Name: 体外培養肺胞上皮細胞におけるハロゲン化ガスの濃度を制御する方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-23T14:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 56 s
Description: 学ぶ、肺胞上皮細胞におけるハロゲン化ガス濃度の精密制御法。sevofluraneやisofluraneを用いた閉鎖チャンバー構築により、急性呼吸窮迫症候群の治療法開発と肺損傷メカニズム解明に貢献します。

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著者認めるオーベルニュ地方議会 (「プログラム ヌーボー Chercheur デ ラ地方オーヴェルニュ」2013) とフランス語アジャンス ナシオナル デ ラ抜き方向ジェネラル ・ デ ・ L'Offre ・ デ ・球種 ("プログラム ・ デ ・凝った Translationnelle en 健康"ANR-13-PRTS-0010) 補助金のため。資金提供者には、研究デザイン、実施、解析、やこの記事の準備の影響はなかった。

1. 肺胞上皮細胞 (hAELVi) の文化
<ol><li>融解<ol>
<li>栽培に使えるひと肺胞上皮 (huAEC) 15 mL プラスチック チューブ中の 4 mL をピペットし、予熱した水浴 (37 ° C) のバイアルをすばやく解凍します。</li>
		<li>解凍の細胞懸濁液を 5 分間 200 x g でチューブを遠心分離する前に培地 4 mL を含む 15 mL プラスチック チューブに転送します。</li>
		<li>上清を吸引し、5 mL の培地で細胞ペレットを再懸濁します。その後、T25 フラスコにセルを転送します。</li>
		<li>標準条件 (5% CO2、湿度 95% の空気、37 ° C) の下で細胞を養う</li>
	</ol>
</li>
	<li>分割<ol>
<li>顕微鏡で細胞の状態を確認します。セルが 80-90% の合流は、以下手順を実行を通じて 1.2.10 1.2.2 セルを分割します。</li>
		<li>滅菌ピペットで細胞の培養メディアを吸い出しなさい。</li>
		<li>4 mL のダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) で一度セルを洗浄し、吸引、DPBS。</li>
		<li>セル開始; をデタッチするまで、3 分の 37 ° C で培養する前にセルに 1 mL のトリプシン/EDTA 溶液 (TE) を追加します。顕微鏡下で剥離を確認します。</li>
		<li>2 ml の培養液中の細胞を再懸濁し、5 分の 200 x g で細胞を遠心分離します。上清を吸引し、培地 3 mL で再び細胞ペレットを再懸濁します。</li>
		<li>トリパン ブルー色素排除試金を使用して、細胞の生存を確認します。細胞懸濁液の 30 μ l をとり、トリパン ブルー チューブでの 0.4% 溶液 30 μ l を追加します。その後、3-5 回は 100 μ l ピペットを使用して、ソリューションを効果的にミックスします。ソリューションの 10 μ l をとり、検定の coverslip の下に置きます。</li>
		<li>検定の分野で実行可能なセルの合計数と死細胞数の両方を (青) カウントします。計算式を使用して細胞生存率 [%]: 細胞生存率 = 100-(100/総細胞数 x の死んだ細胞の数)</li>
		<li>新しい細胞培養 T25 フラスコまたは 6 ウェル プレートに再懸濁細胞ペレットの因数を転送します。T25 フラスコ内で培地 5 mL または 6 ウェル プレートの各ウェルに 1 mL の合計を達成するために細胞に培地を追加します。</li>
		<li>標準条件 (5% CO2、湿度 95% の空気、37 ° C) の下でインキュベーターで細胞を養う</li>
		<li>細胞が完全に合流されたら、彼らは実験のため準備ができています。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 気密室の準備
注: の気密室の工事計画図 1.に描かれています。
<ol><li>6.5 L の容量を持つ気密ポリプロピレン ボックスを使用します。長さ、幅、および高さが 30 x 20 x 15.5 cm、それぞれです。角が丸いためボックスのボリューム、理論量よりも低いのでご了承ください。</li>
	<li>横方向の壁の下側に 2.5 cm の直径の穴をドリルします。</li>
	<li>緑のマーク、ガス空気混合物の入力パイプとして機能し、シリコン シールとコルゲート チューブを挿入します。</li>
	<li>反対側壁の上にある目の 2.5 cm 径の穴をドリルします。</li>
	<li>赤いマークが別のコルゲート チューブを挿入し、ガス空気混合物の出力管として使用し、シリコン シール、木炭のフィルターで接続します。</li>
	<li>ボックスの平均の壁の中央にタイトな 4 mm 径の穴をドリルします。</li>
	<li>回転男性ルアーロック、ガス分析計に接続されますと、シリコン シールとマニホールドに接続されている短い点滴チューブを挿入します。</li>
	<li>気密室内デジタル温度計/湿度計を配置します。</li>
</ol>3. ハロゲン化剤 (セボフルランとイソフルラン) に肺胞上皮細胞を公開します。
メモ: デバイスの略図図 2.で描かれています。
注意: 動物の研究が胎児への害や障害不妊治療の証拠は認められなかった、帝王の中に非常に小規模な研究は母親あるいは胎児に任意の厄介な効果を示さなかったが、使用の安全性ハロゲン化剤 (例えば、セボフルランやイソフルラン) 分娩が日付に示されていません。さらに、人間妊娠中に制御データを収集しません。そのため、妊娠中は強く落胆する必要があります一方、セボフルランやイソフルランを用いた実験を実行しています。
<ol><li>研究室のレンジフードの下で働きます。</li>
	<li>二酸化炭素 (CO2) による亜酸化窒素のガス管線を切り替える麻酔器回路をカスタマイズします。</li>
	<li>グリーン マーク、コルゲート管の気密室をカスタマイズされた麻酔器回路に差し込みます。麻酔器とおよそ 37 ° C に流れ混合ガスを暖めるための気密室の間のパイプに温水加湿器 (ICU の人工呼吸器の使用など) を挿入します。</li>
	<li>暖房を提供するホット プレート上の気密室をインストール プレート温度 37 ° C</li>
	<li>置くの気密に hAELVI 細胞チャンバーし、蓋をシール 6、よくプレートを含みます。</li>
	<li>CO2の 5% と 95% 加湿空気の定義された、標準的な条件をすぐに取得する (すなわち空気と CO2の混合物) ガス流量を調節します。</li>
	<li>ハロゲン化剤の蒸発器を開き、必要な割合を選択 (本研究では、テスト セボフルランとイソフルランの濃度 4% と 1% それぞれ)。</li>
	<li>画面に外部ガス分析装置による測定と表示されているガスの混合物およびセボフルランやイソフルラン濃度の構成に注意してください。</li>
	<li>目標値が達成されれば、1 L/分に新鮮ガス流量を減らします。</li>
	<li>気密室は、実験のため必要な限りこのガス流量を維持できます。</li>
</ol>4. セボフルランやイソフルラン クロマトグラフィーを測定します。
<ol><li>試料の調製<ol>
<li>異なる時点で非常に簡単に開く研究サンプルを出す商工会議所 (現在の研究では、我々 使用 6 ウェル プレート) 蓋を閉じます。他のサンプルはそのままに。その後、マルチ ボリュームの調節可能なマイクロ ピペットで各サンプルに含まれている培地 1 mL を吸引します。</li>
		<li>媒体をテフロン シール キャップで密閉タイトなねじ込みすべき 10 mL ヘッド スペース クロマトグラフィー バイアルに入れ。あなたはすぐにそれらを使わない場合は、-20 ° C でクロマトグラフィー バイアルをフリーズします。</li>
		<li>原液セボフルランとイソフルランの別の原液メタノール 50 g/L の両方を準備します。同時に、2 g/l メタノール クロロホルム (内部標準、IS) の原液を準備します。-20 ° C ですべての標準溶液を保存します。</li>
		<li>セボフルランとイソフルラン吸入 50、500、5000 mg/L 超純水水/ジメチル sulfoxyde での作業ソリューションを準備 (50/50; v/v)。社内標準化の作業ソリューションはメタノールで 100 mg/L で固定されます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>細胞試料の分析 注: 抽出プロシージャはガス ・ クロマトグラフィーと質量ボルドーらから以前に検証済みのメソッドに基づいてください。1感性と特異性の同じパラメーターを使用します。セボフルランおよびクロロホルム (IS) がこのプロトコルで使用されていた、イソフルランは多重解析手法に関連付けられていた。簡単に言えば、質量獲得のため純粋なソリューション注射後メソッドが開発されました。その後、m/z は参照基準と文献データを確認しました。3 m/z は (IS) を除く各検体に選ばれた: 定量化 (最も豊富なおよびより高い)、豊かさが定量化, 曲線下の領域を統合することにより求めた 1 m/z と確認のため 2 m/z。3 m/z を使用すると、検体が特定すべて m/z 同じの保持時間があったのでと同様、全額 m/z (イオンの確認と定量化の相対的な) 純粋な規格で、すべてのサンプルで同じであったので。この買収のモードでは、検体識別でき, 特異性の定量化します。<ol>
<li>0.5 400 の濃度範囲で検 8 ポイントを構築 mg/L と複数品質コントロール (0.5、1、5、10、20、75、200、および 400 mg/L)。 メモ: 各校正を検証するため、4 つの品質コントロールに用い: 定量の下限 (C1 = 0.5 mg/L)、2 つの中間レベル (C2 = 20 mg/L と C3 = 75 mg/L) および最終的なレベル (400 mg/L で C4; 数量の上位レベル)。行列を避けるために培養細胞マトリックスのすべての基準とコントロールを行った各検量線の培養細胞と内部標準との干渉がなかったことを検証するため空白の行列を行った。</li>
		<li>原液セボフルランとイソフルランの別の原液メタノール 50 g/L の両方を準備します。同時に、2 g/l メタノール クロロホルム (内部標準、IS) の原液を準備します。-20 ° C ですべての標準溶液を保存します。その後、50、500、5000 mg/L の純水で混合セボフルラン/イソフルランの作業ソリューションを準備/ジメチル sulfoxyde (50/50; v/v)。実用的なソリューションが 100 mg/L メタノールで希釈しました。</li>
		<li>較正曲線とコントロール細胞試料 1 mL には (100 mg/L) の 50 μ L スパイキングによるサンプルを準備します。</li>
		<li>飽和塩化ナトリウム水溶液 10 mL ヘッド チューブ、テフロン シール キャップで密閉タイトなねじ込みの 200 μ L を試料溶液を準備します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ガス ・ クロマトグラフィーと質量分析法<ol>
<li>サンプル分析、ガス ・ クロマトグラフィー、質量検出法と相まってのヘッド スペース注射を使用します。</li>
		<li>ヒーター シェーカー 80 ° C で 10 分間のヘッド チューブを運ぶ。撤回し、ガスクロマト グラフにガス試料 1.5 mL を注入します。クロマトグラフィーの実行の開始時に 100 mL/分 2 分間でスプリット流れ 260 ° C でインジェクターのパラメーターを設定します。</li>
		<li>キャリア モードに設定されている圧をスプリット/スプリットレス注入器を使用します。最初、0.15 分 40 kPa でガス圧を保持します。その後、5 分の 300 kPa の圧力に 16 kPa/分の速度を設定する前に 125 kPa/分で 150 kpa 率プログラム圧を上げてください。</li>
		<li>同時注入には 60 ° C、1 分および増加のオーブンの温度 140 ° C の温度が 20 ° C/分の速度に達するまでが始まります。その後、250 ° C を達成するまで温度が再び上昇します。実行の合計時間は 7 分です。</li>
		<li>溶融シリカ毛細管カラム (30 m × 1.4 μ m、0.25 mm ID) を利用したクロマトグラフィー分離を行います。単一イオン監視 (SIM) の状態で大量の実験を実行し、115 と 87 (イオン イオン定量 m z 181、およびイオン資格 m/z 151 と 51 m/z 149 セボフルランの 2.30 分の保持時間 (RT) で同時に (イオン定量) m/z を監視資格) RT 2.8 min, と RT 3.70 分でクロロホルム 83 (イオン定量) の m を z にイソフルランの。</li>
		<li>重量二次フィットを使用してはの面積比によって細胞培養におけるイソフルランとセボフルランの濃度を決定します。セボフルランとイソフルランの定量化 (LLOQ) の下限は 0.5 mg/L と定量化 (ULOQ) の上限は 400 mg/L でした。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

提案プロトコルでは、セボフルランやイソフルランなどのハロゲン化麻酔薬の正確な割合に細胞を公開する簡単な方法について説明します。さらに、我々 はここで報告-初めて-セボフルランとイソフルラン吸入自体培養液中の濃度とガス留分の厳密な相関。この基本的なステップは今、私たち人間の肺胞上皮細胞の培養単分子膜ハロゲン化剤の効果を研究する私たちの気密室を安全に使用することができます。
現在、肺胞細胞セボフルランの影響を研究するほとんどの研究チームは、最初ハロゲン系のガスで飽和し、シールは、jar ファイルを使用します。この場合、セボフルランが代謝され、する揮発性の割合が低下する線形時間をかけて不安定なガス濃度につながるそれを推測することができます。ただし、セボフルランのガス留分と培養液中の濃度との相関が明らかに文献で報告されません。通常、これらの実験で使用されるセボフルランの濃度、ガス留分と MAC との間の単純な関係に基づいて選択します。MAC は 1965 年に導入され、モーター応答 (動き) を防ぐために必要な肺の水蒸気の濃度は、手術の刺激 (痛み)22...

急性呼吸窮迫症候群 (ARDS)、びまん性肺胞損傷、肺浮腫、および hypoxemic の呼吸不全によって特徴付けられる臨床的な症候群です。ARDS は、集中治療室 (ICU) 入学の 10% 以上、機械換気を必要とする ICU 患者の約 25% を表し、それはまだ 35-451の病院の死亡率と、臨床医のための認識の下で挑戦です。強烈な研究にもかかわらず、ARDS の薬理学的治療または予防の同定は、日付に失敗しました。ARDS の死亡率に貢献する 2 つの主要な機能: 障害肺胞液クリアランス (AFC) (すなわち、遠位部の肺空域から肺胞浮腫液の変化の吸収) と重度の炎症2。以来、ARDS の死亡率は高いまま、現在の取り組みも一次予防; を含める必要があります。しかし、重要な課題は ARDS を発症する可能性は誰と誰が得を ARDS ができない場合のリスクの高い患者を識別します。
セボフルランやイソフルランなど、揮発性のハロゲン化麻酔薬は、手術室で全身麻酔を提供するために広く使用されます。世界中で全身麻酔と換気3、毎年主要な手術よりも 2 億 3000 万の患者が必要し、臨床転帰と医療利用4 術後肺合併症に悪影響.セボフルラン プロポ フォールではなく使用は、呼吸器外科と ARDS と術後肺合併症5などの有害事象の重要な減少の患者で改善された肺の炎症と関連付けられました。同様に、イソフルランによる前処理は、ARDS6、7の実験動物モデルで血行動態、酸素、呼吸力学に対する保護効果を持っていた。肺合併症と同様の減少が最近、吸入麻酔剤を示すメタ分析で観察されている非心臓手術の転帰に吸入剤の影響に対処するため、さらなる研究が保証されているが-として静脈麻酔に反対-8心臓手術死亡率の削減に大幅に関連付けられています。
防止したり、肺の損傷を治療する ICU 患者の鎮静のため揮発性剤の使用に関する特定のプロスペクティブなデータは欠けています。ただし、いくつかの試験は今の ICU 患者の鎮静とセボフルラン吸入麻酔の安全性をサポート、前臨床研究は、吸入セボフルランとイソフルラン7,9ガス交換を改善、軽減に示されています。肺胞浮腫と ARDS の実験モデルでの減衰の炎症。また、イソフルラン タイト結合タンパク質の11の変調による歯槽毛管障壁の整合性を維持するのに対し、セボフルランはタイプ II の上皮細胞のダメージ10を軽減します。しかし、さらなる研究がどの程度吸入セボフルランとイソフルラン吸入から臓器保護の実験的証拠を人間に翻訳できることを確認する必要です。最初単一施設無作為化制御-試験 (RCT) 私たちのグループから発見 ARDS 患者における吸入セボフルランの早期使用は改良された酸素処理、いくつかのプロ炎症性マーカー、および減らされた肺上皮の減らされたレベルと関連付けられています。損傷、プラズマと肺胞液12で高度の glycation の最終製品 (sRAGE) の受容体の可溶性のレベルにより評価しました。
一緒に取られて、肺障害に対するセボフルランとイソフルランの有益な効果は、複数の生物学的経路または肺胞液クリアランス (AFC)、上皮損傷、すなわち怒り経路に依存している機能のプロセスを指すことが核因子 (NF) の転流-B とマクロファージ活性化。また、セボフルランが怒り蛋白質自体の表現に影響を与えます。並進運動のメカニズムの理解を提供する実験的モデルを考案した当社の調査チームなどによる前の調査は、ARDS の中に肺胞の炎症や肺上皮傷害/修理の怒りの極めて重要な役割をサポートするのでセボフルラン肺傷害と修復13,14,15。HAELVi (人間の肺胞上皮レンチ末梢肺の空気血液関門を研究に特化した新規ひと肺胞上皮プライマリ細胞ラインでセボフルランとイソフルランの生体外で影響を調べた不死化)、機能のタイトな接合16を含む型肺胞のような特性を持つ。
生体外で調査の設計を準備中 (など「吸入」セボフルランやイソフルランへの暴露と気液界面における肺胞上皮細胞の培養、わかったから以前に発表された研究セボフルランの分数は、「空気」インターフェイス17,18,19標準的なモニター (臨床設定で使用されるものに似ています) を使用してのみ評価されている.ハロゲン化剤濃度は通常最小肺胞内濃度 (MAC) 値に従って選ばれた (例えば、ヒト、セボフルラン、0.5、1.1、および 2.2 vol %、0.25、0.5、および 1 の MAC を表すそれぞれのイソフルラン、0.6、0.8 と0.25、0.5、および 1 の MAC をそれぞれ表す 1.3 vol %)20。確かに、セボフルランとイソフルラン吸入濃度決して行った従って実験モデル/楽器の前の有効性を制限すること自体は、培養液中で。また、ほとんどの実験は、空気のミックス含むセボフルランは内部フラッシュされていた後に封印された嫌気性の jar を使用しました。私たちの目標は、「生理」の条件下で肺胞上皮細胞を研究することだったと、そのような嫌気状態が最適ではないかもしれない、長い実験期間と互換性がないだろうと考えました。したがって、我々 は気液界面培養細胞に独自のシステムを開発、精密制御された「空気」分数とこれらのエージェント「中濃度を提供すること目的とハロゲン化剤 (セボフルランとイソフルラン) にそれらを公開。我々 の意見で文学にまで報告されていないが、この実験の手順はセボフルランとイソフルランのさらなる生体外で調査する前に必須です。

<table><tbody><tr><td>セボフルラン</td><td>バクスター</td><td></td><td>妊娠中にセボフルランまたはイソフルランを使用して実験を行うことは強くお勧めしません</td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>Virbac</td><td></td><td>妊娠中にセボフルランまたはイソフルランを使用して実験を行うことは強くお勧めしません</td></tr><tr><td>ヒト肺胞上皮細胞</td><td>InScreenex</td><td>INS-CI-1015</td><td></td></tr><tr><td>huAECミディアム(すぐに使える)</td><td>InScreenex</td><td>INS-ME-1013-500ml</td><td></td></tr><tr><td>麻酔器回路</td><td>ドレーガー</td><td>・ファビウス</td><td></td></tr><tr><td>ガス分析器</td><td>ドラジェー</td><td>ヴァモス・プラス</td><td></td></tr><tr><td>麻酔ガスフィルター</td><td>セダナメディカル</td><td>FlurAbsord</td><td></td></tr><tr><td>加熱式 加温器</td><td>フィッシャー&Paykel</td><td>MR850</td><td></td></tr><tr><td>Chamber</td><td>Curver</td><td>00012-416-00</td><td></td></tr><tr><td>質量検出と組み合わせたガスクロマトグラフィー</td><td>Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA</td><td>Trace 1310 with TSQ 8000evo</td><td></td></tr><tr><td>Fused-silica column (30 m x 1.4 &#956;m、0.25 mm ID)</td><td>Restek、Lisses、フランス</td><td>Rxi-624Sil MS</td><td></td></tr></tbody></table>

体外培養肺胞上皮細胞におけるハロゲン化ガスの濃度を制御する方法

In Vitro Method to Control Concentrations of Halogenated Gases in Cultured Alveolar Epithelial Cells

急性呼吸窮迫症候群 (ARDS) は、障害者の肺胞液クリアランスと重度の炎症びまん性肺胞損傷の症候群です。集中治療室 (ICU) 患者の鎮静のイソフルラン、セボフルランなどのハロゲン化剤を使用することができますガス交換を改善、肺胞浮腫を軽減、ARDS の中に炎症を弱めます。ただし、連続的な鎮静治療または肺の損傷を防ぐために ICU での吸入剤の使用上のデータは欠けています。「生理学的」条件下での肺胞上皮細胞におけるハロゲン化剤の効果を検討する我々 は気液界面培養細胞に対する簡単なシステムを記述して正確な制御「空気」分数を提供するハロゲン化剤にそれらを公開し、これらのエージェントの「中」の濃度。セボフルランやイソフルラン麻酔器回路によって提供されるガスの連続的な流れを使用して正確な制御された分数にさらされるひと肺胞上皮不死化細胞とプレートで密閉気密室を開発しました。細胞は、24 時間 4% セボフルランとイソフルランの 1% にさらされました。ガス質量分析法は、媒体に溶解したハロゲン化剤の濃度を決定するため行われました。最初の後時間, セボフルランとイソフルラン吸入中の濃度であった 251 mg/L と 25 mg/L。セボフルランとイソフルランの濃度を表す曲線は、時間をかけて、1 時間暴露後に達した高原と類似したコースを示した媒体に溶解しました。
このプロトコルは、セボフルランやイソフルラン体外ARDS の間に上皮性肺障害に関与するメカニズムの私達の理解を改善するためとの新規治療法をテストするための正確かつ制御された濃度に到達するために設計されました、症候群。

セボフルランとイソフルランは、時間の経過と共に媒体に溶解、濃度は表 1と表 2にそれぞれ報告しました。
媒体におけるセボフルランとイソフルラン吸入濃度のコースは時間をかけて同様であった。ハロゲン化剤の必要な濃度が設定された直後後は、最初の 1 時間濃度が上昇しました。高原はハロゲン化エージェントの管理を停止するまでに保持する、その後、達されました。管理の中断後の濃度低下 1 時間 (図 3)。
最初の後時間, セボフルランとイソフルラン吸入中の平均濃度が 251 mg/L と 25 mg/L、それぞれ。別の実験の間に有意な差が見つかりませんでした。
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具体的に達するように設計正確かつ制御された濃度セボフルランやイソフルランの in vitroの上皮性肺障害に関与するメカニズムの私達の理解を改善するために、小説をテストする簡単なプロトコルについて述べる急性呼吸窮迫症候群の治療。

Acute respiratory distress syndrome (ARDS) is a syndrome of diffuse alveolar injury with impaired alveolar fluid clearance and severe inflammation. The ...

この方法は、急性呼吸窮迫症候群の潜在的な新しい治療法としてハロゲン化付加物をテストするなどの肺損傷および修復の研究分野における重要な質問に答えるのに役立つ。この技術の主な利点は、細胞を培養し、正確で制御された濃度に到達するためにハロゲン化剤にそれらを公開する非常に簡単な方法に依存していることです。気密室を構成するには、6.5リットルの容量を持つ密閉ポリプロピレンボックスを使用してください。箱の側面の底面に直径2.5センチの穴を開けます。次に、ガス空気混合入力パイプとして機能する緑色のマークを持つ波形チューブを挿入します。そして、シリコーンでそれを密封します。次に、反対側の側面の上側に直径2.5センチメートルの2番目の穴を開けます。赤いマークを付けた別の波形の管を挿入し、ガス空気混合ガス出力パイプとして機能する炭フィルターとそれを接続します。その後、シリコーンでそれを密封します。その後、壁の中央に4ミリメートルの直径を持つタイトな穴を掘削します。回転する男性のルアーロックで多様体に接続されている短い注入チューブを挿入します。ガス分析装置に差し込み、シリコーンで密封します。その後、気密室の中にデジタル温度計を置きます。実験室の抽出器のフードの下で、二酸化炭素によって亜酸化窒素ガスラインを切り替えるために麻酔機械回路をカスタマイズする。麻酔機と気密室の間のパイプに加熱加湿器を挿入し、ガス流れの混合物を約37°Cに温めます。緑のマーク付き段ボールチューブで気密室をカスタマイズされた麻酔機械回路に差し込みます。次に、気密室を37°Cに設定したホットプレートの上に置きます。ヒト肺胞上皮細胞を含む6つのウェルプレートを気密室に入れ、蓋を密封します。ガス流量を調整して、CO2の5%を迅速に得る。次いでハロゲン化剤蒸発器を開き、所望の割合を調整します。目標値が達成されたら、新鮮なガスの流量を1分あたり1リットルに下げます。気密室は実験のために必要な限りこのガス流量と維持することができる。培地中のセボフルランおよびイソフルラン濃度のコースは、時間の経過とともに類似していた。ハロゲン化剤の必要濃度が設定された直後に、最初の1時間にわたって濃度が上昇した。その後、ハロゲン化剤の投与が停止するまで持続する高原に達した。投与中断後、濃度は1時間以内に減少した。ここに示されているのは、気体分析装置で測定された気密室における時間経過に伴うハロゲン化剤の分画である。この手順は比較的安価で、研究者が以前に気密室を操作したことがない場合でも採用するのは非常に簡単です。この手順に従って、タンパク質およびRNA定量、免疫蛍光、タンパク質透過性および遊離輸送の測定のような他の方法は、上皮肺損傷およびその分解能の間にハロゲン化剤の特定の効果に関する質問に答えるために行うことができる。その開発後、この技術は、ARDS中の上皮性肺損傷に関与するメカニズムをさらに研究し、新しい治療法をテストするために、急性呼吸窮迫症候群の分野での研究への道を開く可能性があります。

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Research

JoVE Journal

Medicine

医学

肺上皮細胞は、マウスの気道から分離し、差別化された呼吸上皮のモデルとしての気液界面で培養することができます。プロトコルは、分離培養し、この環境毒素への分子応答を研究するために、たばこの主流煙にこれらの細胞を露出させるための記述されています。...

エアー液界面におけるマウスの呼吸器上皮細胞と実験たばこの煙への暴露の分離

本報告書における調査結果と結論は著者のものであり、必ずしも疾病管理予防センターの見解を示すものではない。...

呼吸器病原体に対する宿主細胞応答を研究するために偏ヒト気道上皮Calu-3細胞の液体に覆われた文化の確立<em&gt;インビトロ</em

このプロトコルは、有毒な化学物質を吸入するための細胞培養物の露光方法を実証するために設計されている。差別化され気液界面の気道上皮細胞の（ALI）の文化の暴露は、塩素などの有毒ガスに対する気道曝露のユニークなモデルを提供します。本稿では、上皮細胞および心筋細胞の液体培養の気液界面培養物における塩素曝露の影響を記載している。 インビトロ露光システムは、重要な機構的研究は、次いで、新規な治療薬を開発するために利用することができる経路を評価することを可能にする。...

有毒吸入化学試験のためのin vitroでの細胞培養モデルにおける

我々は、空気-液体界面(ALI)で培養されたヒト肺細胞を暴露することにより、急性肺細胞傷害性に関する空気中の粒子のスクリーニングおよびモニタリングのための堅牢で移動可能で予測可能なインビトロ曝露システムを提示する。...

空気-液体界面で培養したヒト肺細胞を曝露した空気中粒子の急性吸入毒性の評価

ここでは、ピペットエレクトロポレーション技術に結合した誘導発現系を用いて、一次肺胞上皮細胞における転写物の転写後変調を研究するために使用できるツールを提示する。...

原発性歯槽上皮細胞におけるmRNA転写物の安定性の研究のための効率的な転写制御プラスミド発現システム

ここでは、原発性ヒト単球単球単球の分離に関するプロトコルと、マクロファージおよび樹状細胞への分化、および上皮細胞を有する多細胞ヒト肺モデルへの組み立てのためのプロトコルを提示する。免疫細胞からなる共培養物の生物学的応答は、単球または解凍された単球から分離し、炎症促進性刺激に曝露した際に、比較される。...

危険評価のための上皮細胞と原発性免疫細胞からなる多細胞ヒト歯槽モデル

説明は、毒性試験のために粒子への吸入を繰り返し暴露するためのインビトロ気管支モデルの細胞培養および曝露方法である。...

毒性試験のための空気中の粒子への現実的な反復吸入暴露のための気管支上皮モデル

本プロトコールは、ヒト人工多能性幹細胞由来2型肺胞上皮様細胞(iAT2s)を記載する。これらの細胞は、3D培養において自己再生スフェアとして培養することも、気液界面(ALI)培養に適合させることもできる。...

ヒト人工多能性幹細胞由来2型肺胞上皮細胞の3Dスフェアおよび2D気液界面培養物の生成

ここでは、マウス気道上皮細胞を単離および分化するための in vitro...

タバコ煙抽出物で刺激したマウス気道上皮細胞上のマルチオミクスの分化と変化を研究するためのin vitroモデル

私たちは、気液界面での大麻蒸気曝露を研究するための標準化された in vitro...

インビトロ 気液界面における肺上皮細胞の大麻曝露

学ぶ、肺胞上皮細胞におけるハロゲン化ガス濃度の精密制御法。sevofluraneやisofluraneを用いた閉鎖チャンバー構築により、急性呼吸窮迫症候群の治療法開発と肺損傷メカニズム解明に貢献します。

体外培養肺胞上皮細胞におけるハロゲン化ガスの濃度を制御する方法

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