マウスおよびラットの視覚系の構造と機能読み出しとして光干渉断層計と動視反応を使用してください。
January 10th, 2019
光コヒーレンス断層撮影と視運動性応答によって齧歯動物の構造と視覚の読み出しの評価のための詳しいプロトコルが表示されます。結果は、眼科と神経学的研究の貴重な洞察力を提供します。
これらの方法は、神経学および眼科の分野における主要な質問に答え、様々なげっ歯類モデルにおける多種多様な網膜症および網膜症状を評価するのに役立ちます。これらの技術の主な利点は、非侵襲的な縦方向の調査を行い、変動性を減らし、実験に必要な動物の数を減らすことです。これらの方法は、病理学的状態を調査するために使用することができる構造および機能の定量的なインビボ調査を可能にする、または新しい治療の潜在的な有用性を評価する。
しかし、特にげっ歯類モデルにおける光コヘレンス断層撮影技術の応用は、主に目の大きさが小さいため、依然として困難です。手順をデモンストレーションするマイケル・ディートリッヒ、私たちの研究室の博士課程の学生です。げっ歯類を麻酔した後、瞳孔拡張のために各目にフェニレフリントロピックアミドを1滴塗布する。
1分後に余分な眼液滴を拭き取ります。目を潤滑して、目を乾燥させ、濁った角膜を作り出さないように、メチルセルロースをベースにした眼球ゲルを潤滑します。次に、鉗子を使用して、カスタムコンタクトレンズを目に置きます。
コントロールパネル画面の右隅にある[スタート]ボタンを押して、取得モードを開始します。次に、左目を画像化し、ホルダーを配置して、げっ歯類の左眼球がカメラに向かっていることを確認します。フィルタレベルをRに設定し、ソフトウェアでブルー反射眼量イメージングおよびB-スキャン集録のBRとOCTを選択します。
次に、カメラ背面のフォーカスノブを使用して、約38のディオプターにフォーカス距離を設定します。そして、OCTスキャンが画面上に表示されるまで、retinaを拡大します。次に、すべての平面の網膜の直交角を持つ瞳孔の真ん中を通るビームパスを確保するために、光ディスクを照らされたフィールドの真ん中に配置する。
そして、ホルダーを回転させることによって水平および垂直の線B-スキャンを水平レベルに調整します。ソフトウェア画面でボリュームスキャンモードを選択し、50の自動リアルタイムトラッキングで高解像度モードで25 Bスキャンに設定します。ボリュームスキャングリッドの中央を光学ディスクの中央に配置し、黒い感度ノブを押して取得を開始し、コントロールパネルで取得します。
取得が完了したら、フィルタレベルをコントロールパネルの[青い蛍光を選択]に設定します。感度ノブで画像の明るさを調整します。感度ノブを押し、蛍光細胞または自己蛍光性の堆積物を画像に取得します。
ボリュームスキャンの分析には、スキャンを右クリックしてOCTデバイスのソフトウェアの自動セグメンテーションを使用します。[セグメンテーション]、[すべてのレイヤ] の順に選択します。目的のスキャンをダブルクリックして、レイヤーの手動補正を実行します。
厚さプロファイルを選択します。[レイヤーセグメンテーションの編集] をクリックします。一度に 1 つのレイヤーを選択します。
そして、必要に応じて、正しい位置にドラッグアンドドロップして赤い点を移動することにより、緑の線を修正します。次に、タブの厚みマップを選択します。1、2、3ミリメートルのETDRSグリッドを選択します。
内部円を光学ディスクの中央に配置します。最後に、対象となる異なるレティナルセクタに対してソフトウェアが提供する厚さ値から、レティナル層の厚さを計算します。ボリューム スキャンから主な厚さの値を計算するには、光ディスクを含む内側の 1 ミリメートル円を除いて、約 25 度の角度をカバーする全体の 1,2,3 ミリメートルの ETDRS グリッドを使用します。
まず、げっ歯類を測定するプラットフォームを選択します。ソフトウェアをダブルクリックして、[事前設定]ウィンドウを開きます。[新しいグループ]を選択し、グループ名、被験者数、種、および株を選択します。
ドロップダウンメニューで可変刺激、周波数、コントラスト感度、速度または向きを選択し、[新しいグループを作成]を押します。チャンバーの上にカメラのフォーカスリングを操作することにより、プラットフォームに焦点を当てます。そして、プラットフォーム上の黒い円の周りに赤い円を揃えてシステムをキャリブレーションします。
次に、げっ歯類をプラットフォーム上に置き、約5分間環境に適応させます。次に、動物が追跡または追跡しない場合は、左矢印をyesまたはnoの四角を選択して測定を開始します。変数刺激の横にある上下矢印をクリックして、刺激のステップサイズを手動で選択します。
最後に、[概要]タブを選択し、[ファイル]、[エクスポート テーブル]、または[グラフ]をクリックして、目的のデータセットをエクスポートします。結果は、内のレチナル層の変性が減少していることを示す。そして、物質1が投与されたとき、臨床EAEスコアはEAEコース中に減衰されます。
さらに、OKRは、120日間の期間にわたって空間周波数閾値試験によって測定された未処理のMOG EAEマウスと比較して、物質1で処理された動物の視力の改善を明らかにする。OCT 測定を行う場合、重要なステップは、厚さの値の品質と再現性を確保するために、すべての面でのレーザー光の直交方向です。OKR技術では、動物の追跡と正常な行動の動きを区別するには、研究者の訓練が必要です。
実験群に対して失明することが重要である。実験的自己免疫性脳脊髄炎の文脈で起こる構造的および機能的損傷のこれらの調査の後、この手順はまた、網膜症、または視神経損傷のモデルを含むがこれらに限定されない視覚系を含む他のモデルにおいて有用であり得る。これらの技術は、神経学および眼科の分野でのインビボ研究への道を開き、臨床試験に容易に移すことができる。
概要
この記事では、光干渉断層撮影（OCT）と視覚運動反応（OKR）を使用して、げじげじモデルの構造的および視覚的読み取りを評価するための包括的なプロトコルを提示します。これらの非侵襲的な技術は、眼科および神経学の研究に適用可能な洞察を提供し、変動性を減少させ、動物実験の数を減らして縦断的研究を可能にします。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 眼科学
- げじげじモデル
背景
- この研究はげじげじの網膜病変と網膜症状の評価に焦点を当てています。
- げじげじの目の小さなサイズによりOCTの適用に関連する課題を強調しています。
- OCTとOKRは網膜構造と機能の定量的in vivo調査を促進します。
- これらの方法は、潜在的な治療薬の評価と病理学的状態の理解に貴重なデータを提供します。
研究目的
- げじげじ研究にOCTとOKRを使用するためのプロトコルを開発し、実証すること。
- 実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）の文脈における構造的および機能的損傷を調査すること。
- 前臨床モデルにおける新しい治療薬の効果を評価すること。
使用された方法
- OCTとOKRの処置中、げじげじを快適にするために麻酔しました。
- OCTイメージングは、高解像度スキャン用のカスタムコンタクトレンズと特定のソフトウェア設定を使用して行われました。
- OKRプラットフォームでは、視覚追跡能力を評価するために様々な刺激を提示しました。
- 主要なステップには、信頼性の高いイメージングおよび追跡結果を確保するための慎重なキャリブレーションと取得手順が含まれていました。
主要な結果
- 結果は、処置されたげじげじの内側網膜層の変性減少を示しました。
- 処置された動物群では、処置されていない対照群と比較して視覚鋭さが向上しました。
- データは、これらの技術が時間の経過とともに網膜の変化と視覚機能を信頼性高く測定できることを示唆しています。
結論
- この研究は、神経学および眼科学のin vivo研究のための強力なツールとしてのOCTとOKRの実現可能性を示しています。
- 結果は網膜病理学のさらなる探索と新しい治療介入の評価を可能にします。
- 提示された方法論は、臨床試験設計と視覚系障害の理解に大きく貢献する可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Combining structural and functional visual system readouts enables longitudinal, quantitative assessment of retinal integrity and visual function in rodent models, supporting mechanistic de-risking in preclinical neurology and ophthalmology programs. This dual-modality approach reduces experimental variability and animal use while providing translatable endpoints for evaluating neuroprotective or disease-modifying therapeutics. The methodology enhances predictive confidence in target validation by correlating retinal structural changes with functional visual outcomes across disease models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying retinal layer thickness as a structural biomarker of neurodegeneration or neuroprotection.
- Operational Value: Provides reproducible, noninvasive structural readouts that support functional target validation in visual pathway modulation.
- Predictive Value: Correlates OCT-derived retinal structural changes with OKR-measured visual acuity to strengthen target engagement and pathway modulation confidence.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Establishes standardized OCT and OKR procedures for quantitative in vivo imaging and behavioral tracking, enabling reliable compound screening.
- Reproducibility: Facilitates longitudinal tracking of retinal structure and function, reducing inter-animal variability and improving assay precision.
- Scalability: Supports high-throughput adaptation through customizable stimulus parameters and automated segmentation for consistent data output across studies.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Demonstrates applicability in autoimmune encephalomyelitis (EAE) models, linking retinal structural preservation to functional visual improvement and clinical symptom attenuation.
- Translational Continuity: Provides a bridge from discovery to preclinical validation by measuring both retinal neurodegeneration and visual function recovery over extended periods.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by demonstrating substance-induced reduction in inner retinal layer degeneration and improved spatial frequency thresholds over 120 days.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, offering structural and functional endpoints that inform biological activity and therapeutic potential.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling quantitative in vivo investigation of retinal structure and function in neurodegeneration and neuroprotection models.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible structural thickness maps and functional tracking metrics for reliable compound evaluation in visual system assays.
- Analytics: Generates layer-specific thickness profiles and spatial frequency thresholds that enable cross-condition comparison and dose-response analysis.
- Translational Research: Connects structural retinal preservation with functional visual acuity recovery, supporting biomarker alignment and preclinical continuity in neurologic disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for longitudinal visual system assessment across multiple disease indications and therapeutic modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity through correlated structural and functional visual system readouts.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility via calibrated imaging protocols and blinded behavioral tracking procedures.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by providing early, translatable biomarkers of retinal and visual function change, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates demonstrating both retinal structural preservation and visual functional improvement in preclinical models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in rodent handling, ophthalmic preparation, and OCT/OKR system operation for reliable data acquisition.
- Depends on customized holders, contact lenses, and calibrated imaging systems to accommodate small rodent eye size and ensure beam alignment.
- Necessitates cross-team standardization of anesthesia, dilation, lubrication, and imaging protocols to maintain consistency across sites or studies.
- Involves adaptation considerations for varying stimulus parameters (spatiotemporal frequency, contrast, speed) in OKR assays across species and strain models.
- Includes practical limitations such as the need for investigator training to distinguish true optokinetic tracking from normal behavioral movements and ensure blinding during assessment.
