Name: マイクロ ct 画像に基づく法病変を特徴と、小動物の脳に電極を配置 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 12 s
Description: 学ぶマイクロCTを用いたラット脳の非破壊的3Dイメージング法。病変と電極位置を正確に特定し、脳構造と機能の関係を詳細に解析できます。神経科学研究における革新的な可視化技術です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

作者ありがとうグレッグ ・ リンとアーサー ・ マクレランドの専門知識のマイクロ CT 機、デビッド リッチモンドと、イメージでハンター エリオットとデータ解析コア (加) 画像処理のアドバイスのためのハーバード衛生学校、ボストンでウィリアム Liberti 付き優雅キンカチョウ脳を提供する大学。この作業を行った一部センターでナノスケール システム (CNS)、メンバーの国家ナノテクノロジー調整インフラストラクチャ ネットワーク (NNCI)、全米科学財団 NSF 賞第 1541959 の下でサポートされているため。中枢神経系は、ハーバード大学の一部です。この作品は、リチャードとスーザン ・ スミス ・ ファミリー基金と IARPA (契約 #D16PC00002) によって支えられました。S.B.E.W. は人間のフロンティア科学プログラム (HFSP; から奨学金によって支えられました。LT000514/2014)、欧州分子生物学機構 (エンボ;ALTF1561-2013)。G. g. で、国立科学財団 (NSF) 大学院研究奨学金プログラム (GRFP) に対応しました。

すべてのケアと動物の実験操作の見直しにも承認されてハーバード大学施設動物ケアおよび使用委員会。ここで説明した灌流は、ラットの特定、手順はより小さいまたは同様に大きさで分類された頭脳を持つ任意の動物に適用されます。
1. 血流
<ol><li>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) × 1 を準備します。ラットの (年齢: 0.5-1.5 歳、重量: 250-600 g)、800-1,000 mL で十分なはず。動物と定着剤を希釈する追加 400 mL を灌流して 400 mL を使用します。</li>
	<li>2% (w/v) パラホルムアルデヒド (PFA) および 1x PBS で 2.5% (w/v) グルタールアルデヒド (GA) から成る固定液を準備します。ラット、400 mL で十分です。灌流後の脳のポスト固定の 50 mL の円錐管に 50 mL を保存します。</li>
	<li>15 分 (0.8 L/分 O2 1.0 バー 21 ° c) で 4-5% イソフルラン ガスでラットを麻酔します。</li>
	<li>ペントバルビ タール ナトリウムの致死量を腹腔内注入 (180 mg/kg)。</li>
	<li>つま先ピンチ反射試験を行うことにより動物の反射損失をテストします。動物は、その反射的な反応を失っているまで灌流を開始するを待ちます。</li>
	<li>前述 intracardial 血流と脳抽出プロトコル14次のソリューションに従います: 400 ml の 1x PBS 125 mmhg 血液を取り除くために動物を灌流します。すべての血は削除されており 1x PBS に置き換え、PFA と 125 mm Hg に 1x PBS で溶解 2.5% GA 400 mL の 2% の溶液を灌を開始します。 メモ: 手順は、ラットではない動物で行われているが場合、灌流プロシージャの唯一の重要なコンポーネントは 1 × PBS と 2% の使用 PFA、1 × PBS で 2.5% ジョージア。ソリューション ボリュームと灌流圧は、種に応じて調整する可能性があります。</li>
</ol>2. ポスト固定
<ol><li>抽出した脳が、2 %pfa、PBS 溶液 (以前動物を灌流するために使用同じ溶液) x 1 2.5% ジョージア。ソリューション ボリュームが少なくとも脳のボリューム x 10 であることを確認します。ラット、溶液 50 mL と 50 mL の円錐管で脳を配置します。2-3 日間、4 ° C で軽く揺れポスト固定のサンプルを格納します。 注: サンプルは 50 mL のコニカル チューブには、軌道のシェーカーに水平方向に配置する最良の結果確保されます。</li>
	<li>サンプル後、修正されています長い間十分な後洗って純水や脱イオン水 (式行先方向2O)、二重蒸留水 (ddH2O) のサンプル (材料の表を参照) を 4 回次の期間: 1、1、1、および 15 分。 注: このプロトコルの ddH2O、式行先方向2O、または純水べき交換です。便宜上、ddH2O は精製水を今後参照するために使用されます。</li>
</ol>3. 染色
注意: このステップでは、手袋を使用している間、フードの下ですべてのソリューションの準備を実施します。
<ol><li>少なくとも 10 x の染色液の脳の容積を準備します。ラット脳の ddH2O で 4% OsO4原液 25 mL と ddH2o. の 25 mL を組み合わせることによりの 2% (w/v) 四酸化オスミウム (OsO4) 50 mL を準備する. 注意: 四酸化オスミウムは揮発性一時的な失明および呼吸器系の問題を引き起こす可能性がありますしないと適切に処理します。セカンダリ コンテナー内の適切な化学物質の危険コンテナーの四酸化オスミウムにお問い合わせくださいすべての資料を破棄します。</li>
	<li>新しい 50 mL の円錐管で脳を置き、OsO4ソリューションを追加します。脳は、OsO4組織の脂質と反応として茶色を回すが開始されます。</li>
	<li>管を閉じるし、はパラフィン徹底的に印鑑 (材料の表を参照) を映画には潜伏中に漏洩しないことを確認します。 注: オスミウムは揮発性と正しくチューブをシールすることは非常に重要なので、チューブのプラスチックで穏やかに反応します。チューブは、追加の保護用アルミ箔で包まれるかもしれない。</li>
	<li>4 ° c で 2 週間 50 回転軌道シェーカーで軽く揺れ封管を格納します。最高の混合をように水平方向にチューブを置きます。揺れながらサンプルを完全に水没のソリューションを確認します。 注: オスミウムを継続的に循環する許可されていない場合、それが完全に浸透できませんサンプルでは、シェーカーの水平方向の配置は非常に重要ですので。</li>
</ol>4. 埋め込み
<ol><li>サンプルは、2 週間の OsO4で培養されてが後で洗って室温 (RT) で ddH2O 5 回次の期間: 1、1、1、15、およびサンプルのすべての非連結 OsO4を削除する 60 分。 注: 最後の 60 分交換を含む複数の交換を拡散する循環システムですべてのオスミウムを許可する必要があります。</li>
	<li>4 ° C で ddH2O 30 分のサンプルを洗う 注: オスミウムをサンプルから拡散する続行可能性がありますが、その量は前の手順から大幅に削減する必要があります。</li>
	<li>最終的に樹脂を浸透させるエタノールとサンプルを脱水します。10-20 mL (30 分間各で 4 ° C) 以下のエタノールの希釈液の脱水に置き換える ddH2O: エタノール 20% (v/v) と 80% (v/v) ddH2O;50% (v/v) エタノール、50% (v/v) ddH2O;70% (v/v) エタノールと 30% (v/v) ddH2O;90% (v/v) エタノールおよび 10% (v/v) ddH2O;100% エタノール。</li>
	<li>とおりアセトン/樹脂希釈液を準備します。<ol>
<li>製造元の指示に従って (材料の表を参照) を埋め込むため樹脂の 100 mL を準備します。</li>
		<li>33% (v/v) 樹脂-67% をアセトン溶液にするには、50 mL の円錐管に樹脂の 15 mL を注ぐし、100% ガラス蒸留アセトン 30 mL を加えます。</li>
		<li>50% (v/v) 樹脂 50% アセトンをするためには、50 mL の円錐管に樹脂 22.5 mL を注ぎ、100% ガラス蒸留アセトンの 22.5 mL を追加します。</li>
		<li>67% (v/v) 樹脂-33% アセトン溶液を作る、50 mL の円錐管に樹脂の 30 mL を注ぎ、100% ガラス蒸留アセトンの 15 ミリリットルを追加します。</li>
		<li>100% 樹脂の下の最初の解決策として残りの 32.5 mL の樹脂を使用します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>を介して次のアセトン ・ アセトン/樹脂希釈 10 〜 20 mL サンプルを移動することによって樹脂浸透過程を開始: 4 ° C で 30 分間 100% アセトン4 ° C で 30 分間 100% アセトン・室内温度 (RT) で 30 分間 100% アセトン。 注: 残りの浸透プロセスで行われる RT。</li>
	<li>常温では、3 h の 33% (v/v) 樹脂 67% アセトン、RT、RT で 3 h の 67% (v/v) ガレージ 33% アセトンと室温 12 h 100% 樹脂で 3 h の 50% (v/v) 樹脂 50% アセトンでサンプルを浸す</li>
	<li>樹脂ボトルの指示に従っての 50 mL の新鮮なバッチを作る。サンプルが治癒されるコンテナーに転送 (e.g。、使い捨て金型材料の表に記載されている)。新鮮な 100% 樹脂でサンプルを室温 4 時間蒸らします メモ: は、前日に樹脂が途中で硬化を開始新鮮な樹脂を使用しない場合、サンプルを操作するは難しいでしょう。</li>
	<li>ドガ、45 ° C で 15 分間真空オーブン サンプル メモ: この手順、サンプル内で気泡を取り除くのに役立ちますが、必須ではない、データの品質は影響しません。</li>
	<li>最後に、60 ° C で 48 時間オーブンでサンプルを治す</li>
</ol>5. マイクロ CT
<ol><li>サンプルが硬化されている一度使い捨て金型をはがし、マイクロ CT 機械でそれをスキャンします。 注: 使用機械によっては設定が異なるがあります。材料の表に記載されている著者によって使用されるスキャナーの推奨設定は、130 kV、0.1 mm の銅フィルターとモリブデン ソース、1 秒露出と投影あたり 4 フレームの平均で 135 μ A。ただし、多くの要因が特定のセッション中に最適な設定に影響を与える、実験者で個別にスキャナーする必要があります調整します。</li>
	<li>スキャンが完了すると、スキャナー ソフトウェアをコンピューター上の実験者のスキャナー/ソフトウェアの組み合わせの推奨パラメーターとサンプルを再構成します。</li>
	<li>最後に、視覚化し、実験者の好みのソフトウェアを使用して再建されたデジタル ボリュームを分析する (例は材料の表を参照)。</li>
</ol>

<ol><li>Scoville, W., Milner, B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10678523">Loss of recent memory after bilateral hippocampal lesions.</a> Journal of Neuropsychiatry and Clinical Neuroscience. 12, 103-113 (2000).</li>
<li>Damasio, H., Grabowski, T., Frank, R., Galaburda, A. M., Damasio, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+return+of+Phineas+Gage%3A+clues+about+the+brain+from+the+skull+of+a+famous+patient%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The return of Phineas Gage: clues about the brain from the skull of a famous patient.</a> Science. 264 (5162), 1102-1105 (1994).</li>
<li>Kawai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+cortex+is+required+for+learning+but+not+for+executing+a+motor+skill%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Motor cortex is required for learning but not for executing a motor skill.</a> Neuron. 86, 800-812 (2015).</li>
<li>Otchy, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+off-target+effects+of+neural+circuit+manipulations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Acute off-target effects of neural circuit manipulations.</a> Nature. 528, 358-363 (2015).</li>
<li>Wright, N., Vann, S., Aggleton, J., Nelson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+for+the+anterior+thalamus+in+directing+attention+to+task-relevant+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A critical role for the anterior thalamus in directing attention to task-relevant stimuli.</a> Journal of Neuroscience. 35, 5480-5488 (2015).</li>
<li>Kapgal, V., Prem, N., Hegde, P., Laxmi, T., Kutty, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+term+exposure+to+combination+paradigm+of+environmental+enrichment%2C+physical+exercise+and+diet+reverses+the+spatial+memory+deficits+and+restores+hippocampal+neurogenesis+in+ventral+subicular+lesioned+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Learning+and+Memory%22%5BJournal%5D)">Long term exposure to combination paradigm of environmental enrichment, physical exercise and diet reverses the spatial memory deficits and restores hippocampal neurogenesis in ventral subicular lesioned rats.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 130, 61-70 (2016).</li>
<li>Hosseini, N., Alaei, H., Reisi, P., Radahmadi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+NBM-+lesion+on+synaptic+plasticity+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">The effects of NBM- lesion on synaptic plasticity in rats.</a> Brain Research. 1655, 122-127 (2017).</li>
<li>Palagina, G., Meyer, J., Smirnakis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+visual+motion+representation+in+mouse+area+V1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Complex visual motion representation in mouse area V1.</a> Journal of Neuroscience. 37, 164-183 (2017).</li>
<li>Ranjbar, H., Radahmadi, M., Reisi, P., Alaei, H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28063155">Effects of electrical lesion of basolateral amygdala nucleus on rat anxiety-like behavior under acute, sub-chronic, and chronic stresses.</a> Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. , (2017).</li>
<li>Wood, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+honeycomb+maze+provides+a+novel+test+to+study+hippocampal-dependent+spatial+navigation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The honeycomb maze provides a novel test to study hippocampal-dependent spatial navigation.</a> Nature. , (2018).</li>
<li>Vermaercke, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+specialization+in+rat+occipital+and+temporal+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Functional specialization in rat occipital and temporal visual cortex.</a> Journal of Neurophysiology. 112, 1963-1983 (2014).</li>
<li>Jun, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+integrated+silicon+probes+for+high-density+recording+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fully integrated silicon probes for high-density recording of neural activity.</a> Nature. 551, 232-236 (2017).</li>
<li>Masís, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((micro-CT-based+method+for+quantitative+brain+lesion+characterization+and+electrode+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">micro-CT-based method for quantitative brain lesion characterization and electrode localization.</a> Scientific Reports. 8, 5184(2018).</li>
<li>Gage, G., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. 65, 3564(2012).</li>
<li>Helander, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+studies+of+formaldehyde+binding+in+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnic+%26+Histochemistry%22%5BJournal%5D)">Kinetic studies of formaldehyde binding in tissue.</a> Biotechnic & Histochemistry. , (1994).</li>
<li>Paljärvi, L., Garcia, J., Kalimo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+efficiency+of+aldehyde+fixation+for+electron+microscopy%3A+stabilization+of+rat+brain+tissue+to+withstand+osmotic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">The efficiency of aldehyde fixation for electron microscopy: stabilization of rat brain tissue to withstand osmotic stress.</a> Histochemical Journal. , (1979).</li>
<li>Okuda, K., Urabe, I., Yamada, Y., Okada, H. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0922338X91902315">Reaction of glutaraldehyde with amino and thiol compounds.</a> Journal of Fermentation and Bioengineering. 71, (1991).</li>
<li>Bahr, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osmium+tetroxide+and+ruthenium+tetroxide+and+their+reactions+with+biologically+important+substances%3A+electron+stains+III%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Osmium tetroxide and ruthenium tetroxide and their reactions with biologically important substances: electron stains III.</a> Experimental Cell Research. , (1954).</li>
<li>Khan, A. A., Riemersma, J. C., Booij, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+reactions+of+osmium+tetroxide+with+lipids+and+other+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">The reactions of osmium tetroxide with lipids and other compounds.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 9, 560-563 (1961).</li>
<li>Riemersma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osmium+tetroxide+fixation+of+lipids+for+electron+microscopy+a+possible+reaction+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Osmium tetroxide fixation of lipids for electron microscopy a possible reaction mechanism.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 152, (1968).</li>
<li>Mikula, S., Binding, J., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staining+and+embedding+the+whole+mouse+brain+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Staining and embedding the whole mouse brain for electron microscopy.</a> Nature Methods. 9, 1198-1201 (2012).</li>
<li>Mikula, S., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+whole-brain+staining+for+electron+microscopic+circuit+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">High-resolution whole-brain staining for electron microscopic circuit reconstruction.</a> Nature Methods. 12, 541-546 (2015).</li>
<li>Crespigny, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+micro-CT+imaging+of+the+postmortem+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">3D micro-CT imaging of the postmortem brain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 171, 207-213 (2008).</li>
<li>Anderson, R., Maga, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+procedure+for+rapid+imaging+of+adult+mouse+brains+with+MicroCT+using+Iodine-Based+contrast%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A novel procedure for rapid imaging of adult mouse brains with MicroCT using Iodine-Based contrast.</a> PLoS One. 10, 0142974(2015).</li>
<li>Zhou, Z., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27027284">Cerebral cavernous malformations arise from endothelial gain of MEKK3-KLF2/4 signalling.</a> Nature. 532, 122-126 (2016).</li>
<li>Choi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-CT+imaging+reveals+mekk3+heterozygosity+prevents+cerebral+cavernous+malformations+in+Ccm2-Deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Micro-CT imaging reveals mekk3 heterozygosity prevents cerebral cavernous malformations in Ccm2-Deficient mice.</a> PloS One. 11, 0160833(2016).</li>
<li>Choi, J., Yang, X., Foley, M., Wang, X., Zheng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+Micro-CT+imaging+of+cerebral+cavernous+malformations+in+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Induction and Micro-CT imaging of cerebral cavernous malformations in mouse model.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2017).</li>
<li>Benveniste, H., Kim, K., Zhang, L., Johnson, G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10860789">Magnetic resonance microscopy of the C57BL mouse brain.</a> Neuroimage. 11, 601-611 (2000).</li>
<li>Weninger, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+episcopic+microscopy%3A+a+rapid+technique+for+high+detailed+3D+analysis+of+gene+activity+in+the+context+of+tissue+architecture+and+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Embryol%22%5BJournal%5D)">High-resolution episcopic microscopy: a rapid technique for high detailed 3D analysis of gene activity in the context of tissue architecture and morphology.</a> Anat Embryol. 211, 213-221 (2006).</li>
<li>Schneider, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((high-throughput+magnetic+paragraph+sign+resonance+imaging+of+mouse+embryonic+paragraph+sign+anatomy+using+a+fast+gradient-echo+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22MAGMA%22%5BJournal%5D)">high-throughput magnetic paragraph sign resonance imaging of mouse embryonic paragraph sign anatomy using a fast gradient-echo sequence.</a> MAGMA. 16, 43-51 (2003).</li>
<li>Sharpe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+projection+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Optical projection tomography.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 6, 209-228 (2004).</li>
<li>Cox, D. D., Papanastassiou, A., Oreper, D., Andken, B., James, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Resolution+Three-Dimensional+microelectrode+brain+mapping+using+stereo+microfocal+x-ray+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">High-Resolution Three-Dimensional microelectrode brain mapping using stereo microfocal x-ray imaging.</a> Journal of Neurophysiology. 100, 2966-2976 (2008).</li>
<li>Borg, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+metal+electrodes+in+the+intact+rat+brain+using+registration+of+3D+microcomputed+tomography+images+to+a+magnetic+resonance+histology+atlas%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Localization of metal electrodes in the intact rat brain using registration of 3D microcomputed tomography images to a magnetic resonance histology atlas.</a> eNeuro. 2, (2015).</li>
<li>Fu, T. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+long-term+chronic+brain+mapping+at+the+single-neuron+level%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Stable long-term chronic brain mapping at the single-neuron level.</a> Nature Methods. 13, 875-882 (2016).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

プロトコルへの重要なステップを次に示します: まず、動物を灌流し、その後脳を修正後に PFA と GA の組み合わせの使用された組織の一貫性のある完全オスミウム浸透を達成するために重要です。我々 は明示的にこれをテストしていない、もっともらしい説明が PFA 固定がという可逆15、GA 固定ではなく可逆16,17。四酸化オスミウムで 2 週間培養組織の完全浸透に必要なため、脳の内部に PFA が外部に拡散し、染色中の組織が劣化です。オスミウムは、これにより内部の構造を保持できません。
バッファーに溶解した水溶液オスミウム, オスミウムとは対照的の使用(すなわち、ナトリウム cacodylate)、オスミウムによる完全組織浸透を確保するため絶対に必要だった。6 週間培養後もナトリウム cacodylate に溶解したオスミウムは、完全に、組織に潜入したないと拡散障壁 (<strong class="xf...

神経科学者は、機能と脳の位置関係を理解するために長い時間のための病変に頼ってきました。たとえば、我々 の理解は、学習と記憶に不可欠なものとして海馬と衝動の制御のためのキーであると前頭前野の人間1,2の偶然の病変の両方の製品であった。ただし、動物モデルの使用は、セレンディピティ、越えて行くことによって病変の力を利用する神経科学者を許可しているし、無数の脳領域の機能を介して構造-機能相関の体系的な研究を通じて解明されてきた病変3,4。
正しく関数を構造体に割り当て、ただし、病変の研究は必要正確な定量化プロシージャは、不足している領域です。病変を定量化するための現在のゴールド スタンダードは、セクション、マウント、および光顕によるイメージ脳することです。イメージのスライス、アトラスに最も近いセクションに一致し、科目間で病変のおおよその座標が間接的に報告される、多くの場合カメラ lucida 画像や例組織スライス3,4 を使用して ,5,6,7,8,9,10。
現在病変定量化手順の不正確さを超えてこれらのテクニックがかかり、故障しやすいです。脳剛性、刃の鋭さ、および温度の小さな変化は、しくじった、ワープ、または引き裂かれたセクションにつながることができます。セクションで均等にない染色もできるし、正しく取り付け中の泡のためイメージを作成します。重要なは、断面、時に脳の病変の位置の三次元のコンテキストが失われ、挑戦的な脳の病変の正確な 3 D 再構成を行います。
病変のもう一つの一般的なアプリケーションは、シングルと脳内の複数の電極レコーディングの場所を確認してきました。最後の記録セッションの終わりには、研究者は、電極先端部に小型の電解病変を誘発する、従来病変実験11で組織学的脳を処理します。この手法は, 組織学的検索に挑戦されている電解の病変は通常それらを行うための電極よりも大きいが、通常十分に小さいという別の問題と上記で説明した同じ欠点により苦しみます。・ テトロード配列の場合のように複数の電極を挿入する場合、電解病変による検証はさらに困難です。電解病変に代わるは12, 組織学的にことを確認後に電極上の染料の使用が、従来の組織に付属する同じ欠点に苦しんでいるこの手法。
ここでは、我々 が詳細に説明染色電子顕微鏡検査 (EM) や x 線技術に基づいて最近説明方法13 ct マイクロ-) 病変を定量化し、現在より小さな動物の脳に電極を検索メソッド。マイクロ CT は x 線がシンチレータを収集しないサンプルによって偏向 x 線 360 ° 回転したサンプル ショットは、イメージング手法です。結果は、任意の方向の可視化および正確に定量化できるサンプルの高解像度デジタル 3 D 再構成です。多くの学術機関があるマイクロ CT スキャナーも市販されています。

<table><tbody><tr><td>パラホルムアルデヒド (PFA)</td><td>電子顕微鏡科学 (EMS)</td><td>15710</td><td>2% (w/v/) in 1X PBS</td></tr><tr><td>グルタルアルデヒド (GA)</td><td>EMS</td><td>16220</td><td>2.5% (w/v) GA in 1x PBS</td></tr><tr><td>OsO4</td><td>EMS</td><td>19190</td><td>ヒュームフードでの作業</td></tr><tr><td>エタノール</td><td>Decon Labs</td><td>Koptec</td><td>140, 190, 200 プルーフ</td></tr><tr><td>アセトン</td><td>EMS</td><td>10015</td><td>ガラス蒸留</td></tr><tr><td>Durcupan ACM樹脂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>44610</td><td>A、B、C、Dコンポーネント、埋め込み用樹脂</td></tr><tr><td>使い捨て金型</td><td>Ted Pella</td><td>27114</td><td>推奨</td></tr><tr><td>ミリQ水(超純水)</td><td>ミリポアシグ</td><td>マQGARD00R1(または関連清浄機)</td><td>推奨</td></tr><tr><td>パラフィルム(パラフィンフィルム)</td><td>ミリポアシグマ</td><td>P7793</td><td>推奨パラフィンフィルム</td></tr><tr><td>マイクロCTスキャナー</td><td>Nikon Metrology Ltd., Tring, UK</td><td>X-Tek HMS ST 225</td><td>著者が使用</td></tr><tr><td>マイクロCTスキャンの視覚化と分析のためのソフトウェア:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Volume Graphics</td><td>VG Studio Max</td><td>著者</td></tr><tr><td></td>が使用 <td>FEI / Thermo Scientific</td><td>Avizo</td><td>著者</td></tr><tr><td></td>が使用 <td>FEI / Thermo Scientific</td><td>アミラ</td><td>Avizo</td></tr><tr><td></td><td>マーク・サットン &Russell Garwood</td><td>Spiers</td><td>Free、http://spiers-software.org/</td></tr> <tr><td></td><td>Pixmeo Sarl</td><td>Osirix Lite Free</td><td>、https://www.osirix-viewer.com/</td></tr> <tr><td></td><td>オープンソース</td><td>FIJI</td><td>Free、https://fiji.sc/</td></tr> <tr><td></td><td>Adobe</td><td>Photoshop</td><td>一度に 1 つのスライスを分析するのに適しています</td></tr></tbody></table>

マイクロ ct 画像に基づく法病変を特徴と、小動物の脳に電極を配置

A Micro-CT-based Method for Characterizing Lesions and Locating Electrodes in Small Animal Brains

病変と電極の位置確認は伝統的を介して病理染色脳スライスの手動の推定を必要とする時間のかかる手順を行われています。ここでは、シンプルで簡単な病変を定量化し、少ない骨の折れるより詳細な結果は、脳に電極を検索法について述べる.頭脳全体は四酸化オスミウム染色、樹脂に埋め込まれている、マイクロ CT スキャナーで画像化します。スキャンの解像度・仮想セクション厚さサンプル サイズに依存して脳の 3 D デジタル ボリュームの結果 (ラット、キンカチョウの voxel あたり 12-15 および 5-6 μ m 脳、それぞれ)。表面・深部病変が特徴付けることができる単管四極管, ・ テトロード配列, 電解病変とシリコン プローブのローカライズすることができます。独占的なソフトウェアでは、実験者面とボリュームのセグメントからサンプル ボリュームを手動でまたは自動的に調べることができます。このメソッドでは、脳全体のボリュームを生成するため内および研究間での比較を標準化するため、現在の方法でよりもはるかに高い程度に病変と電極を定量化することができます。

従来、脳の断面や病変を定量化し、電極を検索するために染色が、このメソッドは、エラーが発生しやすい、労働集約的で、通常、結果の推定を必要とします。マイクロ CT イメージングの頭脳全体を準備することによってサンプルの損傷の確率が大幅に減少、興味の機能は、脳全体のコンテキストで分析されるよう、メソッドは多数試料の並列処理にかなりそれ自身を貸すサンプル準備をスピードアップします。
メソッドは 4 つの主要なステップを含む: (1) 四酸化オスミウムと灌流脳の染色、(2) 樹脂の脳を埋め込み、(3) マイクロ CT スキャナーで脳をイメージング、(4) 解析結果デジタル ボリューム (図 1)。この記事では、手順 4 (解析) は、プロジェクトの特定のニーズによってかなり異なりますにのみ手順 1-3 を説明します。
<p class="jove_content" fo:keep-togethe...

この資料では、マイクロ CT イメージング、どの病変を示すことができる、電極を脳全体のコンテキストで高精度に位置する小動物の脳を準備する簡単な方法について説明します。

Lesion and electrode location verification are traditionally done via histological examination of stained brain slices, a time-consuming procedure that ...

この方法は、病変を検証し、電極の位置を特定するためのより簡単で、エラーが起こりやすい、より定量的な方法を提供することによって、神経科学の分野における主要な質問に答えることができます。この技術の主な利点は、切除を必要とせずに脳全体の病変および電極部位の検証を可能にすることである。最終的な製品は、脳のデジタル3Dボリュームであり、複数の脳を並列に処理することができます。この方法はラットで実証されるが、マウスやシマウマフィンチなどの他の生物にも適用することができる。一般的に, この方法に新しい個人は、いくつかのステップは、最良の結果を確保するために特定の注意を必要とするため、苦労します.まず、抽出した脳を50ミリリットルの円錐管に拡散液に入れる。摂氏4度で穏やかに揺れながら、サンプルを2〜3日間保存します。オスミウムは、バッファーではなく、水で希釈されていることを確認してください。これは、水が中性洗剤として機能し、オスミウムが組織の奥深くに浸透することを可能にするためです。2%オスミウム四酸化2%の50ミリリットルを二重蒸留水で調製します。その後、新しい50ミリリットル円錐形のチューブに脳を配置し、オスミウム四酸化溶液を追加します。チューブを閉じ、漏れを防ぐためにパラフィンフィルムで密封します。密閉チューブを摂氏4度で2週間穏やかな揺れをして保管してください。チューブが水平に配置されていることを確認します。脳は非常に厚く、拡散によって移動する長い方法です。チューブを水平に配置すると、オスミウムが組織の奥深くに移動できるようになります。サンプルを2週間インキュベートした後、二重蒸留水で5回洗浄し、結合していないオスミウム四酸化スメウムをサンプルから取り除きます。次に、サンプルを摂氏4度で30分間二重蒸留水で洗います。二重蒸留水をエタノールの4つの希釈物と交換して、サンプルを脱水します。樹脂浸潤処理を開始するには、3つのアセトンと3つのアセトン樹脂希釈液を介してサンプルを移動し、その後、試料を室温で100%樹脂に浸漬し、浸潤処理を継続します。その後、サンプルを使い捨て金型に移します。室温で4時間、新鮮な100%樹脂をサンプルに注入します。真空オーブンでサンプルを45°Cで15分間脱気します。その後、オーブンで60°Cで48時間サンプルを治します。最後に、試料の硬化が終了したら、使い捨て金型を剥がして、マイクロCTマシンでスキャンします。従来の断面では、脳の向きはあらかじめ決められなければならない。このマイクロCT法を用いて、サンプル脳のデジタル体積を3次元で操作し、事実上あらゆる方向にスライスすることができる。調製されたラット脳の走査型電子顕微鏡は、マイクロCTイメージングの目的で組織が著しく損傷していないことを確認する。シマウマフィンチ脳はまた、他の小さな動物の脳上のこの方法の有用性をテストするために、このプロトコルに従って準備され、スキャンされました。この技術は、脳内の深い病変だけでなく、脳内の表面病変を見つけるために使用することができます。この技術は、その場での単一のテトロド、電解病変、電極トラック、その場でのテトロードアレイ、シリコンプローブの位置にも適用できます。この手順を試みている間, 脳が十分に長い間、十分な攪拌でインキュベートすることを忘れないようにすることが重要です.この手順に従って、光遺伝学および2光子イメージングのような他の方法は、異なる脳領域が異なる行動で果たす役割に関する追加の質問に答えるために行うことができる。この技術は、神経科学の分野の研究者がラット、マウス、ソングバード、および他の小動物における脳と行動との間の構造機能関係をよりよく探求することを可能にする可能性がある。オスミウムでの作業は非常に危険であり、手袋を着用したり、真空フードで作業したりするなど、常にこの手順を実行する場合は注意が必要です。

a-micro-ct-based-method-for-characterizing-lesions-locating

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

このビデオは、無線双方向マルチチャンネル電極ユニットをラットの脳に埋め込んで、マルチチャンネルニューラルネットワークを記録し、刺激する手順を示しています。...

ラット脳への無線双方向微小電極システムの移植

出典: Choi, J. P. et al. マウスモデルにおける脳海綿状奇形の誘導およびマイクロCTイメージング。 J. Vis. Exp.

マウス脳における脳海綿状奇形病変の造影マイクロCTイメージング

ここでは、光学的にクリアし、齧歯類の脳組織における慢性的に注入されたマイクロデバイスの周りにイメージング無傷の脳組織のインターフェイスを、ラベリング、キャプチャするための組織学的手法を提案する。この方法を含む技術から得られた結果は、その周囲の組織の様々な鋭い脳インプラントの影響を理解するために有用である。...

脳移植マイクロデバイス及び周辺組織の無傷の組織学的性状

このプロトコルはマウス モデルにおける脳海綿静脈奇形病の誘導を示し、使用造影病変の負担を測定するマイクロ コンピューター断層撮影。このメソッドは、分子基盤と脳海綿静脈奇形の潜在的な治療とその他の脳血管疾患を勉強する確立されたマウス...

誘導およびマウス モデルにおける脳海綿静脈奇形のマイクロ CT イメージング

多光子イメージングは組織表面からの限られた深さでしか効果がありませんが、pCLEを介して任意の深さで3μm分解能のイメージングを達成することが可能です。ここでは、発作性マウスと野生型マウスの海馬の微小血管動態を測定するためのpCLEイメージングを実施するためのプロトコルを提示します。...

覚醒マウスの海馬毛細血管の In Vivo ファイバー結合前臨床共焦点レーザー走査内顕微鏡 (pCLE)

ここで組織をクリア、蛍光標識と、それによって、大脳新皮質の細胞型の三次元組織の可視化を可能にするマウスの脳組織の大規模なイメージング手順をについて説明します。...

マウス大脳皮質における細胞組織の大規模三次元イメージング

ここでは、ミニブタモデルにおける軟硬膜下電極アレイの長期的な性能と安全性を評価する方法を提示し、手術方法とツール、術後の磁気共鳴画像法、聴覚皮質の電気生理学、インプラントの電気化学的特性、および死後の免疫化学について説明します。...

ミニブタにおける硬膜下軟性皮質電図(ECoG)アレイ移植と長期皮質記録

この研究では、マイクロコンピュータ断層撮影(micro-CT)と造影剤をex vivo...

マウス新生児脳のマイクロCTイメージングと形態解析

頭蓋外刺激の用量反応曲線を脳電界測定と関連するバイオマーカー-脳血流の観点から評価するためのプロトコルについて説明します。このプロトコルは脳への侵襲的な電極の配置を含むので、全身麻酔が、制御された呼吸よりもむしろ自発呼吸が好まれる必要である。...

麻酔マウスにおける頭蓋外刺激電極の配置と脳血流および頭蓋内電界の測定

ミリサイズのコイルと組み合わせた低コスト脳波記録システムにより、マウス脳をin vivoで経頭的に刺激する

ここでは、ラットとマウスの高密度微小皮質電位法(μEcoG)記録のための2つのプロトコル(外科手術、移植、記録方法を含む)を紹介します。μECoG記録は、ラット聴覚皮質における層流ポリトロード記録、またはマウス体性感覚皮質における神経活動の光遺伝学的操作と組み合わせて行われます。...

げっ歯類における層流ポリトロードと光遺伝学とマイクロ皮質電図法の統合による皮質処理のマルチスケール研究

学ぶマイクロCTを用いたラット脳の非破壊的3Dイメージング法。病変と電極位置を正確に特定し、脳構造と機能の関係を詳細に解析できます。神経科学研究における革新的な可視化技術です。

マイクロ ct 画像に基づく法病変を特徴と、小動物の脳に電極を配置

さらに動画を探す