Name: マウスおよびラットの視覚系の構造と機能読み出しとして光干渉断層計と動視反応を使用してください。 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-10T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: 学ぶ光干渉断層計と動視反応を用いたマウスおよびラットの視覚系構造と機能評価法。侵襲性のない長期的観察により、網膜層の変化と視機能を定量的に測定し、神経眼科疾患の病態理解と新規治療薬の評価に貢献します。

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この作品は、博士ロバートの Pfleger 財団と Ilselore Luckow 財団と同様、バイオジェンと PA にノバルティスの補助金によって支えられました。図 1 b から再現した「全身麻酔のマウスおよびラットの眼球画像処理の位置マニピュレーター: ドゥーイットユアセルフ ガイド。ディートリッヒ ・ クルス-エランス ・、A.、耀輝, H. Aktas 修、ブラント、a. u.、Hartung、hp、緑、A.、アルブレヒト、P. BMJ 開いた眼科。1 (1) e000008、2017「BMJ の出版のグループ株式会社の許可を得て

動物のすべてのプロシージャ (性質、環境および消費者保護庁; 参照番号 84-02.04.2014.A059) 地方当局によって承認された実験的ガイドラインに準拠して行われた、協会に準拠視覚・眼科とビジョンの研究やヨーロッパ ディレクティブ 2010/63/EU の科学的な目的に使用される動物の保護に関する動物の使用は、眼科会議 (ARVO) 文研究。
1. 共焦点走査レーザー眼底光干渉断層計
注:CSLO 10 月測定のためのプロトコルは、実験用マウスおよびラットのすべての種の適応されます。
<ol><li>セットアップおよび事前イメージング製剤 注:このプロトコルで使用される 10 月装置のシステム構成はすでに31は別記します。</li>
	<li>
吸入麻酔のための齧歯動物の準備
	<ol>
<li>誘導室齧歯類を配置し、気化器を 2 L/min O2で 2% のイソフルラン麻酔濃度に設定します。</li>
		<li>場合は、齧歯動物は尻尾をつまんで麻酔、商工会議所から削除を確認し、それを暖かく保つためにペーパー タオルに包んでください。</li>
		<li>カスタム ホルダー33齧歯類を置き、気化器 (2 L/min O2で 2.5% イソフルラン) に接続口部分の統合かまバーに上顎前歯をフックします。</li>
		<li>瞳孔の拡張のそれぞれの目に 0.5% フェニレフリン 2.5%-Tropicamide の一滴を適用します。</li>
		<li>1 分後に点眼薬の余分な液体を拭き取るし、メチル セルロース ベース ゲル状目薬で目を注油 (例えば、ヒプロメル 0.3% 点眼薬) 乾燥を避けるためにアウトと角膜の濁り。</li>
		<li>手や鉗子を使用してマウスの目にカスタム コンタクト レンズ (+4 ジオプター) を配置します。(例えば、ラウンド 12 mm 径のガラス基板) 平面を確保するために光学特性なしのガラス板とラットの目をカバーします。 注:麻酔中に呼吸数をモニター。増加または必要な場合イソフルラン麻酔濃度を減少します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
測定と分析 注:実行と APOSTEL の推奨事項34に沿って 10 月測定を報告し、オスカー IB 合意基準35によると品質管理を行うことを確認します。これらの推奨事項は、人間の OCT 画像の開発されているといくつかの条件かのみ部分的に該当します。<ol>
<li>左の目のイメージは、カメラ齧歯動物の顔の左目電球ように図 1 aに示されるようにホルダーを移動します。</li>
		<li>アクイジション ・ モードを開始するコントロール パネルのディスプレイの右上隅の [スタート] ボタンを押します。</li>
		<li>フィルター レバーをRに設定し、青い反射眼底イメージング ・ コントロール パネルによる B-スキャンBR + 10 月を選択します。</li>
		<li>フォーカスつまみを使用して、カメラの背面に約 38 ジオプトリーに焦点距離を設定し、OCT スキャンが画面に表示されるまで網膜にズームインします。 注:最初の測定で参照アームは齧歯動物測定の適応しています。Ctrl + Alt + Shift + O を押して、OCT スキャンは画面に表示されるまで開いているウィンドウに参照アームの値を調整します。</li>
		<li>すべての面で網膜に直交角と瞳孔の中心のビーム経路を確保するため、照明のフィールド (BR) の真ん中に視神経乳頭の位置し、回転/回転によって水平レベルに水平および垂直線 B-スキャンを調整ホルダー (図 1 b) またはカメラを移動します。</li>
		<li>ボリューム スキャン モードを選択し、ソフトウェア画面上 50 自動リアルタイム追跡 (芸術、50 の平均、スキャンからラスタライズ) の高解像度モードで 25 B-スキャンに設定します。</li>
		<li>視神経乳頭上ボリューム スキャン グリッドの中央をセンター コントロール パネルの黒ツマミし取得を押すと集録を開始して下さい。</li>
		<li>Aにフィルター レバーを設定、コントロール パネルの青い自動蛍光(BAF) を選択し、感度ノブでイメージの明るさを調整します。画像蛍光セル (例えば、EGFP) または自動蛍光預金ツマミし取得を押します。</li>
		<li>脱水症状を防ぐし、熱源を別のケージに動物を入れて齧歯動物の眼の眼ゲルを適用します。</li>
		<li>完全に別ケージでの麻酔から回復され、それぞれ収容までの齧歯類を監督します。動物の場合は外来、ホームのケージに戻る。</li>
		<li>、ボリューム スキャンの分析 10 月デバイスのソフトウェアの自動セグメンテーションを使用して、スキャンを右クリックし、分割し、すべてのレイヤーを選択します。OCT 画像の品質が十分であることを確認し、実験、例えばの各セットの品質ヒューズを定義 > 20 デシベル。</li>
		<li>二重目的のスキャンをクリックしてレイヤーの手動補正を実行、厚さプロファイルを選択し、レイヤーの区切りを編集をクリックします。1 つのレイヤーを選択など ILM内膜を制限するを押し、必要に応じて、赤いドットをドラッグ アンド ドロップの正しい位置に移動することによって緑の線を修正します。 注:実験グループの手動補正を実行する治験責任医師が盲目になったことを確認します。</li>
		<li>厚みマップ] タブを選択し、糖尿病網膜症研究 (ETDRS) グリッドの1, 2, 3 mmの早期治療を選択します。(図 2左) 視神経乳頭の内側の円を中心します。</li>
		<li>興味の様々 な網膜分野のソフトウェアによって提供される厚さ値から網膜の層の厚さを計算します。ボリューム スキャンから厚さの平均値を計算する全体の 1 を使用して、2、3 mm ETDRS グリッドで、視神経 (図 2右) が含まれています内側 1 mm の円を除く約 25 ° の角度をカバーします。</li>
		<li>適切なソフトウェアを使用して統計分析を実行します。動物の両方の目が含まれている場合を考慮対象間目相関内の統計モデル会計 (例えば,一般化推定方程式または混合線形モデル) 1 つのサブジェクトの目は統計的に依存しているように、36.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 動視反応
注:以下では、マウスおよびラットの平均的測定のための詳細なマニュアルが提供される個々 の特定のニーズに対応できます。
<ol><li>
セットアップと測定前の準備
	<ol>
<li>コンピューターの電源を。システムの起動後は、37詳細を他の場所に記載されている試験器の画面をオンに。</li>
		<li>マウスやラットの測定のための適切なプラットフォームを選択します。 注:プラットフォームのサイズは、齧歯動物の体サイズに基づいて選択されます。動物は、正しく歩くことができなければプラットフォームの上に座ることができるはず。</li>
		<li>ソフトウェアをダブルクリックして事前設定ウィンドウを開き、新しいグループを選択、グループ名、科目の数、種の系統を選択します。変数の刺激を選択:新しいグループの作成を押します空間/時間周波数、コントラスト感度、速度またはドロップ ダウン メニューの向き。</li>
		<li>商工会議所の上にカメラのフォーカス リングを操作することによって、プラットフォームに焦点を当てるし、(ドラッグ アンド ドロップ) を合わせ、システムのキャリブレーション プラットフォームの黒い円の周りに赤い円。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
測定と分析
	<ol>
<li>プラットフォームに動物を配置、~ 5 分リフト (図 3 a) が値下がりした場合プラットフォーム上動物のバックアップ環境に適応。</li>
		<li>ソフトウェアの画面 (図 3 b) の右上隅に被験者識別番号と状態を選択します。1 つの刺激は変数、その他の刺激が一定に保たれます。刺激の横に開いたロックや施錠の記号により確認しています。</li>
		<li>動物の追跡またはない、それぞれ追跡しない場合は、いいえ、はいまたは ○ ◄ を選択して測定を開始します。 注:時計回りに追跡は、右目に左と反時計回りの追跡に対応します。ソフトウェアは、ランダムに移動グリッドの方向を変更します。</li>
		<li>変数の刺激の横にある上下の矢印をクリックして手動で刺激のステップ サイズを選択させたり刺激閾値が収束する場合、ソフトウェアによって自動的に適応します。</li>
		<li>最適な結果を得るには、高音を口笛とソフトウェア画面に黒または白のボックスの記号をクリックして、ブランキングなど動物,をアニメートします。長期にわたる測定場合は繰り返しこれらのアクションを実行します。</li>
		<li>データ分析の概要タブを選択し、ファイルをクリックして |目的のデータ セットをエクスポートするエクスポート テーブル/グラフ。</li>
		<li>目的のソフトウェアを使用して統計分析を実行 (1.3.15 の手順を参照してください)。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

著者宣言次の財務情報開示の作品発表に関係のないです。
マイケル ・ ディートリッヒは、ノバルティスからスピーカーの謝礼金を受け取った。アンドレス ・ サンタクルス エランス ・は、多発性硬化症協会の研究員です。アリ ・ グリーン MedImmune、ノバルティス、OCTIMS、当初 5 生物、Bionure; の科学的な諮問委員会に提供しています自工み会神経; のエディターを関連付けるには神経; の編集委員だった検査分子及び経路; の特許を保持しています。創業 5 科学の相談ノバルティス ファーマ OCTIMs、創業科学 SRA、NINDS、ニア、MS 協会、Sherak 財団、ヒルトン財団から受信した研究支援創業 5 に株式やストック ・ オプションを保持しています。マイラン v テバ製薬で専門家証人として役立った。ビオゲン Idec、GeNeuro、サノフィ ジェンザイム、メルク、ノバルティス ・ ファーマ、Octapharma、Opexa 治療、テバ製薬、MedImmune、バイエル ヘルスケア社、今後製薬会社から運営委員会に提供するための手数料を受けたハンス ・ ピーター ・ Hartung とロシュ、ビオゲン Idec、サノフィ ジェンザイム、メルク、ノバルティス ・ ファーマ、Octapharma、Opexa 治療、テバ製薬、ロシュから諮問委員会に提供するための手数料、ビオゲン Idec、サノフィ ジェンザイム、メルク、ノバルティス ・ ファーマから受講料、Octapharma、Opexa 治療、テバ製薬、MedImmune、ロシュ。フィリップ ・ アルブレヒトは、イプセン、ノバルティス、バイオジェン; の科学的な諮問委員会に提供に関して報酬を受け取った彼はスピーカーの謝礼金を受け取った、ノバルティス、テバ、バイオジェン、メルツ医薬品、イプセン、アラガン、バイエル ヘルスケア社、Esai、UCB、グラクソ ・ スミス ・ クライン; から旅行のサポートノバルティス、バイオジェン、テバ、メルツ医薬品、イプセン、ロシュから研究支援を受けた。他の作家には開示を報告なし。

このプロトコルは、厚さ測定および齧歯動物の視覚機能の検査のための指示を提供します。Visual 読み出しトランスレーショナルリサーチ18,26,38,,3940でますます使用されて、簡単に臨床試験に譲渡すること。動物実験で組織学的調査と比較して 10 月の重要な利点は、縦断的分析が可能主ばらつきとの数を削減し、動的の病理学的プロセスの調査を許可します。動物研究ごとに必要です。さらに、10 月の in vivo イメージングは固定、切断または染色の成果物は、組織学的調査における層厚に影響を与える可能性があります対象となります。
しかし、網膜に関連してすべての平面のレーザー光線の直交方向は品質や厚み値の再現性を確保するための重要なステップです。それは、捜査官のいくつかのトレーニングが必要です、OCT スキャンの買収前に必須です。また、商業上のデバイスは、人間のアプリケーションの構築されている齧歯動物の OCT 画像の品質は人間の患者の B-スキャンと比較しているまだ劣っています。筆者の経験では異なる内側の網膜を区別することは困難かもしれない手動補正中にレイヤー (網膜神経線維層、神経節細胞層、内網状層)。したがって、複合読み出し (IRL) としてこれらの層の分析をお勧めします。
実験のセットアップには、揮発性麻酔、吸入イソフルランと我々 の経験、安全とケタミン ・ キシラジン41,42注射麻酔科などよりも制御が容易で、リスクを軽減するなどのオプションが用意されています長時間の集録の場合齧歯動物の早期覚醒の時間 (例えば、蛍光標識細胞のイメージングを実行する) 場合。予備的な研究では、ボリューム スキャンされた最高の妥当性と信頼性をプロトコルとして識別されます。ICC (内クラス相関係数) 値すべての評価の 0.85 を超える視神経乳頭を含む中央部を除くボリューム スキャンを行った場合、評価者間およびテストの再テスト信頼性は優秀だった。
動視反応の測定は、連続的に移動フィールドへの応答で発生する不随意視運動性反射に基づいています。齧歯動物、他の種とは対照的に、目だけでなく、カメラを使用して容易に検出することができます全体の頭の動きが含まれます。
「追跡」と区別するためまたは通常の動物の行動の動きは調査官の訓練を必要とし、実験群に目がくらむことが重要です。さらに、動物実験の設定し、長年の測定プロトコルの間に合わせて適応位相を必要があります、動物が「追跡」がし終わったらしきい値に達したため、減少していないことを保証する何度もアニメーション化するには注意。実験室マウスおよびラットの43,のための44の視機能に関する重要なひずみ変動もあります。前に、テストであり、SJL マウスなどのいくつかの系統も平均的測定に適して彼らは Pde6brd1 の対立遺伝子のホモ接合体、したがって、齧歯動物の視力が評価されるべき (網膜変性症 1)。
要約すると、動物モデルにおける網膜の形態と視機能の検討 EAE のコンテキストで発生する損害を構造と機能の非侵襲的, 縦断的調査をできるようにして、ビジュアルを含む他のモデルで役に立つかもしれませんretinopathies や視神経損傷のモデルに限定されないを含むシステム。

中枢神経系の一部として視覚経路の検討だけでなく眼科1,2,3,45,をアドレス指定の有効な開始点に証明されています。、また神経6,7,8,9,10、11,12,13,14 が ,,1516質問。近年、10 月などは、様々 な retinopathies や様々 な齧歯動物モデル17,18,19で網膜の症状を評価するための有用な分析、非侵襲的ツールとして識別されていると,20,21,22,23,24,25します。 OCT は、網膜の形態とマウスおよびラットの動物網膜26の結果, 組織学的セクションと一致の構造の可視化生体内で高速かつ高解像度。などは、視覚機能を定量的に評価する高速かつ堅牢な方法を構成します。
10 月の多くのデバイスは、同時共焦点走査レーザー眼底検査 (cSLO) イメージング波長の異なる、すなわち網膜の疾患についての診断情報を提供する、リポフスチン堆積物の可視化や、網膜の変化を許可します。顔料の上皮27。さらに、トランスジェニック動物の細胞を標識する蛍光の生体内イメージングは可能な28,29,30,31,32です。ただし、小さい目サイズのために主に、齧歯動物モデルにおける OCT 技術の応用はまだ難しい。いくつかの商業的に使用可能なデバイスの適応を必要とし、異なる種の動物のイメージをホルダーのサイズが異なるが多くの場合必要です。さらに、動物は、測定用の麻酔を必要とします。
終わったらデバイスは、齧歯動物の視覚機能を評価するために使用できます。動物配置されます移動表示する実際または仮想円柱の中心のプラットホームの格子、再帰の頭と首の動きを持つ動物を追跡します。この動視反応を軽減または排除低減又は視機能の損失。
このプロトコルの目的は、吸入麻酔を提供するカスタム ホルダー市販 10 月デバイスを用いて網膜の厚さ測定のためのマニュアルを提示することです。プロトコルは、製造元によって提供されるソフトウェアを使用してボリューム スキャンを分析する方法を示しています。視覚テスト、目的平均的を評価するために商業的に利用可能なシステムを使用する方法について説明することです。

<table><tbody><tr><td>ハイデルベルク・スペクトラリスHRA+OCTシステム&nbsp;</td><td>ハイデルベルクエンジニアリング、ドイツ</td><td>N/A</td><td>眼科イメージングプラットフォームシステム</td></tr><tr><td>ハイデルベルクアイエクスプローラー</td><td>ハイデルベルクエンジニアリング、ドイツ</td><td>N/A</td><td>バージョン 1.9.10.0</td></tr><tr><td>青色 25D 非接触&nbsp; レンズ</td><td>ハイデルベルクエンジニアリング、ドイツ</td><td>N/A</td><td>げっ歯類測定用レンズ</td></tr><tr><td>OptoMotry</td><td>CerebralMechanics Inc., カナダ</td><td>視覚</td><td>機能分析用システム</td></tr><tr><td>OptoMorty HDソフトウェア</td><td>CerebralMechanics Inc.、カナダ</td><td>N / A</td><td>バージョン2.1.0</td></tr>吸入<tr><td>麻酔イソフルラン</td><td>Piramalクリティカルケア、ベツレヘム、ペンシルベニア州、米国&nbsp;</td><td>803250</td><td>吸入麻酔薬</td></tr><tr><td>フェニレフリン2.5%-トロピカミド0.5%&nbsp;</td><td>大学病院D&uuml;ドイツ、セルドルフ</td><td>N/A</td><td>瞳孔拡張&nbsp;</td></tr><tr><td>Visc-Ophtal</td><td>Dr. Robert Winzer Pharma GmbH, Berlin, Germany</td><td>58407</td><td>眼科用眼科用アイジェル</td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>GraphPad Software Inc, San Diego, CA, USA</td><td>N/A</td><td>統計分析ソフトウェア, バージョン 5.00</td></tr><tr><td>IBM SPSS Statistics</td><td>IBM Corporation, Armonk, New York, USA</td><td>N/A</td><td>統計分析ソフトウェア, バージョン 20</td></tr></tbody></table>

マウスおよびラットの視覚系の構造と機能読み出しとして光干渉断層計と動視反応を使用してください。

Using Optical Coherence Tomography and Optokinetic Response As Structural and Functional Visual System Readouts in Mice and Rats

光干渉断層計 (OCT) は、高解像度の眼底イメージングを可能にする高速、非侵襲的、干渉技法です。神経変性疾患、神経保護、これら頻繁眼底所見とよく相関としてのビジュアル系を含む神経修復のプロセスの調査のための理想的なツールです。機能読み出し、視覚誘発の代償的な目と頭の動きは、視覚機能を含む実験モデルで一般的使用されます。両方の技法を組み合わせることにより、定量的な体内調査構造および機能、病理学の条件を調査するため、または治療の可能性を評価するために使用できます。本技術の大きな利点は、可変性を減らす、動的プロセスの調査を許可する縦断的分析を実行する可能性があるし、実験に必要な動物の数を削減します。プロトコルはマウスおよびラットの吸入麻酔を提供するオプションで低コストのカスタマイズ ホルダーを使用しての高品質網膜スキャンの取得と解析のためのマニュアルを提供することを目的を説明します。また、本ガイドは、齧歯動物は、彼らの特定のニーズや興味に対応することができますで視運動性解析 (など) を使用して研究者の教育マニュアルとしてものです。

ミエリン オリゴデンドロ サイト (モグ) 糖ペプチドの 3rd世代 OCT イメージングを用いた投与実験的自己免疫性脳脊髄炎 (EAE) マウス モデル、マウス網膜の形態学的セクションの高解像度が得られました。この技術を使用すると、さまざまな物質の保護能力が実証17だった。得られた網膜内層 (IRL) の厚さ値は、網膜 wholemounts (図 4) の組織染色によって得られる網膜神経節細胞 (RGC) の番号と一致です。
終わったら監視 10 月まで見られる神経変性の機能読み出しを提供します。これらの実験で空間周波数として評価し終わったら、視覚機能とパピオン損傷 IRL は、OCT による間伐として評価は密接な相関関係17であった。空間的または時間的な周波数、コントラスト感度、方向または移動格子の速度を変更することによって、視力を調べるさまざまなプロトコルを用いることができます。EAE モデルで未処理のモグ EAE マウス (図 5) と比較された物質 1 で扱われる動物の 0.05 サイクル/度 (c/d) の改良された空間周波数が検出されました。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58571/58571fig1.jpg"> 図 1: カスタム ホルダー 10 月測定。(A) 10 月カスタム ホルダー33および齧歯動物の眼の周り (B) 回転の軸を使用して c57bl/6 j マウスの画像。回転 (左) 横の平面、軸平面 (右) を示した。この図は、ディートリッヒ、m. から変更されているら33。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58571/58571fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58571/58571fig2.jpg"> 図 2: 10 月の記事集録解析します。「1、2、3 mm」ETDRS グリッド 25 B-スキャン ボリューム プロトコルを (左)。網膜の層の厚さは、様々 な網膜分野のソフトウェア (右) によって提供されます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58571/58571fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58571/58571fig3.jpg"> 図 3: マウスおよび刺激の平均的測定設定します。(A) 上部を商工会議所のプラットホームの c57bl/6 j マウスを分析カメラを通して表示します。(B) ユーザー インターフェイスおよび平均的ソフトウェアの設定。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58571/58571fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58571/58571fig4.jpg"> 図 4: モグ EAE と c57bl/6 j マウス表示物質未処理のコントロールと比較して 1 で処理する弱毒病コース。(A) 内部の網膜の層の変性は減少 (B) と臨床 1 の物質を投与した場合、EAE スコアは EAE コース中に減衰します。毎日、スコア化したマウスと、120 日間の期間にわたって毎月 10 月測定を行った。グラフは、平均とグループごとの少なくとも 10 の動物の標準誤差を表しています。(*p &lt; 0.05 * * *p &lt; 0.001、Dunnett の事後検定と分散分析により比較して曲線下面積)。(C) IRL の厚みの変更は、RGC の損失と一致 (* * *p &lt; 0.001、MOG 未処理マウスと比較された Dunnett の事後検定と分散分析による)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58571/58571fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58571/58571fig5.jpg"> 図 5: モグ EAE と c57bl/6 j マウスの平均的測定。(A) 平均的動物の改善視力治療物質空間周波数しきい値期間 120 日間のテストによって測定される未処理のモグ EAE マウスと比較された 1 を明らかにします。グラフを表す意味とグループごとの少なくとも六つの動物の標準誤差 (* *p &lt; 0.01 * * *p &lt; 0.001、Dunnett の事後検定と分散分析により比較して曲線下面積)。(B) 試験室の c57bl/6 j マウスのイメージです。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58571/58571fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

光コヒーレンス断層撮影と視運動性応答によって齧歯動物の構造と視覚の読み出しの評価のための詳しいプロトコルが表示されます。結果は、眼科と神経学的研究の貴重な洞察力を提供します。

Optical coherence tomography (OCT) is a fast, non-invasive, interferometric technique allowing high-resolution retinal imaging. It is an ideal tool for ...

これらの方法は、神経学および眼科の分野における主要な質問に答え、様々なげっ歯類モデルにおける多種多様な網膜症および網膜症状を評価するのに役立ちます。これらの技術の主な利点は、非侵襲的な縦方向の調査を行い、変動性を減らし、実験に必要な動物の数を減らすことです。これらの方法は、病理学的状態を調査するために使用することができる構造および機能の定量的なインビボ調査を可能にする、または新しい治療の潜在的な有用性を評価する。しかし、特にげっ歯類モデルにおける光コヘレンス断層撮影技術の応用は、主に目の大きさが小さいため、依然として困難です。手順をデモンストレーションするマイケル・ディートリッヒ、私たちの研究室の博士課程の学生です。げっ歯類を麻酔した後、瞳孔拡張のために各目にフェニレフリントロピックアミドを1滴塗布する。1分後に余分な眼液滴を拭き取ります。目を潤滑して、目を乾燥させ、濁った角膜を作り出さないように、メチルセルロースをベースにした眼球ゲルを潤滑します。次に、鉗子を使用して、カスタムコンタクトレンズを目に置きます。コントロールパネル画面の右隅にある[スタート]ボタンを押して、取得モードを開始します。次に、左目を画像化し、ホルダーを配置して、げっ歯類の左眼球がカメラに向かっていることを確認します。フィルタレベルをRに設定し、ソフトウェアでブルー反射眼量イメージングおよびB-スキャン集録のBRとOCTを選択します。次に、カメラ背面のフォーカスノブを使用して、約38のディオプターにフォーカス距離を設定します。そして、OCTスキャンが画面上に表示されるまで、retinaを拡大します。次に、すべての平面の網膜の直交角を持つ瞳孔の真ん中を通るビームパスを確保するために、光ディスクを照らされたフィールドの真ん中に配置する。そして、ホルダーを回転させることによって水平および垂直の線B-スキャンを水平レベルに調整します。ソフトウェア画面でボリュームスキャンモードを選択し、50の自動リアルタイムトラッキングで高解像度モードで25 Bスキャンに設定します。ボリュームスキャングリッドの中央を光学ディスクの中央に配置し、黒い感度ノブを押して取得を開始し、コントロールパネルで取得します。取得が完了したら、フィルタレベルをコントロールパネルの[青い蛍光を選択]に設定します。感度ノブで画像の明るさを調整します。感度ノブを押し、蛍光細胞または自己蛍光性の堆積物を画像に取得します。ボリュームスキャンの分析には、スキャンを右クリックしてOCTデバイスのソフトウェアの自動セグメンテーションを使用します。[セグメンテーション]、[すべてのレイヤ] の順に選択します。目的のスキャンをダブルクリックして、レイヤーの手動補正を実行します。厚さプロファイルを選択します。[レイヤーセグメンテーションの編集] をクリックします。一度に 1 つのレイヤーを選択します。そして、必要に応じて、正しい位置にドラッグアンドドロップして赤い点を移動することにより、緑の線を修正します。次に、タブの厚みマップを選択します。1、2、3ミリメートルのETDRSグリッドを選択します。内部円を光学ディスクの中央に配置します。最後に、対象となる異なるレティナルセクタに対してソフトウェアが提供する厚さ値から、レティナル層の厚さを計算します。ボリューム スキャンから主な厚さの値を計算するには、光ディスクを含む内側の 1 ミリメートル円を除いて、約 25 度の角度をカバーする全体の 1,2,3 ミリメートルの ETDRS グリッドを使用します。まず、げっ歯類を測定するプラットフォームを選択します。ソフトウェアをダブルクリックして、[事前設定]ウィンドウを開きます。[新しいグループ]を選択し、グループ名、被験者数、種、および株を選択します。ドロップダウンメニューで可変刺激、周波数、コントラスト感度、速度または向きを選択し、[新しいグループを作成]を押します。チャンバーの上にカメラのフォーカスリングを操作することにより、プラットフォームに焦点を当てます。そして、プラットフォーム上の黒い円の周りに赤い円を揃えてシステムをキャリブレーションします。次に、げっ歯類をプラットフォーム上に置き、約5分間環境に適応させます。次に、動物が追跡または追跡しない場合は、左矢印をyesまたはnoの四角を選択して測定を開始します。変数刺激の横にある上下矢印をクリックして、刺激のステップサイズを手動で選択します。最後に、[概要]タブを選択し、[ファイル]、[エクスポート テーブル]、または[グラフ]をクリックして、目的のデータセットをエクスポートします。結果は、内のレチナル層の変性が減少していることを示す。そして、物質1が投与されたとき、臨床EAEスコアはEAEコース中に減衰されます。さらに、OKRは、120日間の期間にわたって空間周波数閾値試験によって測定された未処理のMOG EAEマウスと比較して、物質1で処理された動物の視力の改善を明らかにする。OCT 測定を行う場合、重要なステップは、厚さの値の品質と再現性を確保するために、すべての面でのレーザー光の直交方向です。OKR技術では、動物の追跡と正常な行動の動きを区別するには、研究者の訓練が必要です。実験群に対して失明することが重要である。実験的自己免疫性脳脊髄炎の文脈で起こる構造的および機能的損傷のこれらの調査の後、この手順はまた、網膜症、または視神経損傷のモデルを含むがこれらに限定されない視覚系を含む他のモデルにおいて有用であり得る。これらの技術は、神経学および眼科の分野でのインビボ研究への道を開き、臨床試験に容易に移すことができる。

using-optical-coherence-tomography-optokinetic-response-as-structural

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

出典: Jagodzinska, J., et.al., 光コヒーレンストモグラフィー:マウス網膜神経節細胞のイメージング In Vivo. J. Vis. Exp. (2017)...

光干渉断層撮影法によるマウス網膜のin vivoイメージング

本稿では、高分解能のスペクトル領域光干渉断層法 (SD OCT) とマウス網膜の生体内イメージングのためのプロトコルについて説明します。それは網膜神経節細胞 (RGC)...

光干渉断層計: マウス網膜神経節細胞In Vivoイメージング

このプロトコルを記述する方法高解像度イメージング スペクトル領域光干渉断層法などと小さい齧歯動物, 眼科画像処理プラットフォーム...

生体内でスペクトル領域光干渉断層法と走査レーザー眼底Cx3cr1gfp/gfpレポーター マウスの画像

マウスの視界を調べるために、迫りくるテストを実施しました。マウスは、天井にモニターと大きな正方形のアリーナに配置されました。迫り来る視覚刺激は、マウスで一貫して凍結または飛行反応を誘発する。...

マウスの視覚を評価するために迫り来る視覚刺激の使用

ここでは、スペクトル領域光干渉断層撮影(SD-OCT)を用いて、網膜変性、緑内障、糖尿病性網膜症、近視のモデルにおいて、in...

光コヒーレンストモグラフィーを用いたげっ歯類モデルにおける眼疾患のin vivo構造評価

糖尿病の結果としての目と脳の両方の神経変性は、げっ歯類に対して行われる行動検査を通じて観察することができる。Y迷路、空間認知の尺度、および視機能の尺度である光運動応答は、両方とも潜在的な診断と治療に関する洞察を提供する。...

糖尿病ラットにおけるY-迷路を介した視運動応答と認知機能の行動評価

ここでは、ローズベンガルとレーザー誘導網膜イメージング顕微鏡システムを使用した網膜静脈閉塞のための最適化されたプロトコルと、遺伝子組み換え株での再現性を最大化するための推奨事項について説明します。...

変動性を制限するための網膜静脈閉塞マウスモデルの最適化

ここでは、マウス網膜症の診断と定量的測定を容易にするために、光干渉断層撮影法を用いた in vivo...

光干渉断層撮影法の網膜症モデルマウスへの応用

本プロトコルは、in vivo画像で観察された網膜神経節細胞軸索束形態を検証する目的で、同じマウス網膜のex vivo共焦点画像とin...

可視光光干渉断層撮影ファイバーグラムと同一マウス網膜の共焦点像のアライメント

ここでは、視運動性反射を定量化するための標準プロトコルについて説明します。仮想ドラム刺激とビデオ眼球撮影を組み合わせることで、行動の特徴選択性とその適応可塑性を正確に評価することができます。...

マウスにおける視運動性反射の視覚特徴選択性の定量化

学ぶ光干渉断層計と動視反応を用いたマウスおよびラットの視覚系構造と機能評価法。侵襲性のない長期的観察により、網膜層の変化と視機能を定量的に測定し、神経眼科疾患の病態理解と新規治療薬の評価に貢献します。

マウスおよびラットの視覚系の構造と機能読み出しとして光干渉断層計と動視反応を使用してください。

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