レニフォーム線虫抵抗に対する綿のジェノタイプのスクリーニング

ここでは、レニフォーム線虫耐性に対する綿のゲノムタイプの迅速な非破壊スクリーニングのためのプロトコルが提示される。このプロトコルは、線虫に感染した綿の苗の根を視覚的に調べて感染反応を決定することを含む。各植物からの栄養芽は、種子生産のための植物を回復するために伝播されます。

この方法は、レニフォーム線虫に強い綿の品種の開発に役立つ可能性があります。他の綿種からの耐性遺伝子型の同定と繁殖集団の評価を通じて。この技術の主な利点は、レニフォーム線虫スクリーニングのための単純で非破壊的な方法を提供することです。

1つの4センチメートルの直径、21センターの高さの円錐形のプラスチックポットの底に綿のボールを置くことから始めます。そして、鍋の上から約2センチメートルに蒸気低温殺菌土壌混合物でポットを充填します。植える遺伝子型を指定した各鉢にプラスチックの杭を入れ、適切な対応する綿の種を各鉢に植えます。

種子をカバーするために追加の土壌で各ポットを充填し、16時間の蛍光灯と白熱ランプの写真期間で摂氏28度の一定温度に設定された成長室にポットを置きます。その後、各ポットに水のエミッタを配置し、1日2回ポットに水を与えるために自動散水システムを使用しています。植え付けの7日後、各植物の隣の土壌に小さなうつ病を作成し、各うつ病にレニフォーム線虫懸濁液の1ミリリットルを追加します。

接種後、根底から線虫を洗浄しないようにポット水を慎重に管理する必要があります。接種後28日後、はさみを使って植物から完全に膨張した葉のほとんどを取り除き、各ポットを絞り、土壌を片手にスライドさせて植物を取り除きます。10リットルの容器の中の水道水で根系を穏やかに攪拌して根から土壌を取り除き、続いてきれいな水道水の容器に短いすすがを加えます。

はさみを使用して、土壌ラインの約1センチメートル下の植物から洗浄された根系を取り除きます。根をプラスチック120ミリリットルの非滅菌可処分標本容器に入れます。次に、約30ミリリットルの赤い食品着色液で根系を完全に覆い、試料容器を電子レンジに入れ、溶湯を加熱して沸騰し始める。

サンプルが室温まで冷却されたら、赤い食品着色液を100ミリリットルの水道水に交換して余分な汚れを取り除きます。その後、試料容器の上にカバーを置き、根感染分析までサンプルを摂氏4度で保存します。種子生産のための植物を回復するには、新しい円錐形のプラスチックポットの底に綿のボールを置き、部分的に泥炭苔ポッティング媒体でポットを埋めます。

ポットに収穫された栄養シュートを1つの根システムに置き、鍋を埋めるためにポッティングミディアムをしっかりと追加します。新しいラベル付きプラスチックのステークを各ポットに入れ、綿の遺伝子型を指定し、ポットのトレイを水のプラスチック容器に入れます。植物に簡単に水をやってポッティング媒体を湿らせ、28°Cの一定温度と16時間の写真期間に設定された成長チャンバーにポットを置きます。

約30日後、1鉢当たり6リットルのプラスチックポットを1本のポッティング培地で部分的に充填します。各植物を6リットルの鉢に移し、苗を植えるごとにポッティングミミズを各鉢にしっかりと加えます。その後、ガラスの家に植物を配置し、ポッティング媒体を湿らせるために水を追加します。

R.reniformis根感染を評価するには、標本容器から根サンプルを取り除く。20倍率の下で根系に取り付けられた雌の線虫の数を数えるために、ステレオ顕微鏡を使用してください。線虫の根系感染の成功は、線虫が冬の間にあまり活発でないため、接種および季節変動に使用される線虫の生存率を含むいくつかの要因の影響を受ける可能性があります。

その後、余分な水分を取り除くために約10分間ペーパータオルの上に根系を置きます。ルートシステムの重量を量って、新鮮なルートウェイトを決定します。根の成長のばらつきは切除の間で一般的である。

これらの変動は、新鮮な根重量によって測定されるように、同じ遺伝子型の植物間でも観察することができる。比較的少ない女性のレニフォーム線虫は、感受性のある遺伝子型と比較して耐性綿遺伝子型の供給部位を確立することができる。新鮮な根重さのデータは、各遺伝子型の根組織のグラム当たりの雌の線虫の数を計算するために使用することができます。

耐性遺伝子型に対する1グラム当たりの雌の線虫の数は一般に10未満であるのに対し、感受性のある遺伝子型は一般的に1グラム当たり30以上の線虫を有する。ここでは、300の植物を含む分離F2集団からのデータのサブセットが示されている。根系の根成長および線虫感染の変動のこれらの範囲は、線虫評価のために一般的に観察され、この手順が1回の実験で多数の植物をスクリーニングし、この変動を最小限に抑え、かつ抵抗性の遺伝学の正確な評価を容易にするために使用される能力を示す。

この手順に従って、レニフォーム線虫耐性の遺伝学は、抵抗性に関連するDNAマーカーを同定するために決定することができる。これらのマーカーは、マーカー支援の繁殖と、高地綿への線虫類耐性の伝達に使用することができます。その開発後、この技術は、研究者が耐性綿の品種の繁殖を支援するために線虫再スクリーニング後に植物を回収することを可能にする非破壊的な方法を提供しました。