Name: 組換え膜蛋白質のプロトンの回転率を分析するためのマイクロ寒天塩橋電極 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: 学ぶマイクロ寒天塩橋電極を用いた組換え膜蛋白質のプロトン回転率測定法。拡散電位の影響を最小化し、膜電位測定の精度を向上させ、タンパク質活性と生理・病理状態の理解に貢献します。

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この作品は、オーストリアの研究基金 (E.E.P. に P31559-B20) によって支えられました。著者は、生産に優れたテクニカル サポートにサラ Bardakji を感謝しの再構成プロテオリポソームに UCP1、UCP3 をマウスします。

1. 遺伝子組換え連結を解く蛋白質 (さら) の生産と平面二重膜の形成
<ol><li>ループレヒトらによる記述で、UCP1 遺伝子組換え、UCP3 を生成します。9 Hilseら10
</li>
	<li>ベックらによって記述された従来不可欠であるプラスチック ピペットの先端に平面二重膜を形成します。7
</li>
</ol>2. マイクロ寒天塩橋電極の作製
<ol><li>マイクロキャピ ラリー ピペットを調整する適切な長さ (材料の表を参照) をヒントします。<ol>
<li>空の先端でバッファーを含む先端に添付されます、スライド式キャリパーを使用してマイクロ寒天塩橋電極の長さを測定する位置をマークします。 注意: マイクロキャピ ラリー チップはある十分な長さ測定用緩衝液を入力する必要があります。</li>
		<li>鋭いナイフとブレード マイクロキャピ ラリー チップを切り取って、エタノールと水でカット面をきれいに。</li>
	</ol>
</li>
	<li>塩化銀被覆電極を準備します。<ol>
<li>長さ約 8 cm の銀線を切断し、エタノールと水でそれをきれいに。</li>
		<li>サンドペーパーの部分を取り、塩溶液に接触するはず、ワイヤーの端に 1 cm の表面を滑らかに。</li>
		<li>平滑端を 3 M KCl 水溶液に浸し、10 の 1.5 V で DC 電源を使用して塩化物の電気化学的コート s。</li>
		<li>水で電極をきれい、乾燥させ、およびマイクロキャピ ラリー チップを可能な限り深く浸透してコーティングされていない側から塩化銀電極の長さを調整します。 注: プロトコルはここで一時停止することができます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>1% (v/v) agarose が付いて 3 M KCl 塩溶液を準備します。<ol>
<li>KCl の 4.47 g を量り、フラスコの攪拌で 20 mL の水に溶かします。</li>
		<li>かくはんを取り外して、アガロースの 0.2 g を量り、フラスコに追加。</li>
		<li>Agarose を溶かし、凝固を防ぐに 100 ° C の解決策を熱する。 注意: フラスコは非常に高温になります。素手でそれを触れないでください。処理のため手袋を使用します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>マイクロキャピ ラリー チップをアガロース溶液で満たしなさい。 注意: ソリューションは、暑いです。手と水しぶきを避けるために注意深く作業を保護します。<ol>
<li>Agarose 起動凝固する場合熱再び agarose を溶かし完全に食塩。</li>
		<li>マイクロキャピ ラリー チップに寒天塩液の 10 μ L を浸します。それをしっぽりし、慎重に先端で気泡の空気を避けるために。</li>
		<li>ピペットから先端を外し、先端のより広範な側面から塩化銀電極でプッシュします。塩の溶液を電極に浸透を確保します。</li>
		<li>部屋の温度に電極を冷却、アンプに差し込みます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>測定用バッファーを準備します。<ol>
<li>その4MES の 0.195 g ナ2の 0.710 g を量り、0.121 g のトリス、0.023 g グリコールエーテルジアミン四酢酸、100 mL の蒸留水をビーカーに追加し、ソリューションをかき混ぜます。</li>
		<li>PH 電極を使用してバッファーの pH 値を確認し、7.32 に pH 値を調整します。</li>
		<li>参照電極と寒天塩橋電極では、電気的接触を確認してください。<ol>
<li>プラスチック製の容器に 1 mL のバッファーを追加します。</li>
			<li>参照電極と寒天塩橋電極ディップし、信号の応答を確認してください。信号応答が正しい場合は、2.7 の手順に進みます。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>まったく偽信号応答または電気的接触がある場合、は、次のトラブルシューティングを実行します。<ol>
<li>塩溶液との接触電極が確認してくださいし、溶液に電極をプッシュします。 注: ソリューションは、あまりにも粘着が既にいる場合、マイクロ寒天塩橋を取り外して、新しいマイクロキャピ ラリー チップを準備します。</li>
		<li>塩の溶液内の空気の泡があるか確認してください。Yes の場合、新しいマイクロキャピ ラリー チップを準備します。</li>
		<li>塩溶液緩衝液との接触が確認してください。されていない場合は、別 1 mm の先端の管端を切断します。 注意: 先端はバッファーを含むヒントを貫通する十分な長さではまだされていることを必ずです。まだ接触がない場合は、新しいマイクロキャピ ラリー チップを準備します。</li>
		<li>上記の手順が役立つ場合は、新しいマイクロキャピ ラリー チップを準備します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ストレージの 3 M KCl 水溶液に寒天塩橋電極を浸し。 注: プロトコルをここで停止することができます。一時停止のため一晩、4 ° C で 3 M KCl 塩溶液に電極を格納します。</li>
	<li>バッファーを含むプラスチック チップを準備します。 注: 電極が一晩保存、する場合それを取り出し、それまで室温で 30 分間熱。<ol>
<li>マイクロキャピ ラリー チップを取るし、電熱線を使用して約 90 度、狭い部分の端から 2 cm のチューブを曲げます。</li>
		<li>非常に鋭いナイフや刃を使用し、管の曲がり部から約 5 mm を切断します。</li>
		<li>エタノールと水で最後に表面をきれいにし、先端の穴の直径を測定します。このことから、画面の領域を計算します。</li>
		<li>85:15 (v): ヘキサン: ヘキサデカンで先端の表面をコートします。<ol>
<li>溶媒の 3 μ L をピペット、先端から取り外します。</li>
			<li>先端における残留溶媒のすべてが蒸発したように 1 分の待機します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>バッファーの 3 μ L で測定チップを埋める、塩橋電極上に差し込みます。 注: は、2.5.3 のステップを実行することで電気的接触、塩橋電極と参照電極場合もう一度確認します。</li>
		<li>電気的接触がない場合は、次のチェックします。<ol>
<li>塩橋電極が緩衝液との接触はあるかどうかを確認します。そうでない場合は、どちらかは先端でバッファーのボリュームを増加したりより長いマイクロキャピ ラリー ヒントを準備します。</li>
			<li>空気の泡のマイクロ塩橋電極から先端を削除、ヒントでは、バッファーを補充、電極に再びそれをプラグインがある場合。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 組換えタンパク質再構成膜の電気的パラメーターの測定
<ol><li>三角形の交互になる電圧信号を適用最大電圧 Umax = 50 mV と ΔTランプ= 50 ms は、長方形の交流電流応答を作成します。正と負の電流 (I+と私は-) の平均値から次の式によると膜の容量を計算します。 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58552/58552eq1v2.jpg">
</li>
	<li>-50 に至る電圧ランプを適用 mV +50 mV と現在のレコードにします。-斜面はコンダクタンス - データを線形関数をフィットし、フィットの x 軸の交点を計算します。</li>
	<li>プラスチックの先端ソリューションを放電増加基板濃度バッファーで新しいものを記入してください。<ol>
<li>最初の 20-30 s 内膜が形成されない、ボリュームを排出し、それを補充します。膜間の濃度勾配は膜形成中に大きく変わらないことが保証されます。</li>
		<li>膜の形成後 3.1 と 3.2 もう一度適切な膜の形成を確認して x 軸の交点を得るための手順に従います。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 基板回転率の計算
注: 詳細3、7の前の作業を参照してください。
<ol><li>脂質・ タンパク質 (M脂質および M蛋白質)、膜の 1 つの脂質ヘッド グループ (膜脂質) のエリアあたり蛋白質の質量比の分子の固まりから膜タンパク質の量を見積もる脂質 (r)。 <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58552/58552eq2v2.jpg">
</li>
	<li>ネルンストの運ばれた基板の可能性を計算します。R はガス定数、T 温度、z 輸送基質、F ファラデーの定数、および c の電荷1と c2の基板、膜の両側の濃度。 <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/58552/58552eq3v3.jpg">
</li>
	<li>電流電圧の録音から取る逆潜在的な基板勾配の有無で線形フィットから x 軸の交差ポイントの差で計算されます。</li>
	<li>ネルンストの潜在的な11の逆の可能性の比率によって基板コンダクタンス、G基板、総膜コンダクタンス、G合計の割合を計算します。 <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/58552/58552eq4v2.jpg">
</li>
	<li>基板回転数 ΔN を計算基板基板コンダクタンス (G基板)、印加電圧 U、および基板 z: の電荷から時間単位 ΔT 単位 <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/58552/58552eq5v2.jpg">
</li>
	<li>輸送基質タンパク質の数時間ごとの比率、売り上げ高率 κ を算出します。 <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/58552/58552eq6v2.jpg">
</li>
</ol>

<ol><li>Terstappen, G. C., Reggiani, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11165668">In silico research in drug discovery.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 22 (1), 23-26 (2001).</li>
<li>Raynauld, J. P., Laviolette, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+silver-silver+chloride+electrode%3A+A+possible+generator+of+offset+voltages+and+currents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">The silver-silver chloride electrode: A possible generator of offset voltages and currents.</a> Journal of Neuroscience Methods. 19 (3), 249-255 (1987).</li>
<li>Urbankova, E., Voltchenko, A., Pohl, P., Jezek, P., Pohl, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+kinetics+of+uncoupling+proteins.+Analysis+of+UCP1+reconstituted+in+planar+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Transport kinetics of uncoupling proteins. Analysis of UCP1 reconstituted in planar lipid bilayers.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (35), 32497-32500 (2003).</li>
<li>Beck, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyunsaturated+fatty+acids+activate+human+uncoupling+proteins+1+and+2+in+planar+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Polyunsaturated fatty acids activate human uncoupling proteins 1 and 2 in planar lipid bilayers.</a> The FASEB Journal. 21 (4), 1137-1144 (2007).</li>
<li>Shao, X. M., Feldman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-agar+salt+bridge+in+patch-clamp+electrode+holder+stabilizes+electrode+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Micro-agar salt bridge in patch-clamp electrode holder stabilizes electrode potentials.</a> Journal of Neuroscience Methods. 159 (1), 108-115 (2007).</li>
<li>Kleene, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+intrapipette+salt+bridge%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple intrapipette salt bridge.</a> Journal of Neuroscience Methods. 46 (1), 11-16 (1993).</li>
<li>Beck, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+automated+technique+for+the+reconstitution+of+hydrophobic+proteins+into+planar+bilayer+membranes.+Studies+of+human+recombinant+uncoupling+protein+1%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta-Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">A new automated technique for the reconstitution of hydrophobic proteins into planar bilayer membranes. Studies of human recombinant uncoupling protein 1.</a> Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1757 (5-6), 474-479 (2006).</li>
<li>Macher, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+mitochondrial+UCP1+and+UCP3+by+purine+nucleotides+and+phosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Inhibition of mitochondrial UCP1 and UCP3 by purine nucleotides and phosphate.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1860 (3), 664-672 (2018).</li>
<li>Rupprecht, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+transmembrane+potential+in+the+membrane+proton+leak%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Role of the transmembrane potential in the membrane proton leak.</a> Biophysical Journal. 98 (8), 1503-1511 (2010).</li>
<li>Hilse, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+expression+of+UCP3+directly+correlates+to+UCP1+abundance+in+brown+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">The expression of UCP3 directly correlates to UCP1 abundance in brown adipose tissue.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1857 (1), 72-78 (2016).</li>
<li>Fuks, B., Homble, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeability+and+electrical+properties+of+planar+lipid+membranes+from+thylakoid+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Permeability and electrical properties of planar lipid membranes from thylakoid lipids.</a> Biophysical Journal. 66 (5), 1404-1414 (1994).</li>
<li>Barry, P. H., Lewis, T. M., Moorhouse, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimised+3+M+KCl+salt-bridge+technique+used+to+measure+and+validate+theoretical+liquid+junction+potential+values+in+patch-clamping+and+electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22European+Biophysics+Journal%22%5BJournal%5D)">An optimised 3 M KCl salt-bridge technique used to measure and validate theoretical liquid junction potential values in patch-clamping and electrophysiology.</a> European Biophysics Journal. 42 (8), 631-646 (2013).</li>
<li>Huang, D., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+feasibility+and+limitation+of+patch-clamp+recordings+from+neonatal+rat+cardiac+ventricular+slices%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The feasibility and limitation of patch-clamp recordings from neonatal rat cardiac ventricular slices.</a> In Vitro Cellular & Developmental Biology. 47 (4), 269-272 (2011).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

電極を用いたマイクロ寒天塩橋の実装はその拡散の可能性を最小限に抑え、膜電位 pH 勾配による生成のより正確な測定が可能します。様々 な膜貫通 pH 勾配の存在下で両電極の潜在的なシフトが ΔpH で受け入れられた潜在的なネルンストの平衡の理論値と比較するとき、0.35 を = (Φネルンスト= 23.8 ΔpH の mV = 0.4)。しかしより多くの生理学的 pH 勾配として ΔpH で潜在的なシフトを正確に測定するミトコンドリア マトリックスと間部の標準の塩化銀電極間のインスタンスが失敗した = 1 (図 3A)。マイクロ寒天塩架橋電極は配信が多く理論に匹敵する値です。
潜在的な拡散が塩化銀参照電極で発生するは、緩衝液が実験中に変更された場合も可能性があります。塩素フリーの緩衝液は、塩化物イオンを輸送する脱共役蛋白質が示唆されたので pH はトリスや MES を使用して調整された実験で使用されました。電極電位、塩化物の相当な濃度の不在では主に緩衝溶液に塩化物の不純物に依存します。実験中にその組成が変更されない、単に定数オフセット電位になります。ただし、絶対 2 つの電極電位差の測定、簡単な寒天塩橋システム (銀/塩化銀 3 M KCl) される可能性がありますも参照電極用。
マイクロ寒天塩橋は、電極電位の平衡化して潜在的な拡散を分散します。塩の溶液を安定させるために 1% (w/v) アガロースは緩衝液の塩溶液の混合を防ぐために追加されました。K+と-の Cl 塩イオン液体に似たような移動があるし、電極電位のバランスをとる。塩橋を正しくインストールするには、寒天培地の食塩水は空気の泡なしマイクロキャピ ラリー チップを充填し、塩化銀電極をカバーする十分な熱されるしています。さらに使用の前に、塩橋の電極と参照電極間の電気接触がチェックします。塩橋の使用時間に応じて塩溶液は、バッファーと塩溶液の混合を防ぐために十分にゼリー状になることとあります。これは K+または Cl-トランスポーターを調査した場合に特に重要です。塩橋は非常に短い時間のために使用された、アガロースの溶出はこの時間範囲でごくわずか。寒天や寒天 (3%-5%)、5% までの高濃度は、長い期間時間6,12の塩橋を使用できます。
このメソッドは、(i) 低離職率と膜トランスポーターと (ii) 標準パッチ クランプ セットアップ13で調べることができますほとんど内膜ミトコンドリア蛋白質の輸送速度を決定することができます。その精度はどの精度が低い合計膜コンダクタンスと記録のノイズ下潜在的な膜を誘発する小型の濃度勾配で減少、逆電位測定に主に依存しています。
この設定を使用すると、UCP1 と UCP3 同じ条件の下で生産の離職率を測定しました。高い pH 勾配による取得率はより正確なマイナーな電極の潜在的なシフトに起因する工芸品によってと思われます。さらに分析し、同様の条件で生成されるミトコンドリア膜輸送体を比較に使用できます。

膜タンパク質は、すべての既知の医薬品1の 60% までによって目標とされます。膜タンパク質の電気生理学的測定は、膜キャリア蛋白質を介した基板の無k 輸送を分析する強力ですが、繊細なツールです。一定電圧や電圧ランプのアプリケーションによる膜貫通電流変調キャリア、例えば、活性化、基板またはトランスポートによる阻害の薬理学的および物理的特性を評価することができます。速度論。特別な関心は基板回転数時間ユニットごとの膜タンパク質による転流基板の量が表示されます。様々 な膜タンパク質の動態を比較するとき、これは主要なパラメーターです。膜荷電基質の濃度勾配を確立する基板の回転数から推測される起電力を生成します。
塩化銀電極を使用すると、塩素フリー バッファーの存在は、拡散電位電極電位を変化させ、電流-電圧測定2のシフトにつながることを作成します。それは標準的な電気伝導度と能力の計測値の無視以来これらのパラメーターのいずれかが常に存在するが、電流-電圧記録 (コンダクタンス) か、一つの記録 (容量) の違いの傾きに依存します。可能性をキャンセルします。ただし、基板の輸送によって作成される逆電位の記録は潜在的な拡散によって大幅に妨げられます。したがって、逆の可能性の正確な測定のための電極電位を一定に保つあります。
2 つの方法で潜在的な拡散を最小限にできます: (i) 二重膜の存在下で基質濃度は膜の3,4の一方の側に増加する、または (ii) の塩橋バランス電極電位5. 最初の方法、測定値の安定性に大きく依存します。膜を有する基板はソリューションでほぼ均等に分散まで攪拌下の基板の付加からの数分間を生き残るために。膜破裂の間、荷電分子の自由な交換によって基板グラデーションが変更し、測定が不正確に。後者のメソッドは、潜在的な拡散のバランスが、セットアップのサイズによって制限されます。小さなを実装するが、電気生理学的セットアップするミクロな範囲で塩橋の機能は6に挑戦します。後者の方法では、塩の溶液はマイクロキャピ ラリー ヒントに満ちているし、緩衝液に食塩水の拡散を防ぐために agarose の添加により安定化します。
このプロトコルでは、マイクロ寒天塩橋とピペット セットアップ7に基づいて電気生理学的設定に実装の簡単な生産を説明します。マイクロキャピ ラリー チップは、1 mol % (w/v) agarose が付いて 3 M KCl 溶液を含むし、AgCl 電極及び緩衝液をブリッジの両方に調整されます。マイクロ-塩橋の利点を表示するには、電極の潜在的なシフトの時間録音し膜電位の各種 pH 勾配でのより正確な測定します。リポソームに再構成した組換えタンパク質のモデル システムでミトコンドリア キャリア UCP1、UCP3 同様の条件の下で生産の離職率は改めて注目しました、以前結果3,8と比較しています。

<table><tbody><tr><td>マイクロローダーチップ</td><td>Eppendorf</td><td>5242956.003</td><td>マイクロキャピラリーピペットチップ</td></tr><tr><td>エタノール 99%</td><td>AustrAlco &Ouml;sterr。Agrar-Alkohol Handelsges.m.b.H</td><td>AAAH-5020-07025-230317</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Carl Roth GmbH + Co. Kg</td><td>6781.3</td><td></td></tr><tr><td>DC 供給</td><td>Voltcraft</td><td>V10/CPG 1940 -01</td><td></td></tr><tr><td>アガロース スタンダード</td><td>Carl Roth GmbH + Co.</td><td>Kg 3810.2</td><td></td></tr><tr><td>パッチクランプアンプ</td><td>HEKA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>サンプルチューブ</td><td>Carl Roth GmbH + Co. Kg</td><td>5863.1</td><td></td></tr><tr><td>Na2SO4</td><td>Carl Roth GmbH + Co. Kg</td><td>8560.3</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Carl Roth GmbH + Co. Kg</td><td>4256.2</td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Carl Roth GmbH + Co. Kg</td><td>AE15.2</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Carl Roth GmbH + Co. Kg</td><td>3054.1</td><td></td></tr><tr><td>ヘキサン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>296090-100ML</td><td></td></tr><tr><td>ヘキサデカン</td><td>Σ-Aldrich</td><td>296317-100ML</td><td></td></tr><tr><td>電熱線</td><td>ボルトクラフト</td><td>USPS-2250</td><td></td></tr></tbody></table>

組換え膜蛋白質のプロトンの回転率を分析するためのマイクロ寒天塩橋電極

A Micro-agar Salt Bridge Electrode for Analyzing the Proton Turnover Rate of Recombinant Membrane Proteins

日には、すべての薬理学的薬剤の 50% 以上は膜タンパク質の輸送の運動論を対象します。脂質二重膜に再構成した膜のキャリア蛋白質の電気生理学的特性は強力ですが、繊細な物理化学的および薬理学的物性の評価法です。基板回転数は異なる膜タンパク質の活性の比較を可能にするユニークなパラメーターです。無k 輸送では、転基板のグラデーションは、蛋白質の基板の回転率に直接関連する膜電位を作成します。塩化銀電極を用いた電極電位を変化させるし、かなり正確な膜電位測定を妨げる、また液絡部を潜在的なと呼ばれる拡散電位が誘起されます。潜在的な拡散は、電極電位のバランスをとる塩橋によって最小化できます。この記事でマイクロ寒天塩橋は、膜形成用マイクロ ピペットを使用して電気生理学的のセットアップを改善するために設計されています。塩溶液は、アガロースの添加により安定化マイクロキャピ ラリー ピペット チップに表示され、標準電極に簡単に取り付けできます。マイクロ塩橋電極の電極電位は、基準電極と比較してより安定しています。このシステムの実装は電極電位を安定化させ、膜電位 pH 勾配による生成のより正確な測定が可能します。このシステムを用いると UCP1、UCP3 ミトコンドリア キャリアのプロトンの回転率に改めて注目しました、以前の測定値と比較しています。

潜在的な拡散の最小化を確認するには、そのまま膜の電流-電圧測定の安定性を測定しました。図 2A、代表電流電圧の録音は存在 (白ドット) と pH 勾配の不在 (ブラック ドット) で描かれています。ネルンストの同等化に従って pH 勾配は、電圧の変化を誘導します。データを線形フィットの x 軸の交点から潜在的なシフトが計算されます。両方の電極をテストするために標準 AgCl 電極 (図 2B; 白ドット) とマイクロ寒天塩橋 (図 2B; 黒ドット) の x 軸の交点にシフトを行った。電圧ランプは行で 10 倍を記録した、時間に対して x 軸の平均値シフトが描かれています。測定、標準電極の 300 秒後にも mV が 30 までを様々 な寒天塩橋電極未満 5 の最大の変化があったに対し予期しない、ランダム、動作の mV。
次に、両電極が異なる pH 勾配 (図 3A) でテストされました。標準的な電極の 0.35 と 1.0 (白ドット) の pH 勾配が生成されました。寒天塩橋電極、0.35、0.7、および 1.0 (ブラック ドット) の pH 勾配。潜在的なシフトは、3 つの独立した測定で解析しました。どこのみ測定されたシフトが若干異なります、0.35 のグラデーションと対照をなして電圧シフトを大幅マイクロ寒天塩橋の不在で 1.0 の pH 勾配に変更します。データを線形フィット、関数の傾きは 26.4 ± 2.3 mV/ΔpH 標準電極と 50.1 ± 4.6 mV/ΔpH マイクロ寒天塩橋電極用。ネルンストの同等化に従って計算される潜在的なシフトは 60.7 mV/ΔpH t = 32 ° C
マイクロ寒天塩橋、プロトンの回転数を使用してミトコンドリア UCP1 の UCP3 κ は測定し、以前の計測結果 (図 3B) 比較されました。図 3はΔpH のような = 1.0 が生成され、逆のポテンシャルを測定しました。膜タンパク質の量が 4 μ g 脂質比蛋白質とプロトコルのセクション 4 の数式によると推定された/(脂質の mg)、蛋白質と脂質、3.53 × 10の膜面積 33,000、および 750 の Da の分子量-4 cm2、および脂質 7.8 × 10-15 cm2の面積。UCP1 と、UCP3 κwas 5.56 ± 0.38 の-1と 4.10 ± 0.71 の-1をそれぞれ得られる (図 3B)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58552/58552fig1.jpg"> 図 1: マイクロ寒天塩橋と電気生理学的設定します。(A) このパネル セットアップのスケッチを示しています。(オレンジで示されて) 寒天培地の食塩を含むマイクロキャピ ラリー チップは、(青) (黒) の電極とバッファーを含むヒントの配置されます。(矢印で示される) バッファーを含むヒントの最後に表面に膜が形成されます。(B) このパネルは、マイクロ寒天塩橋の実装と電気生理学的設定のイメージを示しています。矢印は、電極、マイクロ寒天塩橋、参照電極および緩衝液とコンテナーをポイントします。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58552/58552fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58552/58552fig2.jpg"> 図 2: マイクロ寒天塩橋と標準塩化銀電極の比較。(A) このパネル番組代表の電流-電圧測定 (グレー ドット) の存在と 1 の pH 勾配の不在 (白ドット)。行は、どの電気伝導度と x 軸の交点値を取得データを線形フィットを表します。両方の録音の交点の値の違いによる電圧シフトの評価します。(B) このパネルは、時間でマイクロ寒天塩橋電極 (ブラック ドット) に標準の AgCl 電極 (白ドット) の潜在的な膜のシフトを示しています。連続で 10 電流-電圧測定を記録し、潜在的な拡散によって平均電圧シフトは時間に対してプロットされます。すべての実験で 45:45:10 mol mol % アラキドン酸 1.5 mg/mL の濃度で再構成した DOPC:DOPE:CL の膜をしました。バッファー含まれる 50 mM Na2SO4、10 mM MES、トリス、10 mM と 0.6 mM グリコールエーテルジアミン四酢酸 ph = 7.34 および T = 32 ° C<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58552/58552fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58552/58552fig3.jpg"> 図 3: UCP1、UCP3 のプロトン回転数 pH 勾配の存在下で逆の可能性から計算します。(A) このパネル標準 AgCl 電極 (白ドット) とマイクロ寒天塩橋電極 (ブラック ドット) の様々 な pH 勾配の UCP1 を含む膜の潜在性のシフトを示しています。行は、データへの線形フィットを表します。(B) このパネルは、UCP1 のプロトンの回転数を示しています (最初のデータ セット)、UCP3 (2 番目のデータ セット) プロトコルのセクション 4 の数式によるとネルンストの潜在的な電圧シフトの比から計算した結果。各セットの最初のバーは、マイクロ寒天塩橋で測定した離職率を表します。各データ セットの 2 番目のバーは、標準の塩化銀電極を用いた以前の計測結果を表します。UCP1 と UCP3 の値は、Urbankovaらから撮影されました。3 Macherら8<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58552/58552fig3large.jpg" target="_blank"></a>

電気生理学的測定の潜在的な拡散の存在は潜在的な電極を変えることによって逆の可能性の正確な測定を妨げます。マイクロ寒天塩橋を使用すると、潜在的な拡散の影響が最小化、再構成された組換え膜タンパク質の基板回転数のより正確な測定を可能します。

To date, more than 50% of all pharmacological drugs target the transport kinetics of membrane proteins. The electrophysiological characterization of ...

この方法は、トランスポーターやチャネルなどの膜タンパク質の調査に役立ちます。タンパク質活性と特異性と異なる生理学的および病理学的条件を比較した基質回転率損失に関する情報。この技術の主な利点は、潜在的なシフト変動および塩化物フリーバッファー条件を最小限に抑える点である。そしてより精密な膜電位測定による回転率決定の精度を著しく高める。拳のステップのための要素を収集します。これらには、2つのマイクロキャピラリーピペットチップ、鋭い刃および滑走キャリパーが含まれる。電極には銀線、サンドペーパー、3つの塩化カリウム溶液を手元に持っています。また、洗浄用のエタノールと水とDC電源を備えています。2つのマイクロピペットのヒントを使用して作業を進めます。バッファーを含むヒントから始めます。2 番目の先端を 1 つ目の先端の横に置きます。2番目の先端を移動し、挿入すると狭い部分が少なくとも5ミリメートル延長され、最初の先端の狭い部分に伸びるようにします。先端を含む最初のバッファが接続される位置をマークします。次にキャリパーを使用して、マイクロ寒天塩ブリッジ電極の長さを測定します。ブレードを使用して、適切な長さに先端を切ります。カット面をエタノールで洗浄し、水を加えます。次に、電極用の銀線の約8センチメートルの長さを取得します。ワイプのワイヤーをエタノールで洗浄し、水を入れます。クリーニング後、砂紙を使用して、一方の端で1センチメートルの長さで表面を滑らかにします。平滑化された端が付いているこのワイヤーは電気化学的に塗られる準備ができている。平滑化された端を塩化カリウム溶液に入れ、もう一方の端をDC電源に接続してコーティングします。コーティングしたら、電極を取り外し、水で洗浄します。乾燥後、マイクロキャピラリー先端をできるだけ深く貫通できる長さを決定します。未塗装側から適切な長さに電極を切ります。さて、アガロースと塩溶液を準備するために移動します。水を含むフラスコで塩化カリウムを溶解し、混合を助けるために磁気攪拌機を使用しています。攪拌機を取り除いた後、フラスコにアガロースを加えます。フラスコを電子レンジに持ち込み、熱してアガロースを摂氏約100度で溶かします。アガロースが完全に溶解していることを視覚的に確認するためにそれを取り出します。アガロースが10マイクロリットルのピペットをゆっくりとマイクロキャピラリーに溶解して気泡を避ける。特に高寒天濃度では、寒天塩溶液を細毛管先端に慎重にピペットすることが重要です。適切に行われていない場合、気泡は容易に先端とブロックの電気流れで生成されます。ピペットから先端を取り外した後、電極を押し込む。電極が塩溶液に浸透していることを確認します。電極が室温のときに、リファレンス電極をアンプに差し込みます。参照電極を支持して、1ミリリットルのバッファーを持つプラスチック容器に下げることができるようにします。次に、塩ブリッジ電極を溶液に浸します。電圧を適用し、続行する前に電流応答があることを確認します。テストが成功した場合は、電極を取り外します。必要に応じて、塩ブリッジ電極を3モル塩化カリウム溶液に浸漬して保管します。次に、プラスチックチップを含むバッファーを準備します。マイクロキャピラリーチップを取り、狭い部分から2センチメートルの点を特定します。この位置でチューブを 90 度曲げるには、加熱ワイヤを使用します。鋭利なナイフで、曲がったからチューブを5ミリメートルカットします。エタノールで切った部分を水で洗います。先に進む前に、スケールを持つ軽い顕微鏡を使用して、先端の穴の直径を測定してください。次に、ピペットを溶媒の容器と別のバッファーの近くに移動します。チップに入り出す溶媒のピペット3マイクロリットル。次に、測定チップに3マイクロリットルのバッファーを充填します。次に、塩化カリウム溶液から塩の橋を取り出します。測定チップをバッファーに接続して、塩ブリッジ電極に差し込みます。塩ブリッジ電極とリファレンス電極をアンプに接続します。この時点で、塩ブリッジ電極を参照電極で緩衝液中に吊り下げたい。実験の構成の表現は、この回路図にあります。実験中、膜はピペットを含むバッファーの最後に形成されます。膜の容量を見つけるためにデータを収集します。これは、三角形の交流電圧信号を適用して、矩形の交流応答を作成することによって行います。次に、ゼロ電流でのコンダクタンスと電圧を見つけます。マイナス50~50ミリボルトの電圧ランプの適用を自動化し、電流を記録します。線形関数をデータに適合します。傾きはコンダクタンス、x切片はゼロ電流の電圧です。完了したら、塩のブリッジから測定先端を取り除きます。バッファーで新しい測定チップを塗りつぶし、異なる pH 値に調整して、膜全体にプロトン勾配を設定します。測定を繰り返すために新しい測定先端と電極を用いて設定した実験を再確立する。pH勾配の存在下での代表的な電流記録を次に示します。そして、pH勾配がない場合。線はデータに線形フィットを表します。異なるpH値のX軸交点のシフトはNernst方程式によって予測されます。これらのデータは、白色の標準的な塩化銀電極に時間の膜電位のシフトを表し、マイクロ寒天塩橋電極を黒色で表している。寒天塩橋電極は、測定の300秒にわたって5ミリボルト未満の最大シフトでより安定していた。pH勾配の関数としての電位シフトのこのプロットでは、2つの電極はpH勾配が大きくなるにつれて著しく異なる振る舞いが見られる。プロトン回転率は、2つの電極タイプについて見つけ、比較することができます。ここでは、標準的な電極と比較して塩ブリッジ電極によって測定された1つのUCP1をミトコンドリア非結合タンパク質について決定されるプロトンのターンオーバー数である。同様に準備された UCP3 のデータもあります。料金は寒天塩橋電極でより正確に見えます。この手順を試みている間、電極が寒天塩溶液に浸透することを確認することを忘れないでください。塩の橋はまた緩衝液に浸す必要があります。最後に、寒天塩溶液に気泡が含まれていることを確認します。

a-micro-agar-salt-bridge-electrode-for-analyzing-proton-turnover-rate

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