Name: 成体マウスの遺伝子組換えアデノ随伴ウイルスの直接髄腔内注入 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: 学ぶ成体マウスにおける遺伝子組換えアデノ随伴ウイルスの直接髄腔内注入法。リドカインを用いた一過性麻痺スコアリングにより、中枢神経系への導入効率を評価し、ALSなどの神経疾患治療研究に応用する。

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この作品は、河北省の人材開発省と社会保障 (CY201605) からの助成金と河北省 (H2017206101) の自然科学財団からの助成金によって賄われていたし、広平 Gao の AAV をいただいた先生にはとても感謝しております本研究では。

FVB/ニュージャージー州マウス キー河北内科研究室の動物施設で飼育されました。すべてのマウスの実験によって第 2 病院の河北医科大学倫理委員会の承認され、科学省と中華人民共和国の技術によって公布された実験動物管理の規制に従って実施中国。
1. 20% リドカイン塩酸原液の調製
<ol><li>リドカイン塩酸塩の 2 グラムの重量を量る。5-6 mL の滅菌水の渦をそっと追加します。音量を 10 mL の滅菌水での合計。</li>
	<li>1.2 0.2 ミクロンのフィルターを通して原液をフィルターします。因数原液、1 mL あたり 1.5 mL 遠心チューブとシール フィルムでシールします。4 ° C でのストア</li>
</ol>2. 覚醒マウスで直接髄腔内 AAV 配信
<ol><li>70% エタノールで滅菌ガーゼを使用する作業領域をワイプし、表 1で述べたように必要な用品を準備します。</li>
	<li>滅菌 200 μ L 遠心チューブに rAAVrh10 原液 (5 x 10 の12ゲノム コピー/mL) の 95 μ L を追加することで複雑な AAVrh.10/1% リドカイン塩酸塩の 100 μ L を準備し、20% リドカイン塩酸原液の 5 μ L を追加します。上下にピペッティングでよく混ぜます。その後、氷 (4 ° C) の上ウイルス ソリューションを保存します。 注: 8 μ L/マウス4が使用されます。</li>
	<li>
AAV ソリューションと注入用の注射器の準備
	<ol>
<li>ハミルトン 27 G 針とシリンジし、注射器の体積のスケールで針の斜めのヒントを合わせて 25 μ L を組み立てます。</li>
		<li>注射器にウイルス ソリューションの 4 x 1010ゲノム コピー 8 μ L を軽く引きます。空気の泡を削除することを確認します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
マウスを準備 注:男性または女性/ニュージャージー州 FVB マウス (30-70 日古い) はこの研究で使用されました。IT の注入は、フードで作動しました。<ol>
<li>70% エタノールでフード内の作業領域を消毒します。ボンネットの腹臥位で bedpiece に目がさめているマウス (男性または女性、30-70 日齢、13-20 グラムの重量を置きます。マウスを落ち着かせ、かまれることを避けるために滅菌ガーゼで上半身をカバーします。</li>
		<li>適切に、しっかりと、反対側の 1 つの側と人差し指/中間指の親指でその骨盤ガードルを掴んで動物を修正します。親指と人差し指をピンと張った二国間の骨盤ガードルの間肌を保ちます。手のひらで動物の上半身に優しくを保持します。</li>
		<li>二国間の骨盤ガードルの背中の毛を剃るし、ヨウ化ベースのスクラブと、70% エタノールで皮膚の表面を消毒します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
髄腔内注入12
	<ol>
<li>親指、またはもう一方の手の人差し指で両側の骨盤ガードル間中央線に沿って椎間腔を感じるし、L5 L6 椎間腔を示す指の爪でインデントを押します (注射部位を見つけます)。</li>
		<li>少し、優しく、尾の根元を回転させる脊柱の正中線を示す。(2.3.1 のステップに記載) 注入の前に動物の頭に向かって針かさを調整します。</li>
		<li>動物がしっかりと固定されて、脊柱の正中線に沿って針を配置していることを確認します。</li>
		<li>ゆっくりと垂直に針を挿入 (または少し 70 ~ 80 ° の傾斜) インデントし中央の矢状面における注射器の交差点で。それは、骨を接続するときゆっくり約 30 ° までの角度を減らし、椎間腔に針を入れます。 注:明らかに突然尾フリックは硬膜内空間に成功したエントリの兆候です。椎間腔に入ると針、針の先端をしっかりとクランプ感じるでしょう。本研究で使用される 27 G 針はマウス、ラットではなく IT 配信に適しています。</li>
		<li>(2.2 のステップに記載) ベクトル溶液を注入します。タイマーを開始し、終えた後 1 μ L/4 s 針約 1 分保持の速度ベクトル ソリューションの 8 μ L を注入配信。漏れを避けるために緩やかな回転で針を撤回します。</li>
		<li>注入品質4を評価する配信後すぐにマウスの一時的な弱さ手足をスコアします。 注:標準の4通りです。スコア 0: 脱力感。スコア 1: 歩行異常; なく後肢の弱さを小2 のスコア: 明白な歩行異常; と後肢の弱さを中程度3 のスコア:; 後肢の麻痺を完了4 のスコア: 後肢の麻痺、呼吸、息切れ、前部肢; の適度な弱さを完了5 のスコア: すべての 4 つの手足の麻痺と明らかに息切れを完了します。</li>
		<li>麻痺からの回復のためケージにマウスを移動します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
クリーンアップ
	<ol>
<li>1 mL 滅菌水で注射器をフラッシュします。実験室の供給を並べ替え、オートクレーブ滅菌のすべての非使い捨ての材料を収集します。70% エタノールでベンチをクリーンアップします。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3 免疫組織化学染色ティッシュの準備
<ol><li>
組織の採取
	<ol>
<li>21 日 3% 抱水クロラール (0.1 mL/10 g) の投与後のマウスの腹腔内投与によって深く麻酔します。</li>
		<li>20 ml の冷たい 0.01 M PBS (NaCl 147 mM の transcardially を灌流します。NaH2PO4 1.9 mM;K2HPO4 pH 7.4 8.1 mM) まず、し 4% 冷たいパラホルムアルデヒド (0.01 M PBS) のポンプ (10 mL/分 1 分、9 分、5 mL/分)。 注意:パラホルムアルデヒドは発ガン性、有毒です。手袋を着用しながらの発煙のフードでのみ処理します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
脊髄や脳の解剖
	<ol>
<li>発泡ボックス カバーの腹臥位で注射針で手足とそれぞれの動物の頭を修正し、ストリップ、ハサミで仙骨に頭から皮膚を削除します。</li>
		<li>頭蓋骨の目の間をクリップ、頭蓋骨と小脳に水平線の真ん中のルートと一緒にカットして、両側に頭蓋骨を開きます。</li>
		<li>ピンセットで後頭骨を持ち上げ、眼科用のハサミで両側脊柱管を開きます。両側に肋骨を切断し、椎骨の上半分を慎重に削除します。</li>
		<li>ピンセットを使って脳をリフトし頭蓋底の神経を断絶し、全脳と脊髄を慎重に分析します。後 24 時間 4% パラホルムアルデヒドで組織を修正します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
組織スライスの準備
	<ol>
<li>Cryoprotect 脳と頚椎と腰椎の脊髄 30% ショ糖液に一晩 4 ° C で最適な切削温度 (OCT) 化合物にティッシュを埋め込むし、高速液体窒素で凍結します。</li>
		<li>クライオスタットを用いた 25 μ m で組織を切断し、使用のための 4 ° C で 0.01 M PBS で凍結切片を格納します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 免疫組織化学
<ol><li>1% H2O2 、10 分間で浮遊セクションを前処理し、ブロッキング溶液 5% 血清と 1 h の PBS で 0.3% 非イオン性洗剤で 10 分間加温 PBS で洗浄します。</li>
	<li>4 ° C で一晩対応する一次抗体とスライスを孵化させなさいPBST のセクションを洗う (0.2 %pbs でトゥイーン 20) (10 分ごと) ために 3 回の 30 分のため。</li>
	<li>1 h. pbst; 洗浄 (10 分ごと) ために 3 回の 30 分の室温で対応するビオチン二次抗体とスライスを孵化させなさい。</li>
	<li>親和性ビオチン ペルオキシダーゼ 40 分間複雑なセクションを孵化させなさいし、achromogenic エージェントで染色します。スライド セクションをマウントし、きちんと乾燥します。</li>
	<li>5 分の無水エタノールとキシレン 10 分間スライドを浸漬し、メディアをマウントをスライドをシールします。最後に、100 倍、200 倍、400 x 倍率で電荷結合素子 (CCD) を搭載した顕微鏡のスライドをイメージします。</li>
</ol>

<ol><li>Murlidharan, G., Samulski, R. J., Asokan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+adeno-associated+viral+vectors+in+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Biology of adeno-associated viral vectors in the central nervous system.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 7, 76(2014).</li>
<li>Lentz, T. B., Gray, S. J., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22001604">Viral vectors for gene delivery to the central nervous system.</a> Neurobiology Disease. 48 (2), 179-188 (2012).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+CNS+transduction+of+adult+mice+by+intravenously+delivered+rAAVrh.8+and+rAAVrh.10+and+nonhuman+primates+by+rAAVrh.10%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Global CNS transduction of adult mice by intravenously delivered rAAVrh.8 and rAAVrh.10 and nonhuman primates by rAAVrh.10.</a> Molecular Therapy. 22 (7), 1299-1309 (2014).</li>
<li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Single+Injection+of+Recombinant+Adeno-Associated+Virus+into+the+Lumbar+Cistern+Delivers+Transgene+Expression+Throughout+the+Whole+Spinal+Cord%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">A Single Injection of Recombinant Adeno-Associated Virus into the Lumbar Cistern Delivers Transgene Expression Throughout the Whole Spinal Cord.</a> Molecular Neurobiology. 53 (5), 3235-3248 (2016).</li>
<li>Hastie, E., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+at+50%3A+a+golden+anniversary+of+discovery%2C+research%2C+and+gene+therapy+success--a+personal+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus at 50: a golden anniversary of discovery, research, and gene therapy success--a personal perspective.</a> Human Gene Therapy. 26 (5), 257-265 (2015).</li>
<li>Hocquemiller, M., Giersch, L., Audrain, M., Parker, S., Cartier, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-Associated+Virus-Based+Gene+Therapy+for+CNS+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Adeno-Associated Virus-Based Gene Therapy for CNS Diseases.</a> Human Gene Therapy. 27 (7), 478-496 (2016).</li>
<li>Tanguy, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+AAVrh10+provides+higher+transgene+expression+than+AAV9+in+the+brain+and+the+spinal+cord+of+neonatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Systemic AAVrh10 provides higher transgene expression than AAV9 in the brain and the spinal cord of neonatal mice.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 36(2015).</li>
<li>Federic, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+spinal+motor+neuron+transduction+following+intrathecal+delivery+of+AAV9+in+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Robust spinal motor neuron transduction following intrathecal delivery of AAV9 in pigs.</a> Gene Therapy. 19, 852-859 (2012).</li>
<li>Ayers, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+and+efficient+transduction+of+spinal+cord+and+brain+following+neonatal+AAV+injection+and+potential+disease+modifying+effect+in+ALS+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Widespread and efficient transduction of spinal cord and brain following neonatal AAV injection and potential disease modifying effect in ALS mice.</a> Molecular Therapy. 23 (1), 53-62 (2015).</li>
<li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+Intrathecal+Injection+of+rAAVrh10+Enhances+its+Transduction+of+Spinal+Cord+and+Therapeutic+Efficacy+in+a+Mutant+SOD1+Model+of+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Slow Intrathecal Injection of rAAVrh10 Enhances its Transduction of Spinal Cord and Therapeutic Efficacy in a Mutant SOD1 Model of ALS.</a> Neuroscience. 365, 192-205 (2017).</li>
<li>Borel, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+rAAVrh10+Mediated+SOD1+Silencing+in+Adult+SOD1%28G93A%29+Mice+and+Nonhuman+Primates%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Therapeutic rAAVrh10 Mediated SOD1 Silencing in Adult SOD1(G93A) Mice and Nonhuman Primates.</a> Human Gene Therapy. 27 (1), 19-31 (2016).</li>
<li>Fairbanks, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+delivery+of+analgesics+in+experimental+models+of+pain+and+analgesia%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Spinal delivery of analgesics in experimental models of pain and analgesia.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 55 (8), 1007-1041 (2003).</li>
<li>Hylden, J. L., Wilcox, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrathecal+morphine+in+mice%3A+a+new+technique%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Intrathecal morphine in mice: a new technique.</a> European Journal of Pharmacology. 67, 313-316 (1980).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+spinal+cord+transduction+by+intrathecal+injection+of+rAAV+delivers+efficacious+RNAi+therapy+for+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Widespread spinal cord transduction by intrathecal injection of rAAV delivers efficacious RNAi therapy for amyotrophic lateral sclerosis.</a> Human Molecular Genetics. 23 (3), 668-681 (2014).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((scAAV9-VEGF+prolongs+the+survival+of+transgenic+ALS+mice+by+promoting+activation+of+M2+microglia+and+PI3K%2FAkt+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">scAAV9-VEGF prolongs the survival of transgenic ALS mice by promoting activation of M2 microglia and PI3K/Akt pathway.</a> Brain Research. 1648, Pt A 1-10 (2016).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

技術的には、目を覚ましマウスにおける IT 注入中にいくつかの重要な手順があります。まず、適切な操作全体を通じてマウスのジェスチャーと事務所のコントロールが正しく配信されるための前提条件。第二に、最も困難な点はない抵抗せずにあまりにも深く挿入または動物が負傷または針の先端を曲げの場合強い抵抗の下で強制的に挿入する必要がある、針の先端と椎間腔を感じです。第三に、リドカインによる一過性の麻痺は、注入品質の客観的指標を提供しますが、一貫性のある結果を達成するためにより多くの練習が必要です。
本報告では, IT 注射成功の程度の指標としては、遺伝子治療の有効性の予測因子としてのリドカインを提供しています、AAV の配信のため目がさめているマウスで直接髄腔内注入法を開発しました。実験直接腰椎穿刺鎮痛・麻酔で、脊髄にエージェント、特に麻酔を提供では、中枢神経系疾患の遺伝子治療で強く推奨されています。マウスのようなより小さい動物で IT 注入の難易度は、与えられた我々 は直接腰椎穿刺の 2 つのアプリケーションを組み合わせるし、局所麻酔薬 (リドカイン、使用されている診療所で広く注入品質の客観的...

AAV はいくつかの副作用と中枢神経系の情報伝達における長期的かつ広範な遺伝子発現を仲介することができます、したがって筋萎縮性側索硬化症 (ALS)、ハンチントンを含む中枢神経系疾患を治療する遺伝子治療のための最も有望な車の 1 つになりました病気 (HD)、アルツハイマー病 (AD)、ライソゾーム病 (LSD)、ゴーシェ病 (GD)、神経セロイドリポフスチン症 (NCL)1。現在、100 以上の AAV の血清型は人間や動物から分離されています。これらのうち、少なくとも 12 は、臨床で使用されている、最もよくを含む臨床試験使用遺伝子ベクターなど AAV1、2、4、5、6、8、9、rAAVrh.8、および rAAVrh.101,2,3,4、 5,6。
中枢神経系のさまざまな病気は、様々 な中枢神経系の影響を受ける地域や細胞の種類により異なる AAV 配信戦略を必要とします。中枢神経系領域およびセル AAV が変換できる型は血清型によって異なります配信方法だけでなく。たとえば、rAAVrh10 は、ニューロンとグリア細胞髄腔内注入4,7で配信されたときそれが導入に対し、主に全身の静脈内投与 (IV)、配信時はアストロ サイトを変換する示されています。実質内注入は、注射部位の近くにローカル伝達の結果さらに、広範な中枢神経系伝達8 結果として脳から脳脊髄液 (CSF) 注入またはくも膜下腔内注射に対し.研究も示している神経変性疾患における AAV 配信遺伝子療法の治療上の効力によって管理9,10,11。ALS など中枢神経系の広範な領域に影響する疾患、全身配信メソッド4,10と比較して、低い線量と病気に悩まされ、ほとんどの区域をカバーする CSF への髄腔内注入を示されています。最近の研究では、その腰椎穿刺は、ALS は、椎弓切除術、髄腔内カテーテル4に関連付けられている潜在的な傷害を避けるためのマウスモデルの AAV を注入する使用ことができますが示されています。
実験直接腰椎穿刺は、配信エージェント、特に麻酔薬、鎮痛および 188512,13の麻酔で、脊髄に初めて使われました。本報告では、腰椎穿刺、評価してインジェクションの品質を監視する注入剤でアミド由来のローカルの麻酔 1% リドカイン塩酸塩の助けを借りて成体マウスの IT 注入法を示しています。成功した注射は、失敗した注射がこの現象を示さなかったに対しリドカインによる一時的なまひ状態によって示されました。注入効率を予測する 5 つの等級の 1 つとして一時的な弱さのレベルを分類しました。最後に、麻痺の等級によって rAAVrh10 伝達レベルを予測できることを示す.したがって、このくも膜下腔の AAV の配信方法は、中枢神経系疾患の治療実験 AAV を介した遺伝子導入を強化する使用できます。

<table><tbody><tr><td>FVB/NJ マウス</td><td>チャールズ リバー ラボラトリーズ 中国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>リドカイン 塩酸塩 一水和物</td><td>HEOWNS</td><td>73-78-9</td><td></td></tr><tr><td>AAV</td><td>ウイルス ベクター コア マサチューセッツ大学医学部</td><td></td><td></td>の遺伝子治療センターのコア</tr><tr><td>25 & マイクロ;L&nbsp;ハミルトン シリンジ/27-30 G ニードル</td><td>ガスタイト</td><td>1702</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T compond</td><td>さくら</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>H 2O 2SHUI</td> <td>HUAN PAI</td><td></td><td></td></tr> 170401 <tr><td>ヤギ血清</td><td>Solarbio</td><td>S9070</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>LIFE SCIENCES</td><td>T8200</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-GFP</td><td>Life tech</td><td>G10362</td><td>1:333 希釈</td></tr><tr><td>2 番目の抗体 (ヤギ抗ウサギ)</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>111-005-144</td><td>1:1,000 希釈</td></tr><tr><td>ベクタステイン ABC 試薬</td><td>Vector Lab</td><td>PK-6100</td><td></td></tr><tr><td>ImmPACT DAB ペルオキシダーゼ 基質キット</td><td>Vector Lab</td><td>SK-4105</td><td></td></tr><tr>DAPI <td>Vectorshield</td><td>H-1200</td><td></td>NaCl<td>による蛍光用封入剤</td></tr><tr><td></td><td>永達化学NaH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2PO4&middot;2H2O</td><td>Yong Da Chemical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4&middot;12H2O</td><td>Yong Da 化学</td><td></td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Yong Da 化学</td><td>307699</td><td></td></tr><tr><td>接着顕微鏡 スライド</td><td>CITOGLAS</td><td>17083</td><td>25 mm x 75 mm</td></tr><tr><td>SUPER-SLIP MICRO-GLAS</td><td>電子顕微鏡 Siences</td><td>72236-60</td><td>24 mm x 60</td></tr><tr><td>mm 15 mL 遠心分離管</td><td>CORNING</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>96 well細胞培養クラスター</td><td>Coster</td><td>3599</td><td></td></tr><tr><td>24 well 細胞培養クラスター</td><td>Coster</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>70% エタノール</td><td>WEN ZHI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gauze</td><td>Wei AN</td><td>05171112</td><td>8 cm x 10 cm x 12</td></tr><tr><td>cm 1 mL syringe</td><td>Hong Da</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microtubes</td><td>Plasmed</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropipet&nbsp;</td><td>エッペンドルフ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ペペットチップ</td><td>レイニン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>センチリフュージ</td><td>エッペンドルフ</td><td>5427R</td><td></td></tr><tr><td>レジェレーター</td><td>ハイアール</td><td>BCD-539WT</td><td></td></tr><tr><td>フィルター</td><td>MILLEX GP</td><td>R4PA42342</td><td></td></tr><tr><td>ポンプ</td><td>LongerPump</td><td>BT-100-2J/YZ1515X</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>BX53</td><td></td></tr><tr><td>冷凍ミクロトーム</td><td>Leica</td><td>CM1520</td><td></td></tr></tbody></table>

成体マウスの遺伝子組換えアデノ随伴ウイルスの直接髄腔内注入

Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice

アデノ随伴ウイルス (AAV) の髄腔内 (IT) 注入は、中枢神経系中枢神経系遺伝子治療の安全、非侵襲性、優れた伝達効果のおかげでかなりの関心を集めています。前の調査は管理で、それによって神経変性疾患における AAV 配信遺伝子療法の治療の有効性を実証しています。ただし、高率で小動物の IT 管理の技術的な制限により予期しない失敗が報告されています。ここでは、我々 は注射液に 1% リドカイン塩酸塩を加えることによって小動物での腰椎穿刺の成功の程度を示す得点システムを確立しました。さらに注入過渡の弱さの程度が AAV の伝達効率を予測できることを示します。したがって、この IT 注入法は、中枢神経系の幅広い領域を苦しめる中枢神経系疾患のマウスモデルでの治療試験を最適化するために使用できます。

マウスは 1% リドカイン塩酸塩を投与するとの様々 な質のためにそれの直後に一時的な弱さの程度が異なるの AAV 溶液注入示した。半定量の 5 段階採点システムを設けて、に従って私達はリドカイン誘導肢の弱さの程度が異なるとマウスの AAV の伝達パターンをテスト (スコア 0、n = 2; スコア 1、n = 1; スコア 4、n = 4; スコア 5、n = 3)。脊髄の EGFP 免疫マウスの no か少し得点 0 マウスの腰椎の脊髄に伝達、得点 1、マウスでやや強化された伝達、強力かつ広範な伝達を示した得点 4 または 5 (図 1A)。脊髄損傷の程度と密接に相関注射後一時的な手足の脱力 (図 1B) の様々 な程度を表示するこれらのマウスの染色と結論づけた GFP の弱点の深刻度を定量化我々伝達。
<p class="jove_content" fo:keep-toget...

小動物に効率的なアデノ随伴ウイルス配信しているし、中央に伝達効率を予測するスコアリング システムを確立するウイルス ソリューションで 1% リドカイン塩酸塩を使用して直接髄腔内注入法を紹介します。リドカインによる一時的な弱さの程度によると神経系。

Intrathecal (IT) injection of adeno-associated virus (AAV) has drawn considerable interest in CNS gene therapy by virtue of its safety, noninvasiveness, ...

この方法は、ALSなどの中枢神経系疾患の実験的処置のために、覚醒小動物におけるアデノ関連ウイルストランス遺伝子の効率的なアデノ関連ウイルストランス遺伝子の効率的な内腔送達を促進する。この方法の主な利点は、ウイルス溶液が正常に注射した後に一過性麻痺を誘発する1%リドカイン塩酸塩を含むということです。この方法は、自動状態の結果を判断するための視覚的な指標を提供するが、配信の成功率を向上させるためには十分な練習が不可欠である。手順を開始する前に、27マイクロリットルのハミルトン注射器に27ゲージの針を取り付け、針のベベリング先端をシリンジの容積スケールに合わせます。その後、慎重に気泡を避けるために注意して、注射器にウイルス溶液の10番目のゲノムコピーに4 x 10の8マイクロリットルをロードします。次に、バイオセーフティフードの起こりやすい位置にあるベッドピースの上に30〜70日齢の12〜30グラムのマウスを置き、上半身を無菌ガーゼで覆い、マウスを落ち着かせ、噛まれないようにします。片方の側に親指を置き、反対側の人差し指と中指で骨盤ガードルの上にマウスをしっかりと握り、両側の骨盤ガードルの間の皮膚を親指と人差し指で張ります。その後、両側骨盤ガードル間の毛皮を剃り、ヨウ素ベースのスクラブと70%エタノールで露出した皮膚を殺菌する。アデノ関連ウイルス溶液の直接の内腔内送達のために、両側骨盤ガードル間の正中線に沿って椎間空間を触診し、指の爪を使用して皮膚へのインデントを抑制し、L5〜L6椎間腔を示す。尾の基部を少し軽く回転させて背骨の正中線を明らかにし、針のベベルを動物の頭に向かって調整します。マウスをしっかりと固定して、脊椎の正中線に針を合わせ、注射器を中央の矢状平面に保つインデントの中央に針を静かに垂直に挿入します。針が骨に接触したら、ゆっくりと角度を約30度に下げ、針を椎間腔に滑り込まします。突然の尾のフリックは、硬膜内空間への正常な入り口の兆候です。針が椎間スペースに入ると、先端はしっかりと締め付けられた感じになります。ベクター溶液を注入し、1分間硬膜内空間内で針を維持する。その後、ゆっくりと漏れを最小限に抑えるために回転で針を引き出します。マウスの手足の一過性の弱さをすぐにスコアリングして注射の品質を評価し、マウスをそのケージに戻して麻痺から回復します。適切な実験エンドポイントで、注入されたマウスの手足と頭部をフォームボックスカバーの起こりやすい位置に固定し、はさみを使用して頭から仙点に皮膚を剥ぎ取って取り除きます。目の間に頭蓋骨をクリップし、頭蓋骨の正中線と小脳の上の水平線に沿って切り取り、両側の頭蓋骨を開きます。後頭部骨を取り除き、眼科用はさみを使用して脊柱管を両側で開きます。両側のリブを切り、椎骨の上部を慎重に取り除きます。湾曲したピンセットを使用して脳を持ち上げ、頭蓋骨の基部の神経を切断します。その後、慎重に脳と脊髄全体を抽出し、24時間4%パラホルムアルデヒドで組織を修正します。固定期間の終わりに、脳と子宮頸部および腰椎脊髄を摂氏4度で一晩30%スクロース溶液で凍結保護し、続いて液体窒素中で凍結する前に最適な切断温度化合物に埋め込む。次に、クライオスタットを使用して各組織の厚さ25マイクロメートルの部分を得て、得られるように0.01モルPBSで凍結したセクションを摂氏4度で保存する。組織の免疫組織化学的分析のために、1%過酸化水素で遊離浮遊部を10分間退出し、続いてPBSで10分間洗浄する。次に、PBSに5%血清および0.3%非イオン性洗剤を含むブロッキング溶液中のサンプルを1時間インキュベートし、その後、適切な一次抗体を有する摂氏4度で一晩標識する。翌日、PBSとTweenで3 10分の洗浄でセクションを洗浄し、最後の洗浄後1時間室温で適切な対応するビオチン化二次抗体でスライドをインキュベートします。インキュベーションの終わりに、ちょうど実証したように新鮮なPBSTで3回セクションを洗浄し、40分間インフィニティビオチンペルオキシダーゼ複合体でサンプルをインキュベートし、適切な発色剤で染色します。ラベル付き切片をガラス顕微鏡スライドに取り付け、取り付けられた切片が完全に乾燥したら、スライドを無水エタノールに5分間浸します。次に、スライドをキシレンに10分間浸し、適切な取り付け媒体で密封します。その後、100、200、400倍の倍率で電荷結合装置を装備した軽い顕微鏡でスライドをイメージします。子宮頸部および腰椎脊髄組織切片のeGFP免疫染色は、弱点スコア0のマウスの腰椎脊髄への伝達をほとんどまたは全く明らかにし、弱点スコア1のマウスではわずかに増強された伝達、および弱点スコア4または5のマウスで強く広範な伝達を明らかにする。種々の一時的な肢の弱さを示すマウスからの脊髄組織切片のGFP染色強度の定量化は、ウイルス溶液注射後の弱点の重症度が脊髄伝達の程度と密接に相関することを示している。脳では、嗅球、側側前頭前野、デンテート回、海馬、小脳皮質、脳幹の限界領域(顔面核、脈絡膜叢、および頭蓋上皮細胞を含む)のCA3ゾーンで、堅牢なeGFP信号が検出される。前角の運動ニューロンも脊髄の異なるレベルで強く伝達される。また、皮質では、ミクログリア、アストロサイト、オリゴデンドロサイトを含む様々なグリア細胞タイプと同様に、錐体細胞を含むGFP陽性ニューロンが検出される。この技術により、神経学分野の研究者は、中枢神経系疾患に対する小さな覚醒動物の直接眼内送達の治療効果を探究することができる。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

ここでは、視覚野の神経細胞とグリア細胞の蛍光標識用AAVベクターの頭蓋内注射を提示する。...

アデノ随伴ウイルスベクターの頭蓋内注射

出典: Li, D., et al.成体マウスにおける組換アデノ随伴ウイルスの直接髄腔内注射J. Vis. 経験。 (2019年)このビデオは、覚醒マウスの脳脊髄液(CSF)にアデノ随伴ウイルス(AAV)を髄腔内注射する手順を示し、注射器の準備、脊椎のアライメント、および正確な針の挿入をカバーしています。この方法は標的遺伝子送達を検証し、CNS...

中枢神経系疾患を治療するためのマウスモデルにおけるウイルスのくも膜下腔内送達

出典:Pourshafie, N., et al.げっ歯類の神経筋疾患を治療するための組換えアデノ随伴ウイルス血清型9を用いたマイクロRNAの全身送達J. Vis. Exp.

脊髄および眼球筋萎縮症マウスモデルにおける組換えアデノ随伴ベクターの注入

出典: Grames, MS, et al.ラットへのアデノ随伴ウイルスの静脈内投与の方法とヒントと中枢神経系形質導入の評価J. Vis.

ラットモデルにおける組換えアデノ随伴ウイルスベクターの静脈内投与

ここでは、新生児マウスの脳へのアデノ随伴ウイルスの脳室内注射による広範なニューロン伝達の技術を示しています。...

永続かつ広範な神経伝達のための新生児マウス脳の脳室内ウイルス注射

本研究の目的は、成体マウスにおける新規な遺伝子サブ送達技術を用いて、脊髄アデノ随伴ウイルス9（AAV9）媒介遺伝子送達の効力および安全性を開発および検証することであった。...

成体マウスにおける子宮頸部アデノ随伴ウイルス9（AAV9）ベクター送達

本プロトコルは、遺伝子編集および薬物送達のために新生児マウスで髄腔内注射を行うためのステップバイステップの指示を概説する。...

ゲノム編集とドラッグデリバリーのための新生児マウスの髄腔内注射

幼若ラットの腰椎槽に注射を行うための外科的処置が記載されている。このアプローチは、遺伝子治療ベクターの髄腔内送達に使用されてきましたが、このアプローチは、細胞や薬物を含むさまざまな治療に使用できることが期待されています。...

腰椎貯水槽注射による幼若ラットの髄腔内ベクター送達

ここでは、成体マウスにアデノ随伴ウイルス(AAV)を全身投与するためのマウス側尾静脈注射の最適化されたプロトコルについて詳しく説明します。さらに、AAV形質導入を評価するために一般的に使用されるアッセイのプロトコルについても説明します。...

成体マウスにおける側方尾静脈注射によるアデノ随伴ウイルスの一貫した送達

腰椎髄腔内注射は、中枢神経系に遺伝子治療を実施するための翻訳的に関連する投与経路を表しています。新生児、若年、成体のマウスおよびラットにおける腰椎髄腔内注射のためのこの包括的な標準化されたプロトコルは、研究者がこの技術を前臨床遺伝子治療研究に採用する際の指針となることを目的としています。...

マウスおよびラットにおける中枢神経系を標的とした遺伝子治療ベクターの腰椎髄腔内注射

くも膜下ウイルスの注入を使用するアデノ随伴ウイルスの広範な送達のための新しい技術が記載されています。この方法は、マウス新皮質ニューロンの表層への広範な形質導入を保証するだけでなく、非選択的プロモーターを使用した場合でも、第5層錐体ニューロンにおける導入遺伝子の選択的発現をもたらします。...

AAV2のくも膜下注射によるマウス新皮質ニューロンの広範な形質導入

学ぶ成体マウスにおける遺伝子組換えアデノ随伴ウイルスの直接髄腔内注入法。リドカインを用いた一過性麻痺スコアリングにより、中枢神経系への導入効率を評価し、ALSなどの神経疾患治療研究に応用する。

成体マウスの遺伝子組換えアデノ随伴ウイルスの直接髄腔内注入

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