センサー蛍光蛋白質生きているセルおよびバルク量を定量化する方法

ここでは、遺伝子組み合わせたスペクトル的に異なる光活性化能および蛍光タンパク質を含むプロトコルを提示する。これらの内部定規は蛍光されるように活性化されるPAFPの分率の定量を可能にする。これまで、蛍光に活性化されたPAFPの発現量を生命細胞で一括定量する方法は利用されていない。光活性化効率の提示定量は、生細胞のPA-GFPおよびPA Cherryに例示されるが、それは原理的に広く適用可能であり、任意の実験条件下で任意の光活性化可能な蛍光タンパク質に使用することができる。遺伝的にコードされた蛍光タンパク質を使用する場合、発現するタンパク質の絶対量は細胞によって異なり、未知です。細胞間の発現を標準化するために、我々は、遺伝子組み合わせたスペクトル的に異なる蛍光タンパク質の内部定規を導入する。蛍光タンパク質の常にスペクトル的に区別される蛍光タンパク質のスペクトル的に区別される蛍光タンパク質の遺伝情報に結合することによって、まだ未知の総量に発現されるが、1対1の固定既知の相対量で作成されます。付随するテキストプロトコルに記載されているようにプラスミドの構築を開始する。また、フェノールレッドフリー版を用いてその遠近媒体中の標準細胞株で培養する。実験を開始する準備ができたら、フェノールレッドを使わずにトリプシンを使って細胞を収穫し、背景の蛍光を減らします。収穫後、T12.5細胞培養フラスコで増殖したコンフルエント細胞培養液から細胞懸濁液を2mlのピペットに充填する。8つのチャンバーガラススライドの各チャンバーに1滴を加えます。標準的な細胞培養条件下でスライドを24時間インキュベートします。次に、流通器プロトコルに従って市販の試薬を使用して細胞をトランスフェクトする。GFPチェリー、PA-GFPチェリー、GFPPAチェリーキメラで細胞をトランスフェクトします。次に、タンパク質発現、折りたたみ、成熟を可能にするために、細胞をインキュベーターに戻します。トランスフェクション後合計20時間後、加湿および加熱された環境室を備えた共焦点の花膜顕微鏡のステージに細胞を37に移す