ストレスの原因によって引き起こされる成長遷移の影響だけでなく、ストレスからの回復を監視することができます。.

大腸菌(p)ppGppの複数の生体内測定に対するマイクロチター皿放射ラベリングの使用、その後に薄層クロマトグラフィー

ヒト真菌病原体クリプ トコッカス・ネオフォルマンスは...

軟体動物からの粗および清澄抽出物の推定抗クリプトコッカス特性の評価

学ぶ ヒスチジンタグ付きピロホスホキナーゼ酵素の精製と薄層クロマトグラフィーによる活性評価法。Clostridium difficile由来の酵素動態解析に適用可能で、リン酸転移反応の研究に有用です。

浄化、体外(p) ppGppクロストリジウム・ディフィシルから合成酵素の活性

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