Name: 選択したプロウイルス統合サイトの HIV-1 感染の Jurkat レポーターのモデルを生成する CRISPR ベース Cas9 ゲノム工学 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-14T13:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 27 s
Description: 学ぶCRISPR-Cas9ゲノム工学によるHIV-1感染のin vitroモデル構築法。Jurkat細胞で特定のプロウイルス統合サイトを標的化し、レポーター遺伝子導入と単一細胞クローン選別の手法を解説。HIV生物学研究に有用。

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テクニカル サポート、ブリッタ Weseloh とベッティーナのアベルに感謝します。我々 もありがとうアルネ Düsedau、Jana Hennesen (流れ cytometry 技術プラットフォーム ハインリッヒ Pette Institut) テクニカル サポート。

1. ゲノム工学とベクトル (テレビ) の設計をターゲットに戦略をターゲット
注:ゲノム工学の最初のステップは、選択と CRISPR Cas9 媒介をターゲットに必要なツールの生成を含みます。ゲノム統合サイトの軌跡の選択は、ターゲットのセル型の選択と統合のため HIV 由来の記者の設計この手順を付けます。このプロトコルは、Jurkat 標的細胞への HIV LTR_tdTomato_BGH PA 最小限記者ターゲットについて説明します。CRISPR ベース Cas9 ターゲット、世代、スクリーニング、クローン系統の検証のワークフローのフローチャートは、図 1に描かれています。記載されているターゲット戦略s. 化膿Cas9 を使用して、選択した統合サイトで gRNA 監督 dsDNA 改を生成する (SpCas9)。相同組換えを介して選択された genomic 位置に記者が対象とし、いわゆる 5' と 3' の相同性 (HA) の腕11が並ぶ記者シーケンスを含む非線形ターゲット ベクトル (テレビ) を提供します。
<ol><li>
ターゲットの軌跡、gRNA、およびベクター デザインをターゲットの選択
	<ol>
<li>個々 の科学的な質問に基づいて対象とする thegenomic の軌跡を選択します。Hiv 感染の再発統合サイトの公開されたリストは、異なる患者で発見した使用研究2,3,4,5,6,7、8ガイドライン。インシリコ抽出対象 (完全な遺伝子のシーケンス) またはゲノムの少なくとも 5 kb 必要な genomic 位置のゲノム シーケンス UCSC のゲノムのブラウザー (http:// genome.edu.ucsc.edu) を使用しています。</li>
		<li>選択ガイド Rna (gRNAs) 20 E カリカリ webtool (http://www.e-crisp.org) を使用して選択された genomic 位置のターゲットのための nt。<ol>
<li>生物として「ホモ ・ サピエンス GRCh38」を選択します。1.1.1 手順で抽出した目的の genomic 位置をカバーするゲノム シーケンスの入力 2,000 bp。</li>
			<li>中規模アプリケーション設定 (任意の PAM、任意 5' 基本、ターゲットを容認のミスマッチ、イントロン/CPG の島が除外されます) を使用して gRNA の検索を開始します。可能な gRNA デザイン一覧は、高い特異性と効率のためのスコアを下げることからランキング表示されます。</li>
			<li>できれば特異性と効率性の高いスコアを示していますし、対象とする目的の genomic 位置にできるだけ近く、gRNA を選択します。 注:目的の genomic 位置への近さと具体的かつ効率的な gRNA の設計間の妥協は発見されていません。</li>
		</ol>
</li>
		<li>NCBI blast ブラウザー (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov) を使用して gRNA 結合部位の一意性をチェックする参照ゲノムに対して選択した gRNA シーケンスを爆発します。<ol>
<li>ゲノムとして「人間」を選択します。クエリ シーケンスとして gRNA シーケンスを入力します。「類似性の高いシーケンス」を選択 (メガブラスト) プログラムとして。GRNA シーケンスが一意であることを確認します。そうでない場合は、再びステップ 1.1.2.3 とブラストからの別 gRNA を選んだ。</li>
		</ol>
</li>
		<li>GRNA シーケンスを選択すると、それに応じて 5' と 3' HA として 1.1.1 手順で抽出したゲノム配列からインシリコ1,000 bp 上流と下流の gRNA シーケンスを選択します。 注: 、GRNAs 選択したゲノム統合サイトの軌跡に相同であるべきし、protospacer の隣接するモチーフに隣接 (PAM; 例えば、 SpCas9 の NGG) (図 2 a)。テレビには、5' と 3' HAs が並ぶの記者のシーケンスが含まれています。上流と下流の gRNA シーケンス11カバー 1000 bp があります。完全 gRNA シーケンスは、HA には含めない。最大 5 の重複 nt は受け入れられる (図 2 a)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
GRNA とターゲット ベクトルの生成 注:ベクター方式、図 2 bを参照してください。<ol>
<li>SpCas9 と gRNA の発現用ベクターを生成するには、元 SpCas9 と RNA (sgRNA) の 1 つのガイドの両方同時に表せることのバックボーンとして、pX330-U6-Chimeric_BB-cBh-hSpCas9 を使用します。バックボーンに gRNA シーケンスをクローン、BbsI 制限サイト12を使用します。</li>
		<li>テレビを生成する、(, pMK や cDNA3.1 などのバックボーンとして高いコピーのプラスミッドを選択します。<ol>
<li>まず、記者を組み立てる (このプロトコルで: LTR_tdTomato_BGH PA) ギブソン アセンブリ clong によって構造物のバックボーンに13クローン商業アセンブリを使用してキット、および 5' と 3' 制限のサイトをご紹介 (例えば、 5' パーチと 3'SmaI) それに続く制限消化がのクローニングのため。</li>
			<li>対象となるセル型のゲノム DNA (gDNA) から 1.1.4 で選んだ HA フラグメントの 1000 bp を増幅 (このプロトコルで: Jurkat 細胞) 活動を校正と DNA ポリメラーゼを用いた (表 1と2の PCR 食材を参照してくださいと循環の条件)。その後、記者が並ぶ各 HA (5' 3' HA の両端に SmaI、両端 HA のパーチ) の 5' と 3' 端に制限のサイトをご紹介します。</li>
			<li>順番にクローンは既に14,15をクローニング制限酵素による記者 (1.2.2.1 の手順で生成された) を含む構造物のバックボーンに持っています。まず、クローンで 5' HA 3' HA でパーチ制限のサイトを使用して、クローン、SmaI 制限のサイトを使用して。 注:テレビ バックボーンに追加蛍光レポーターがある場合不要なバックボーン統合フローサイトメトリーによって評価される (3.2.2 および 3.2.3 の手順を参照してください)。PCR を用いたバックボーン統合を評価する必要がありますテレビのバックボーンに蛍光レポーターが含まれていない場合 (手順 3.2.8 参照)。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58572/58572fig1.jpg"> 図 1: CRISPR Cas9 仲介されたターゲット、生成、およびワークフロー クローン記者の選択行に定義された統合サイト。(A) 目標点のベクターを生成し、目標点のベクターと Cas9/gRNA 発現プラスミド Jurkat T 細胞を変換します。(B) エンリッチ FACS による transfected セル 72 h ポスト トランスフェクションします。(C) 許可しなさいセル 10 ~ 14 日の成長ターゲットに PCR によるイベントの発生を確認およびフローサイトメトリーします。(D) 生成希釈させクローンを制限することによって単一細胞クローン成長 3 週間。(E) PCR による正しいターゲットのためのクローンを画面し、96 ウェル フォーマットでフローサイトメトリーします。選択されたクローンを展開します。(F) は南しみ、PCR やシーケンシング、および Cas9 a エンドヌクレアーゼ活性のターゲットをイベントの分析によって選択されたクローンのターゲットが正しいを確認します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58572/58572fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58572/58572fig2.jpg"> 図 2: 戦略とベクトル デザインを対象とします。(、) の gRNA と相同性武器の選択。20 nt gRNA は選ばれたゲノムのターゲット ・ サイトに相同と腕 1,000 bp アップを補完するものと、gRNA の下流、gRNA シーケンスを含める必要がありますいない PAM. 相同に隣接して位置しています。(b) ベクトルと gRNA/Cas9 ベクトルをターゲットの模式図。ターゲットのベクトルは、5' と 3' ホモロジー腕が並ぶは、選ばれた記者のシーケンスで構成されます。GRNA/Cas9 ベクターは pX330 U6 Chimeric_BB cBh hSpCas9 バックボーンに基づいています。(c) の相同組み換えによるターゲットの模式図。目標点のベクターと guideRNA/Cas9 ベクトルは Jurkat 細胞に導入しました。Cas9 はゲノムのターゲット ・ サイトで二重鎖切断を仲介する (によって示される *) と相同組換えとゲノムのターゲット遺伝子座に記者シーケンスの統合が容易になります。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58572/58572fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
2 Jurkat 細胞のターゲット CRISPR ・ Cas9-ベース
<ol><li>
Jurkat 細胞のトランスフェクション
	<ol>
<li>プレート 1.25 x 106 Jurkat T トランスフェクション前に 24 h は 10% (v/v) 牛胎児血清 (FCS) と 4 mM L-グルタミン [と呼ばれる「RPMI w.o. 抗生物質 (AB)」]/6 よく細胞培養プレートのウェルに添加 RPMI 1640 の 2.5 mL のセルします。単一ターゲットの実験の 1 つの完全な 6 ウェル プレートを準備 (すなわち, 6 井戸細胞懸濁液 2.5 mL をそれぞれ)。</li>
		<li>次の日に transfect 円形テレビと pX330-U6-Chimeric_BB-cBh-hSpCas9/gRNA Jurkat 細胞のトランスフェクション試薬特定を使用して細胞が共同。<ol>
<li>反応管でよく混ぜる商業 RPMI 培地の 250 μ L に低下した血清中濃度 (血清の 50% 削減を RPMI) の transfection のために最適化された円形のテレビの 2 μ g と pX330-U6-Chimeric_BB-cBh-hSpCas9/gRNA/ウェルの 2 μ g を追加します。</li>
			<li>管の壁に触れることがなく DNA/メディアにゆっくりとトランスフェクション試薬の 12 μ L を追加し、旋回します。混合物は 15 分間インキュベートし、滴下 1 つよくセルの追加をしましょう。37 ° C と 5% の CO2のセルを孵化させなさい。 注:トランスフェクション反応の準備をスケール アップすることができます。トランスフェクション後、中型の変更は不要です。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
蛍光活性化セル (FACS) を並べ替えして transfected セルの濃縮
	<ol>
<li>72 時間後のトランスフェクション プール transfected セル カウントする方法、FACS による濃縮のための準備します。4 分の 300 x gと部屋の温度 (RT) で遠心分離 50 mL の円錐管の細胞を収集、PBS で 1 回洗浄、遠心分離機の再度、1 x 10 FACS バッファー (1% の FCS + 1 mM EDTA を添加した PBS) の適切な量の餌を中断7細胞/mL、最後に FACS チューブに移すと。</li>
		<li>FACS のセルを対象し、テレビ (例えばこのプロトコルで, </li><li> </li><li></li></ol></li><li><ol><li></li><li><li><li> </li></ol></li><li> <ol><li><li> </li></ol></li></ol><ol><li><ol><li> </li><li></li><li><li> </li><li> </li><li><li><li> </li></ol></li><li> <ol><li><li> </li><li> </li><li> </li><li></li><li> </li><li></li><li><li></li><li></li><li> </li><li><li></li><li> </li></ol></li><li> <ol><li><li></li><li> </li><li> </li><li></ol></li><li> <ol><li><ol><li></li><li></li><li></li><li></li><li></li></ol></li><li><ol><li></li><li><li> </li></ol></li><li></li><li><li></li><li></li><li> </li></ol></li><li> <ol><li><ol><li><li></ol></li><li></li><li><li></li><li></ol></li></ol>

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</ol>

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ここでは、選ばれたプロウイルス統合サイト CRISPR ベース Cas9 ゲノム工学の応用と HIV 由来 1 Jurkat 記者のモデルを生成するプロトコルについて述べる。
プロトコルのいくつかのポイントでは、計画段階で細心の注意が必要です。いくつかの遺伝子座は他の人よりもターゲットに簡単かもしれませんので対象となる軌跡を注意深く選択する必要があります最初に、(例,地域とターゲットのクロマチン状態に応じてシーケンス自体)。反復シーケンスはターゲットのベクトルにクローンを作成するは難しい、ゲノム内で一意ではありません多くの場合。抑圧的なクロマチン領域は、CRISPR Cas9 システム19,20をターゲットにする困難です。
第二に、gRNA の選択は、CRISPR Cas9 媒介をターゲットに重要です。代表的な統合サイトと HIV 感染のためのモデルを生成するの目的のための統合のホット スポッ...

感染宿主ゲノムにプロウイルス DNA の統合は、ひと免疫不全ウイルス (HIV) のライフ サイクルの重要なステップです。次の統合、HIV はメモリー cd4 陽性 T 細胞など寿命の長い cd 4 + T 細胞のサブセットの遅延を確立することによって永続化します。HIV の統合は、非ランダムな1,2に表示されます。急性と慢性感染した人2,3,4 の統合サイトのシーケンスを通していくつかの研究で反復的統合のプロウイルス DNA ゲノム ホット スポットの数が検出されました、5,6,7,8。興味深いことに、これらの統合サイトのいくつかで同じ軌跡がリカレント サイトの統合も積極的にクローン性増殖1に影響を与える可能性があります考えにつながる、感染細胞の大部分で検出されました。
再発統合サイトの意義の理解を進めるためプロウイルス統合サイトの選択肢を検討する必要があります。ただし、いくつかの技術的な側面を妨げる勉強 HIV 統合サイトの選択と結果。JLat 細胞株は臨床的再発統合サイト9を反映していないような広く HIV 待ち時間の細胞モデルを使用しました。プライマリ患者由来細胞の研究、一方で、配列による統合サイト風景の説明を有効にするが、機能解析を可能にしません。我々 の知識に十分な実験モデルは機能的選択した臨床的に関連する統合サイトを分析する利用可能なありません。
CRISPR ベース Cas9 ゲノム工学技術を使用して HIV 感染のための新しいモデルを生成するための詳細なワークフローをご紹介します。ここ記載されているワークフローは、モデル選択した統合サイトで genomically 統合プロウイルス記者を運ぶ HIV 感染 T 細胞由来のレポーター細胞ラインを生成する使用できます。彼らしたがってプロウイルス統合サイトによる hiv 感染生物学への影響し、provirus が別の治療戦略 (待機時間逆転エージェントによる,誘導など) に応答する方法を探索する新しいツールとして提供しています。本手法は、CRISPR ベース Cas9 ゲノム工学、ターゲット ・ サイトで、Cas9 ヌクレアーゼ誘起の二重鎖切断によって促進される相同組み換えによるシーケンス レポーターの統合の利点を使用します。ターゲット ・ サイトの統合には、HIV 感染者と Cas9 を介したゲノム工学のための適したの PAM モチーフの存在に関する研究から説明再発統合サイトへの近さによって判断されます。
模範的な結果、BTB および CNC の相同性転写レギュレータ 2 のコード BACH2 遺伝子座に注力します。抗レトロ ウイルス療法に慢性的な HIV 感染、個人で BACH2 は統合された HIV-1 シーケンス3,6,7,8,10の濃縮を示す遺伝子座であります。BACH2 イントロン 5 の 2 つの特定のサイトにしようと思いましたが HIV 由来 1 長いターミナル リピート (左から右)、tdTomato コーディング シーケンスとウシ成長ホルモン (BGH) 起こる信号 (PA) から成る最小 HIV 由来の記者をしました。提案するプロトコルは、Jurkat 細胞、ヒト cd4 T 細胞由来の懸濁液セル行が線を使用して他のセルおよびそれに応じて適応プロトコルに最適です。相同性の腕、CRISPR-Cas9-介したレポーターのターゲットに選ばれたゲノム サイト、世代クローン系統の選抜に、包括的な目標点のベクターの構築対象サイトの選択の詳細なワークフローを提案する検証新しく生成された、対象となるレポーター細胞。

<table><tbody><tr><td>pX330-U6-Chimeric_BB-cBh-hSpCas9</td><td>Addgene</td><td>42230</td><td>ベクター SpCas9 および gRNA</td></tr><tr><td>pMK GeneArt</td><td></td><td></td><td>哺乳類発現ベクター</td></tr><tr><td>cDNA3.1</td><td>Invitrogen</td><td>V79020</td><td>哺乳類発現ベクター</td></tr><tr><td>BbsI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0539S</td><td>制限酵素</td></tr><tr><td>NEBuilder Hifi DNAアセンブリクローニングキット</td><td>New England Biolabs</td><td>E5520S</td><td>ターゲットベクターの生成に使用されるアセンブリクローニングキット</td></tr><tr><td>TaqPlus Precision PCR System</td><td>Agilent Technologies</td><td>600210</td><td>DNAポリメラーゼ プルーフリーディング活性 相同性アームの増幅(ステップ1.2.2.2)、インテグレーションサイトとレポーター配列の検証(ステップ3.3.3および3.3.5)、サザンブロット用ゲノムプローブの生成(ステップ3.4.1.5)、オフターゲットイベントの解析に使用(ステップ 3.5.4)</td></tr><tr><td>96ウェル組織培養プレート(丸底)</td><td>TPP</td><td>92097</td><td>希釈プレーティング用組織培養プレート</td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity DNAポリメラーゼ</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>M0530 L</td><td>DNAポリメラーゼは、ターゲティングイベントの検出(ステップ2.4.2)およびサザンブロット用のレポーター特異的プローブの生成に使用されます(ステップ3.4.1.4)</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド(DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9170</td><td>PCRとしてのジメチルスルホキシド添加物</td></tr><tr><td>塩化マグネシウム(MgCl2)溶液</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>B9021S</td><td>MgCl<サブ>2</サブ>溶液としてのPCR添加剤</td></tr><tr><td>デオキシヌクレオチド(dNTP)溶液ミックス</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>N0447S</td><td>dNTP混合物 PCR反応のための各NTの10mMとの</td></tr>混合物 <tr><td>5PRIME HotMasterMix</td><td>5PRIME</td><td>2200400</td><td>PCRスクリーニングに使用されるすぐに使えるPCRミックス(ステップ3.2.11)</td></tr><tr><td>QIAamp DNA血液ミニキット</td><td>Qiagen</td><td>51106</td><td>DNA分離および精製キット</td></tr><tr><td>QIAquick PCR精製キット</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td>PCR精製キット</td></tr><tr><td>RPMI 1640 グルタミンなし</td><td>ロンザ</td><td>BE12-167F</td><td>細胞培養培地</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 南アフリカ チャージ</td><td>PAN バイオテクノロジー</td><td>P123002</td><td>細胞培養培地サプリメント</td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>バイオクロム</td><td>K 0282</td><td>細胞培養培地サプリメント</td></tr>ペ<tr><td>ニシリン/ストレプトマイシン10.000 U / mL / 10.000 & micro;g/mL</td><td>Biochrom</td><td>A 2212</td><td>細胞培養培地サプリメント</td></tr><tr><td>Gibco Opti-MEM 低血清培地</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985062</td><td>トランスフェクションに最適化された血清濃度低減細胞培養培地</td></tr><tr><td>TransIT-Jurkat</td><td>Mirus Bio</td><td>MIR2125</td><td>トランスフェクション試薬</td></tr><tr><td>ホルボール 12-ミリスチン酸 13-アセテート</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8139-1MG</td><td>細胞培養試薬</td></tr><tr><td>イオノマイシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0634-1MG</td><td>細胞培養試薬</td></tr><tr><td>シリンジ駆動フィルターユニット、PESメンブレン、0,22 &micro;m</td> 無<td>菌ろ過用</td><td>Millex</td><td>SLGP033RB</td>フィルターユニット</tr><tr><td>Heracell 150iインキュベーター</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>51026280</td><td>組織培養インキュベーター</td></tr><tr><td>Amershan Hybond-N+</td><td>GE ヘルスケア</td><td>RPN1520B</td><td>DNAおよびRNAブロッティング用正電荷ナイロンメンブレン</td></tr><tr><td>Stratalinker 1800</td><td>Stratagene</td><td>400072</td><td>UV架橋剤</td></tr><tr><td>High Prime</td><td>Roche</td><td>11585592001</td><td>for labeling of DNA with radioactive dCTP using random oligonucleotides as primers</td></tr><tr><td>illustra ProbeQuant G-50 Micro Columns</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9034-08</td><td>クロマトグラフィースピンカラム 標識DNAの精製用</td></tr></tbody></table>

選択したプロウイルス統合サイトの hiv-1 感染の jurkat レポーターのモデルを生成する crispr ベース cas9 ゲノム工学

CRISPR-Cas9-based Genome Engineering to Generate Jurkat Reporter Models for HIV-1 Infection with Selected Proviral Integration Sites

ひと免疫不全ウイルス (HIV) は、再発のサイトやゲノムのホット スポットでホスト細胞のゲノムに非ランダムにプロウイルス DNA を統合します。ここで CRISPR ベース Cas9 ゲノム工学技術を使用して選ばれたゲノム統合サイトと HIV 感染の新規の in vitro モデルの生成の詳細なプロトコルを紹介します。この方法では、選択の記者のシーケンスに統合できます、選択したターゲットを絞った genomic 位置臨床的に関連する統合サイトを反映しています。
プロトコルでは、HIV 由来の記者の設計およびターゲット サイトと gRNA シーケンスの選択を説明します。両手を相同性ターゲット ベクトルが構築され、Jurkat T 細胞にトランスフェクションします。ターゲット ・ サイトで Cas9 を介した二重鎖切断によって促進される相同組み換えによる記者シーケンスは選択したゲノム サイト向けです。単一細胞のクローンを生成およびフローサイトメトリー PCR によって対象化、イベント上映します。選択されたクローンが展開し、PCR、シーケンシング、および南にしみが付くことによって検証は正しいターゲットします。CRISPR Cas9 を介したゲノム工学の潜在的なターゲットを離れてイベントが分析されます。
このプロトコルは、新しい細胞培養システムを用いた臨床的に関連する統合サイトでそのモデルの HIV 感染を生成できます。正しい記者シーケンス統合の単一細胞クローンの生成と検証は時間がかかるが、結果として得られる系統、機能的プロウイルス統合サイトの選択を分析するための強力なツールです。

この代表的な実験では、我々 は LTR、tdTomato コーディング シーケンス、および BACH2 遺伝子17のイントロンが 5 で 2 つの座位 polyA 信号系列から成る最小 HIV-1 由来の記者を対象とする分野します。HIV 感染患者2,4,5,6から主な T 細胞のさまざまな研究は、公開された再発統合サイトへの近さに従ってターゲット遺伝子が選ばれました 7,8と PAM モチーフ NGG 二重鎖切断の Cas9 を介した誘導に必要な存在。ターゲット ベクトル建設、説明プロトコルに従って transfected。トランス...

プロウイルス選択したゲノム サイト統合を要約 HIV-1 感染の新しい体外モデルの生成のゲノム工学ワークフローを提案します。記者の HIV 由来のターゲットは、CRISPR Cas9 媒介、サイト固有のゲノム操作によって促進されます。単一細胞クローン生成、スクリーニング、および正しいターゲットの検証のための詳しいプロトコルを提供しています。

選択したプロウイルス統合サイトの HIV-1 感染の Jurkat レポーターのモデルを生成する CRISPR ベース Cas9 ゲノム工学

Human immunodeficiency virus (HIV) integrates its proviral DNA non-randomly into the host cell genome at recurrent sites and genomic hotspots. Here we ...

この方法は、HIVプロウイルスの統合がアンドロギヌス遺伝子発現にどのような影響を与えるのか、そしてなぜ最近HIV感染細胞で特定のゲノム統合部位が選択されているのかという疑問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、CRISPR/Cas9ベースのゲノム工学を使用して選択された統合部位を標的としたプロウイルスレポーターを運ぶHIV感染のためのインビトロモデルを産生することができるということです。この手順のデモンストレーションは、博士課程の学生であるトーマス・ワルサーと、私の研究室のポスドクであるジュリア・ビアレクです。まず、UCSCゲノムブラウザを使用して、標的とするゲノム軌跡のゲノム配列をインシリコ抽出します。選択したゲノム軌跡を標的とする20ヌクレオチドの誘導RNAを選択するには、E-CRISPウェブツールを使用する。次に、ホモ・サピエンスゲノム参照コンソーシアムヒトゲノムを選択:Build 38.ゲノムをゲノム配列の生物と入力2,000塩基対として参照し、以前に抽出した所望のゲノム軌跡をカバーする。PAM、5素数基、オフターゲットが不一致を許容し、除外されたイントロンおよびCPG島を備えた中規模アプリケーション設定を使用してガイドRNA検索を開始します。表示されるガイドRNA設計のリストから、標的とする望ましいゲノム遺伝子座に可能な限り近い特異性と効率に関する高いスコアを持つガイドRNAを選択します。NCBI Blast ブラウザを開いて、選択したガイド RNA 配列を参照ゲノムに対してブラストします。選択したガイドRNA結合部位の一意性を確認するには、まずヒトをゲノムとして選択し、次にガイドRNA配列をクエリ配列として入力します。次に、非常に類似した配列またはメガブラストをプログラムとして選択し、ガイドRNA配列が一意であることを確認します。その後、インシリコ1,000塩基対を選択し、最初に抽出したゲノム配列からガイドRNA配列の上流および下流を選択する。これらの選択された1,000塩基対を、上流および下流に対して、ターゲットとするベクトル構築および隣接レポーターシーケンスをターゲットとする5素数および3つの相同性アームとして使用します。ジュルカットT細胞のトランスフェクションの24時間前に、単一の標的実験のために細胞の完全な6ウェルプレートを1個調製する。開始するには、プレート1、250、000細胞のRPMI 1640の2.5ミリリットルのサプリメントと抗生物質なし、井戸あたり。翌日、円形ターゲティングベクターのマイクログラムとCas9の2マイクログラムとガイドRNA発現プラスミドを井戸あたりに加え、トランスフェクション用に最適化された市販のRPMI培地の250マイクロリットルに、反応管で、渦によってよく混ぜます。その後、チューブの壁に触れることなく、12マイクロリットルのトランスフェクション剤をDNA培地にゆっくりと添加します。チューブをフリックし、室温で15分間インキュベートします。細胞の1つの井戸に滴下混合物を追加します。37°Cと5%の二酸化炭素で細胞をインキュベートします。トランスフェクションの72時間後、トランスフェクション細胞を引っ張り、それらを数え、FACSによる濃縮の準備をします。混合標的細胞集団における標的事象を確認した後、健康で未処理のジュルカトT細胞から抗生物質を含むRPMIを収集することによって、ジュルカト調整培地を事前に調製して単細胞クローンの生成を開始する。300Gで5分間チューブを遠心分離し、新しい50ミリリットル円錐形チューブに0.22マイクロメートルフィルターを使用して、25ミリリットルのシリンジで上澄み物を濾過します。拡大後10~14日後にFACSによって以前に濃縮された標的細胞を数え、抗生物質でRPMIで希釈し、1ミリリットル当たり100,000細胞の濃度にします。この細胞希釈液の100マイクロリットルを9.9ミリリットルの培地で希釈し、1ミリリットル当たり1,000細胞を達成する。その後、この希釈液の1ミリリットルを9ミリリットルの培地で1ミリリットルの濃度に希釈し、1ミリリットル当たり100細胞の濃度にします。プレート96ウェルプレートには、1ウェルあたり1つのセルを含み、100細胞/ミリリットル溶液の1ミリリットルを5ミリリットルの状態培地と4ミリリットルの新鮮な培地と、滅菌試薬貯留層で穏やかに混合します。次に、マルチチャンネルピペットを使用して、新しい96ウェルの丸底プレートのウェルあたり、それぞれの細胞希釈液の100マイクロリットルを加え、ウェル希釈液あたり1個と2個の細胞を達成します。96ウェルプレートを積み重ね、各スタックに3ミリリットルのPBSを含む6ウェルプレートを覆います。5%の二酸化炭素を加湿したインキュベーターで37°Cでプレートを3週間インキュベートします。インキュベーションを完了した後、4倍の倍率で軽い顕微鏡を使用して成長したコロニーの存在を視覚的に確認し、成長したコロニーで井戸をマークします。ピペット処理でよくマークされた1つの細胞を穏やかに再中断する。この細胞懸濁液の100マイクロリットルを、抗生物質で100マイクロリットルのRPMIを備えた準備された96ウェルラウンドボトムプレートの1つの井戸に移し、すべてのマークされた井戸について繰り返し、ピペットで穏やかに混合します。プレートを複製するには、このセル懸濁液の100マイクロリットルを2番目の空の96ウェルラウンドボトムプレートに移し、すべてのマークされたウェルに対してこのプロセスを繰り返します。最後に、200マイクロリットルのRPMIを抗生物質で空の井戸に充填します。プレートを摂氏37度と炭酸ガス5%でインキュベートします。重複プレートが24〜48時間インキュベートされた後、すべての井戸に抗生物質でRPMIの100マイクロリットルを追加することによって、再びそれを複製します。マルチチャンネルピペットを使用して穏やかに混ぜ、新しい96ウェルの丸底プレートの各ウェルに100マイクロリットルを移します。これらの2つの重複したプレートの1つをインキュベーターに入れます。フローサイトメトリー用の新しい重複プレートの2番目を使用し、まずウェルあたり5マイクロリットルのPMA/イオノマイシンマスターミックスを追加して、細胞を刺激します。24時間インキュベートし、テキストに記載されているようにフローサイトメトリー用に細胞を調製する。前方および横方向の散乱のサイズに基づいて、実行可能な単一の細胞をゲートします。フローサイトメトリーによる蛍光レポーター遺伝子発現解析PCRにより単細胞クローンをスクリーニングするために、選択したレポーター配列に基づいてPCRをスクリーニングするためのプライマーP5およびP6を設計し、レポーター配列の500〜800塩基対を増幅する。ポジティブコントロールPCRの場合、野生型の非標的ゲノム軌跡の630塩基対を増幅するプライマーP7とP8を設計します。ターゲティング・ベクター・バックボーン配列の非特異的な統合のための制御として、ターゲティング・ベクター・バックボーンの500から600の塩基対を増幅する第3のプライマーペアを設計する。2番目の重複プレート内のクローンが十分に成長したら、まず室温で300-Gで10分間遠心してPCRスクリーニングに備えます。上清を慎重に取り除き、細胞ペレットを乱さないようにします。穏やかなピペットで100マイクロリットルのPBSで細胞を洗い、室温で300Gで5分間プレートを遠心します。PBSを取り除き、井戸あたり200マイクロリットルの溶菌バッファーを追加します。ピペットを軽く混ぜ、新しいPCRプレートに移します。パラフィンフィルムでプレートを密封し、サーモサイクラーで摂氏55度で1時間インキュベートします。最大速度で細胞の破片を10分間遠心した後、上清を新しいPCRプレートに移します。この細胞のライセートの10マイクロリットルを、110マイクロリットルの蒸留H2Oで満たされた96ウェルPCRプレートの各ウェルに加えます。次に、サーモサイクラーで摂氏99度で10分間インキュベートし、タンパク質を不活性化するK.この細胞ライゼの2マイクロリットルをテンプレートとして使用し、スクリーニング、制御および骨格PCRのための市販のPCRマスターミックスを使用します。PCR を 38 ~ 40 サイクルの PCR 増幅で 96 ウェル形式で実行します。5マイクロリットルのPCR産物を使用し、1.5%アガロースTAEゲルで実行し、フローサイトメトリーとPCR結果を分析して組み合わせて、単一細胞クローンを確認します。PMA/イオノマイシン誘導後のレポーター遺伝子発現は、細胞の4~12%のフローサイトメトリーとPCRの両方により、統合部位に応じて確認した。5素子および3素積分結合のプライマーを用いたゲノムDNAのPCR解析は、ターゲティング事象が発生したことを確認した。フローサイトメトリーによる正しい標的化のための単一細胞クローンのスクリーニング後、高、低、蛍光レポーター遺伝子発現がないクローンが観察された。単細胞クローンは、レポーター特異的プライマーおよび制御プライマーを用いたPCRによっても確認された。スクリーニングPCRで陽性を確認したクローンは、レポーター特異的プローブとレポーター外部のゲノムプローブ結合を用いて、サザンブロットによる正しい標的化のためにさらに分析された。サザンブロット分析で正しいバンドサイズを示した部分のみで、レポーターをヘテロ接合的に統合し、サザンブロットによるPCR結果を検証することが重要であることを示した。クローンはまた、正の単細胞クローンをさらに確認するためにシーケンシングによって分析された。標的部位のシーケンシング:相同性アレーレは、レポーターが統合していなかったので、Cas9誘発突然変異を明らかにした。一度習得すると、HIVレポーターラインの生成は2〜3ヶ月で達成することができます。ターゲット設定を行う前に、取り組みたい研究の質問に応じて、統合サイトと適切なレポーターを選択するのに十分な時間を費やしておくことが重要です。レポーターは、例えば、必要に応じて異なるHIV調節要素を含むことができる。この手順に従って、細胞株は、例えば、その統合部位に応じて、レポーターLTRの転写活動に対する異なる遅延上昇剤の効果をテストするために使用することができる。このビデオを見た後、ガイドRNAとターゲティングベクターを設計し、ジュルカット細胞でCRISPR/Cas9ベースのゲノムエンジニアリングを行い、単一細胞クローンを産生し、FACSおよびPCRスクリーニングによって正しく標的化されたクローンを選択するための統合サイト特異的HIVレポーターラインを生成する方法をよく理解する必要があります。複製能力のあるHIVレポーターと一緒に作業することを選択した場合は、BSL3の安全条件の下で作業する必要があることを忘れないでください。

crispr-cas9-based-genome-engineering-to-generate-jurkat-reporter

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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学ぶCRISPR-Cas9ゲノム工学によるHIV-1感染のin vitroモデル構築法。Jurkat細胞で特定のプロウイルス統合サイトを標的化し、レポーター遺伝子導入と単一細胞クローン選別の手法を解説。HIV生物学研究に有用。

選択したプロウイルス統合サイトの HIV-1 感染の Jurkat レポーターのモデルを生成する CRISPR ベース Cas9 ゲノム工学

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