ヒト肺組織におけるZW10相互作用タンパク質の免疫染色のデジタル解析

この方法は、病理学的および免疫組織化学における重要な質問に答える助けとなる。この技術の主な利点は、十分に速く、高品質のデジタルメディアを生成することです。室温で24時間4%パラホルムアルデヒドに3〜3センチメートルのカン組織サンプルを固定することから始めます。

翌日、室温でエタノール浸漬を上にして組織を脱水し、その後100%キシレンに3回浸漬して1回の処理を20分間行う。最後のキシレン浸漬の後、組織を63°Cパラフィンに30分間入れ、続いて新鮮な63°Cパラフィンに2回目の45分浸漬を行い、パラフィンをもう一度交換して最後の1時間のインキュベーションを行います。パラフィンが冷却されたら、ロータリーミクロトームを使用してパラフィン埋め込み組織サンプルの5マイクロメートル厚いセクションを取得し、20マイクログラム/ミリリットルポリL-リジンコーティングスライド上のセクションをキャプチャします。

脱蝋の場合は、スライドを65度の摂氏オーブンに2時間置き、続いてジメチルベンゼンを15分間浸漬し、100%キシレンに15分間浸し、降順エタノール浸漬シリーズでスライドを水分補給します。抗原修復のために、スライドを抗原修復ボックスに入れ、300ミリリットルのクエン酸修復液を箱に加えます。箱を電子レンジで2分間高火で加熱し、続いて低火で加熱して6分間沸騰させます。

スライドが室温まで冷却されたら、室温で回転式シェーカーで3つの5分0.01モルPBS洗浄で組織サンプルを洗浄します。内因性ペルオキシダーゼを排除するために、室温で湿った箱に30分間二重蒸留水で3%過酸化水素でスライドをインキュベートします。インキュベーションの最後に、示されているようにスライドを洗浄し、10%ヤギ血清の100マイクロリットルを摂氏37度で39分間各セクションに非特異的結合を差し込みます。

次に、一晩で4°Cでスライドあたり100マイクロリットルの抗ZWINT抗体で組織にラベルを付け、続いて0.01モルPBSで3回のスリングを行います。最後の洗浄後、適切な二次抗体を使用して適切な二次抗体を30分間摂氏37度でインキュベートし、続いて0.01モルPBS洗浄を3回行います。最後の洗浄の後、スライドを300マイクロリットルの新鮮なDABに10分間加え、続いて室温で水道水で10秒間洗浄します。

カウンターは、室温で2分間ヘマトキシリン染色溶液で組織を染色し、続いて水道水で15分間洗浄し、次に再び上昇エタノール浸漬で組織を脱水し、続いて室温でキシレンに2つの15分間浸漬します。最後の100%エタノール浸漬後、中性ガム溶液中の5%キシレンの15マイクロリットルでセクションを取り付け、カバーガラスで各組織サンプルをカバーします。セクションの自動全スライドスキャンの場合、まずスライドが室温で12時間乾燥して組織サンプルを乾燥させます。

次に、自動スライドスキャナーで、手動でBrightfieldを選択し、手動スキャンインターフェースを入力します。スライドの名前を変更し、画像の保存場所を選択します。スキャン領域を設定し、ユーザー設定のしきい値オプションを使用してスキャンサンプルを選択します。

しきい値は約50で、スキャン領域拡張値は200マイクロメートルです。スキャンフォーカス値を設定し、[自動フォーカスと単層モード]を選択し、スライドをワークステーションにロードして自動スキャンを開始します。すべてのスライドをスキャンしたら、後で分析するために画像を保存します。

肺組織切片の画像を解析するには、組織病理学的画像解析ソフトウェアを開き、ローカルコンピュータを選択してスキャンデータを含むファイルを開きます。適切なズームレベルを選択し、[色調整の切り替え]を使用して色を最適なコントラストに設定し、各画像の対象領域を円で囲んで名前を付けます。次に、プラグインの下で、QCを選択します。シナリオビルダーがポップアップ表示されます。

密度クオントを選択し、検出バーを調整します。円の領域の染色強度が元の画像と類似するまでスコアレベルを調整し、モデルを新しいファイルとして保存して名前を付け、モデルを他のスライドに適用して[選択された注釈]を選択して、各画像の対象領域の APE スコアを自動的に計算します。腫瘍の肺組織切片の全スライドデジタルスキャンと非小細胞肺癌検体からの隣接する非腫瘍組織のデジタルスキャンは、高品質のデジタル画像を生成する。

これらのタイプの肺癌サンプルから計算されたAPEスコアは、典型的には、隣接する非癌組織について決定されたものよりも有意に高い。さらに、扁平上皮癌組織切片におけるZWINT発現レベルは、しばしば、アブノ癌組織サンプルで測定されたものよりも有意に高いと判断される。この手順を試みる間、病理学的スキャンを行う際に腫瘍または腫瘍領域の高品質で準備することを忘れないでください。

この手順に従って、顕微鏡の他の方法は、追加の質問に答えるために行うことができます。病理学的スキャンのためのまたは異なる方法ではない。この技術の後、病理学的スキャンの分野の研究者が研究目的でデジタル診断を探求する道を開いた。

パラホルムアルデヒドを使用すると非常に危険であり、マスクなどの予防措置は、常にこの手順を実行している間に取られるべきであることを忘れないでください。