Name: Biocytin 回復と塗りつぶされた海馬 ca 2 介在ニューロンの 3 D 再構成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-20T14:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 21 s
Description: 学ぶ海馬CA2介在ニューロンの生細胞内記録後のバイオシチン回復と3D再構成プロトコル。神経細胞の超微細構造を保存し、樹状突起と軸索の樹状構造を高精度に再構成する手法を習得できます。

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この研究はノバルティス ファーマ (バーゼル) と授与教授アレックス ・ トムソン、バイオ テクノロジー ・生物科学研究会議 (BBSRC-BB/G008639/1)、日本生理学会、欧州連合の医学研究議会から資金を受けています。ホライズン 2020年枠組み計画研究・革新特定無償契約第 720270 の下で (人間の脳プロジェクト SGA1) と特定無償契約第 785907 の下で (人間の脳プロジェクト SGA2)。非常に感謝しております教授アレックス ・ トムソンに彼女の継続的な支援、資金調達、その他の皮質でプロトコルを設定するためこのプロジェクトのため。研究室のメンバーを回復プロトコルの最適化を助け、CA2 神経細胞を再構築による貢献は感謝し: j. Deuchars、h. Pawelzik、d. i. ヒューズ、a. p. バニスター、k. イーストレーク、H. トリッグ、N. A. Botcher。

<ol><li>Klausberger, T., Somogyi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+diversity+and+temporal+dynamics%3A+the+unity+of+hippocampal+circuit+operations%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations.</a> Science. 321, 53-57 (2008).</li>
<li>DeFelipe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+classification+and+nomenclature+of+cortical+GABAergic+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons.</a> Nature Reviews Neuroscience. 14 (3), 202-216 (2013).</li>
<li>Bezaire, M. J., Soltesz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+CA1+local+circuits%3A+knowledge+base+for+interneuron-pyramidal+cell+connectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of CA1 local circuits: knowledge base for interneuron-pyramidal cell connectivity.</a> Hippocampus. 23, 751-785 (2013).</li>
<li>Katona, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavior-dependent+activity+patterns+of+GABAergic+long-range+projecting+neurons+in+the+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Behavior-dependent activity patterns of GABAergic long-range projecting neurons in the rat hippocampus.</a> Hippocampus. 27, 359-377 (2017).</li>
<li>Ali, A. B., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facilitating+pyramid+to+horizontal+oriens-alveus+interneurone+inputs%3A+dual+intracellular+recordings+in+slices+of+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Facilitating pyramid to horizontal oriens-alveus interneurone inputs: dual intracellular recordings in slices of rat hippocampus.</a> Journal of Physiology. 507, 185-199 (1998).</li>
<li>Ali, A. B., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+alpha+5+subunit-containing+GABAA+receptors+mediate+IPSPs+elicited+by+dendrite-preferring+cells+in+rat+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Synaptic alpha 5 subunit-containing GABAA receptors mediate IPSPs elicited by dendrite-preferring cells in rat neocortex.</a> Cerebral Cortex. 18, 1260-1271 (2008).</li>
<li>Ali, A. B., Bannister, A. P., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+correlations+between+action+potential+duration+and+the+properties+of+synaptic+connections+in+layer+4+interneurones+in+neocortical+slices+from+juvenile+rats+and+adult+rat+and+cat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Robust correlations between action potential duration and the properties of synaptic connections in layer 4 interneurones in neocortical slices from juvenile rats and adult rat and cat.</a> Journal of Physiology. 580, 149-169 (2007).</li>
<li>Pawelzik, H., Bannister, A. P., Deuchars, J., Ilia, M., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+bistratified+cell+IPSPs+and+basket+cell+IPSPs+by+pentobarbitone+sodium%2C+diazepam+and+Zn2%2B%3A+dual+recordings+in+slices+of+adult+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modulation of bistratified cell IPSPs and basket cell IPSPs by pentobarbitone sodium, diazepam and Zn2+: dual recordings in slices of adult rat hippocampus.</a> European Journal of Neuroscience. 11, 3552-3564 (1999).</li>
<li>Pawelzik, H., Hughes, D. I., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4176080/">Physiological and morphological diversity of immunocytochemically defined parvalbumin-and cholecystokinin-positive interneurones in CA1 of the adult rat hippocampus.</a> Journal of Comparative Neurology. 443, 346-367 (2002).</li>
<li>Thomson, A. M., Lamy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+maps+of+neocortical+local+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Functional maps of neocortical local circuitry.</a> Frontiers of Neuroscience. 1, 19-42 (2007).</li>
<li>Kepecs, A., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interneuron+cell+types+are+fit+to+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interneuron cell types are fit to function.</a> Nature. 505 (7483), 318-326 (2014).</li>
<li>Wilent, W. B., Nitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discrete+Place+Fields+of+Hippocampal+Formation+Interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Discrete Place Fields of Hippocampal Formation Interneurons.</a> Journal of Neurophysiology. 97, 4152-4161 (2007).</li>
<li>Hirsch, J. A., Martinez, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminar+processing+in+the+visual+cortical+column%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Laminar processing in the visual cortical column.</a> Current Opinion in Neurobiology. 16 (4), 377-384 (2006).</li>
<li>Kay, K., Sosa, M., Chung, J. E., Karlsson, M. P., Larkin, M. C., Frank, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hippocampal+network+for+spatial+coding+during+immobility+and+sleep%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A hippocampal network for spatial coding during immobility and sleep.</a> Nature. 531, 185-190 (2016).</li>
<li>Yu, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+hippocampal-cortical+memory+representations+for+experiences+associated+with+movement+versus+immobility%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Distinct hippocampal-cortical memory representations for experiences associated with movement versus immobility.</a> eLife. 6, e27621(2017).</li>
<li>Markram, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+and+Simulation+of+Neocortical+Microcircuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Reconstruction and Simulation of Neocortical Microcircuitry.</a> Cell. 163, 456-492 (2015).</li>
<li>Van Geit, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BluePyOpt%3A+Leveraging+Open+Source+Software+and+Cloud+Infrastructure+to+Optimise+Model+Parameters+in+Neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroinformatics%22%5BJournal%5D)">BluePyOpt: Leveraging Open Source Software and Cloud Infrastructure to Optimise Model Parameters in Neuroscience.</a> Frontiers in Neuroinformatics. 10, 17(2016).</li>
<li>Gal, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rich+cell-type-specific+network+topology+in+neocortical+microcircuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Rich cell-type-specific network topology in neocortical microcircuitry.</a> Nature Neuroscience. 20, 1004-1013 (2017).</li>
<li>Thomson, A. M., West, D. C., Wang, Y., Bannister, A. P. <a target="_blank" href="https://academic.oup.com/cercor/article/12/9/936/383201">Synaptic connections and small circuits involving excitatory and inhibitory neurons in layers 2-5 of adult rat and cat neocortex: triple intracellular recordings and biocytin labeling in vitro.</a> Cerebral Cortex. 12, 936-953 (2002).</li>
<li>Mercer, A., West, D. C., Morris, O. T., Kirchhecker, S., Kerkhoff, J. E., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitatory+connections+made+by+presynaptic+cortico-cortical+pyramidal+cells+in+layer+6+of+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Excitatory connections made by presynaptic cortico-cortical pyramidal cells in layer 6 of the neocortex.</a> Cerebral Cortex. 15, 1485-1496 (2005).</li>
<li>West, D. C., Mercer, A., Kirchhecker, S., Morris, O. T., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Layer+6+cortico-thalamic+pyramidal+cells+preferentially+innervate+interneurons+and+generate+facilitating+EPSPs%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Layer 6 cortico-thalamic pyramidal cells preferentially innervate interneurons and generate facilitating EPSPs.</a> Cerebral Cortex. 16, 200-211 (2006).</li>
<li>Bannister, A. P., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+properties+of+excitatory+synaptic+connections+involving+layer+4+pyramidal+cells+in+adult+rat+and+cat+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Dynamic properties of excitatory synaptic connections involving layer 4 pyramidal cells in adult rat and cat neocortex.</a> Cerebral Cortex. 17, 2190-2203 (2007).</li>
<li>Mercer, A., Trigg, H. L., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+neurons+in+the+CA2+subfield+of+the+adult+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Characterization of neurons in the CA2 subfield of the adult rat hippocampus.</a> Journal of Neuroscience. 27 (7), 7329-7338 (2007).</li>
<li>Mercer, A., Eastlake, K., Trigg, H. L., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+circuitry+involving+parvalbumin-positive+basket+cells+in+the+CA2+region+of+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Local circuitry involving parvalbumin-positive basket cells in the CA2 region of the hippocampus.</a> Hippocampus. 22 (1), 43-56 (2012).</li>
<li>Mercer, A., Botcher, N. A., Eastlake, K., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SP-SR+interneurones%3A+a+novel+class+of+neurones+of+the+CA2+region+of+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">SP-SR interneurones: a novel class of neurones of the CA2 region of the hippocampus.</a> Hippocampus. 22 (8), 1758-1769 (2012).</li>
<li>Sabatini, D. D., Bensch, K., Barrnett, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochemistry+and+electron+microscopy%3A+The+Preservation+of+Cellular+Ultrastructure+and+Enzymatic+Activity+by+Aldehyde+Fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cytochemistry and electron microscopy: The Preservation of Cellular Ultrastructure and Enzymatic Activity by Aldehyde Fixation.</a> Journal of Cell Biology. 17, 19-58 (1963).</li>
<li>Somogyi, P., Takagi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+note+on+the+use+of+picric+acid-paraformaldehyde-glutaraldehyde+fixative+for+correlated+light+and+electron+microscopic+immunocytochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A note on the use of picric acid-paraformaldehyde-glutaraldehyde fixative for correlated light and electron microscopic immunocytochemistry.</a> Neuroscience. 7, 1779-1783 (1982).</li>
<li>Hughes, D. I., Bannister, A. P., Pawelzik, H., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+immunofluorescence%2C+peroxidase+labelling+and+ultrastructural+analysis+of+interneurones+following+prolonged+electrophysiological+recordings+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Double immunofluorescence, peroxidase labelling and ultrastructural analysis of interneurones following prolonged electrophysiological recordings in vitro.</a> Journal of Neuroscience Methods. 101, 107-116 (2000).</li>
<li>Botcher, N. A., Falck, J. E., Thomson, A. M., Mercer, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4176080/">Distributions of interneurones in the CA2 region of the rat hippocampus.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 8, 104(2014).</li>
<li>Mercer, A., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cornu+Ammonis+Regions-Antecedents+of+Cortical+Layers%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">Cornu Ammonis Regions-Antecedents of Cortical Layers?</a> Frontiers in Neuroanatomy. 11, 83(2017).</li>
<li>Blackman, A. V., Grabuschnig, S., Legenstein, R., Sjöström, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+manual+neuronal+reconstruction+from+biocytin+histology+or+2-photon+imaging%3A+morphometry+and+computer+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">A comparison of manual neuronal reconstruction from biocytin histology or 2-photon imaging: morphometry and computer modeling.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 8, 65(2014).</li>
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電気生理学的記録の in vitro (図 1 Ac、d 、紀元前 d) 併用組織化学的、免疫組織化学的手順詳細な形態、カルシウム結合タンパク質のコンテンツを有効にして明らかに大人の皮質介在ニューロンの id が記録されます。Ca 2 地域でこの手法は初めての局所神経回路の研究を許可し、CA1、CA3 でないが以前記載されていた介在のサブクラスを明らかに: 樹状突起・軸索の広いアーバー バスケット細胞 (図 1 b)解像細胞と SP SR 介在ニューロン。
ここで説明されているプロトコルは、神経細胞の微細構造を保持し、樹状突起 (含む棘) と軸索のアーバーの優秀な回復を取得する最適化されています。重要なステップなど光顕26のコントラストを高めるため二重固定法の使用抗体浸透を強化し、神経を保持する固定液に, グルタルアルデヒドおよびピクリン酸溶液添加微細構造の27。Osmication と樹脂埋め込み z 平面収縮28に削減、穏やかな凍結融解の透過は微細構造のより良い保全を提供します。また、H2O2と背景の汚損を抑える NaBH4セクションの孵化によって (たとえば小さなボタンと軸索の罰金) の微細構造の可視化が向上します。コントラストは、HRP 反応に NiCl2を追加して増やすことができます。
ここで詳細な病理組織学的のプロシージャでは、再現性と信頼性の面で優れた結果を提供しています。ただし、電気生理学的記録の期間は biocytin/蛍光染色、貧しい軸索染色に通常関連付けられている短い録音の品質を決定します。微細解剖学の biocytin 保存/保護プロトコル (全細胞パッチク対鋭い電極を用いた細胞内記録) を記録する選択も影響します。
感謝は、ここで説明した組織学的処理と 100 倍の倍率 (軸索の複雑さによっては 1-4 週間) で再構築するのにかかる時間の間に微細構造を維持する、このメソッドにより、困難に遭遇しながら、樹状突起と軸索直径の正確な表現です。ただし、これらはしばしば微細軸索分岐の明確に可視化を妨げ、以下の biocytin ラベルを明らかにする要求の厳しいプロトコルの使用は理解できます。洗剤、アビジン-HRP biocytin と抗体を明らかにするためのエントリを促進するために、厚いセクションで必要が、微細構造を混乱させることができます。神経科学者検索、復興の半自動の方法の常が、今、マニュアル再建を特に biocytin HRP 軸索ゴールド スタンダード31のままです。
非常に詳細な神経再建、軸索の研究とノード、有無、ミエリンのそしてより一般的に沿って正確な軸索直径の表現で完全な軸索のアーバーの図面変更の特に正確な図面その長さ、さらに別個の interneurone の型を正確に識別のための情報を提供します。上記手法は、神経電気生理学的特性、接続の特定の種類に関連付けられているし、詳細な短期可塑性に相関のデータを提供しますが多く介在神経細胞は、特定のクラスと正確に合わない場合があります、神経再建、配線図、ca 2 地域でできるように詳細に検討します。
計算モデルの罰金、詳細な構造が簡素化されました。ながら理解できるが、この結果、将来的に重要かもしれない情報の損失。シナプスの並列データの詳細な 3 D 再構成の分析は介在神経細胞分類の基準さらに添加を可能にします。データは、公開リポジトリに堆積して計算軸索直径と活動電位伝搬の髄鞘形成の散発的な変化の結果を探検するモデラーのために使用できます。

皮質および海馬神経の分類5,6の1,2,3,4, その間の関係の地図をサブタイプなどの複雑な構造は、します。,7,8,9,10,11この回路が認知機能12,13,14,15をサポートする方法もなお強烈な研究と継続的な議論の主題が。たとえば、詳細と回路の複雑性を理解して、多くのさまざまな研究から得られたデータを調整するを定義し、コンポーネントを記述することができるため非常に便利だが、それはどのように議論のための問題のまま多くの異なったニューロンの存在、あるいはそれが特定のクラスに属するすべてのニューロンを定義することが可能かどうか。計算ツールを構築でき、複雑さの度合いと回路をテストされている開発16,17,18, が、これらの努力の中心は細胞の詳細な研究の必要性それらの間の接続のプロパティ。使用して既に収集されて大量ラットの大脳皮質の局所神経回路についてのプロトコルがここで説明した10,19,20,21,22.「配線図」は完成には程遠い、明確なパターンやルールが浮上しています。、異なるいくつかの詳細がこれらのルールは、2 つの哺乳類種 (ラットおよび猫)、そしていくつかの新皮質領域、一般的な人間の大脳新皮質に同様に適用できる可能性のある基本的なビルディング ブロックの開発が可能.ここで説明する手法が研究されていない前に、詳細にプロトコルを使用している領域での接続に関与するシナプス前及びシナプス後ニューロンを識別することによって皮質の機能地図の私達の理解を拡張する使用は大人の脳組織の優秀な組織の温存と顕著な染色の回復ができます。細胞内の電気生理学的記録 (鋭い電極と一対の録音) を充填、biocytin と組み合わせることでこの方法で収集された ca 2 の局所回路でこのサブフィールドにおける神経膜特性データ蛍光抗体法、組織プロシージャおよび非常に詳細な神経再建、隣接 CA 地域23,24,25との直接比較を許可します。
長年にわたり細胞と高品質の適切な分類と両方の樹状突起と軸索のアーバー、ことができるデータの正確な復元を許可する詳細な神経解剖学を取得するこの資料に記載されている技術を開発しました。鋭い電極を使用してペアのレコーディングから収集した電気生理学的データに関連付けられます。組織のプロトコルは、神経細胞の微細構造を保持し、樹状突起 (含む棘) と軸索のアーバーの優秀な回復を取得する最適化されています。たとえば、まず固定液に浸漬し、第二に四酸化オスミウムで固定後の二重固定法の原理は、光顕26の良いコントラストを与えます。少量のグルタルアルデヒドとピクリン酸のソリューションは、固定液抗体浸透を強化し、以前研究27で推奨されている細胞の微細構造を保持するに追加されます。従来の洗剤ではなく、ショ糖、低温保護と組み合わせて凍結融解法を用いた脳スライスの透過はまた記録された細胞の詳細な形態学的分析のためのティッシュの最適な保全を提供します。さらに、特に非常に微細構造の可視化が過酸化水素 (H2O2) と水素化ホウ素ナトリウム (NaBH4) 孵化と、背景の汚損を減らすことによって向上します。西洋ワサビペルオキシダーゼ (HRP) に塩化ニッケル (NiCl2) を追加する黒色色素反応生成物を得る反応はまた、コントラストを向上させます。
次のプロトコルでは、優れた組織の温存と体外細胞内記録次の非常に詳細な神経 3 D 再構成を確認するための手順について説明します。スライス標本の説明を使用してペアの細胞内の録音の鋭い電極と私たちの研究室で使用される組織学的手順は、以前に報告された28をされています。450-500 μ m の厚さのスライスに biocytin 満ちている細胞内のセルに適用されますが、プロトコル、全体セルの録音に続く同じプロトコルを使用される可能性があります。ただし、薄いスライスの使用は、細胞の少ない完全な復元になります。

<table><tbody><tr><td>アビジン-7-アミノ-4-メチルクマリン-3-酢酸(アビジン-AMCA)抗体-20.8 mg / mL&nbsp;</td><td>ベクターラボラトリーズ</td><td>A2008</td><td></td></tr>バイオ<tr><td>シチン&nbsp; &ge;98% (TLC)</td> <td>Σ</td><td>B4261</td><td></td></tr><tr><td>3,5 ジアミノベンジジン (DAB) 錠剤、5 mL</td><td>シグマ</td><td>D4293</td><td></td></tr><tr><td>Durcupan エポキシ樹脂 A</td><td>Σ</td><td>44611</td><td></td></tr><tr><td>Durcupan エポキシ樹脂 B</td><td>Σ</td><td>44612</td><td></td></tr><tr><td>Durcupan エポキシ樹脂 C</td><td>Σ</td><td>44613</td><td></td></tr><tr><td>Durcupan エポキシ樹脂 D</td><td>Σ</td><td>44614</td><td></td></tr><tr><td>エタノール、純度 p.a.、絶対、&ge;99.8%</td><td>シグマ</td><td>32221</td><td></td></tr><tr><td>ゼラチン</td><td>シグマ</td><td>48723</td><td></td></tr><tr><td>グルタルアルデヒド溶液、グレードI、H2Oシ</td><td>グマ</td><td>G5882</td><td></td>グリセロールで25%</tr>、<tr><td>&ge;99%&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>G5516</td><td></td></tr>ヤ<tr><td>ギ血清</td><td>シグマ</td><td>G9023</td><td></td></tr>ヤ<tr><td>ギ抗マウスフルオレセインイソチオシアネート(FITC)-14.3 mg / mL</td><td>シグマ</td><td>F2653</td><td></td></tr>ヤ<tr><td>ギ抗ウサギテキサスレッド(TR)-3.3 mg / mL</td><td>Invitrogen</td><td>T2767</td><td></td></tr>過<tr><td>酸化水素、30%溶液</td><td>シグマ</td><td>H-1009</td><td></td></tr><tr><td>浸漬油、粘度1.250 cSt(点灯)</td><td>シグマ</td><td>I0890</td><td></td></tr><tr><td>塩化ニッケル (NiCl2 . 6H2O)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>N5756</td><td></td></tr><tr><td>四酸化オスミウム、電子顕微鏡用、4%H2O&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>75632</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド、試薬グレード、結晶性&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>ピクリン酸、水で湿らせた、&ge;98%</td><td>シグマ</td><td>197378</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝液 1 M</td><td>シグマ</td><td>P3619</td><td></td></tr><tr><td>プロピレンオキシド (C3H6O), 99%</td><td>Alfa Aesar&nbsp;</td><td>30765</td><td></td></tr><tr><td>テトラヒドロホウ酸ナトリウム</td><td>VWR</td><td>27885.134</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>フィッシャー科学</td><td>S / 8600 / 53</td><td></td></tr><tr><td>トリズマ塩酸塩、&ge;99.0%</td><td>シグマ</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>トリズマベース、&ge;99.9%</td><td>シグマ</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>ベクタシールド退色防止実装媒体、屈折率1.45&nbsp;</td><td>ベクターラボ</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>ベクタステイン エリート ABC HRP キット</td><td>ベクターラボ</td><td>PK6100</td><td></td></tr><tr><td>使用機器&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ビブラートーム</td><td>寒天 Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C4A カップ入りアルミニウム プランシェット&nbsp;</td><td>GA-MAとアソシエイツ株式会社</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ライカDMR顕微鏡&nbsp;</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>X-Cite 120PC Q&nbsp; 蛍光光源&nbsp;</td><td>エクセリタス・テクノロジーズ&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ライカ DFC450 デジタルマイクロスコープカメラ&nbsp;</td><td>ライカマイクロシステムズ&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ラピドグラフ製図ペン0.18mm&nbsp;</td><td>ロンドングラフィック</td>センター0.18mm<td></td><td></td></tr><tr><td>ラピドグラフペン先ロンドン</td><td>グラフィックセンター</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ラピドグラフ製図ペン0.25mm&nbsp;</td><td>ロンドン・グラフィックス・センター</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.25 mm ラピドグラフ・ペン先</td><td>ロンドン・グラフィックス・センター</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCワークステーション、ステージ、カメラ、XYZステージ制御用ジョイスティックを含むニューロルーシーダ・システム</td><td>マイクロブリフィールド(MBF) バイオサイエンス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ニューロルーシーダ・ソフトウェア・バージョン2017</td><td>マイクロブリフィールド(MBF) バイオサイエンス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CorelDRAWグラフィックス・スイート X5</td><td>Corel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>動画編集ソフト&nbsp;</td><td>Adobe Premiere Pro</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ガラスバイアル 14 mL</td><td>フィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

biocytin 回復と塗りつぶされた海馬 ca 2 介在ニューロンの 3 d 再構成

Biocytin Recovery and 3D Reconstructions of Filled Hippocampal CA2 Interneurons

どのようにプロセスを皮質ネットワーク活動情報基礎と臨床の科学的な質問の数が多いに重要です。ここで説明したプロトコルでは、この回路の基本的なビルディング ブロックを識別します。皮質領域の詳細な研究は最終的に回路部品と他の科学者脳の取得を理解するために必要なプロセス、情報と何がうまくいかない病気、生理中に格納を提供します。形態学的データは広く情報処理を探るモデル ネットワークの構築で計算神経科学者によって使用されます。ここで説明したプロトコルについて説明しますどのように海馬の ca 2 領域に記録された biocytin で満たされた細胞の回復し、3 D で再構築します。さらに、プロトコルは、カルシウム結合蛋白質またはペプチッド記録された介在ニューロンでコンテンツのデモをについて説明します。

CA2 の海馬のニューロンは、次の電気生理学的記録 (数字 1Ac、広告および1Bc Bd) biocytin でいっぱいだった。スライスは、一晩録音に続く修正され、神経化学、神経細胞の形態的特性は、ここで説明したプロトコルに従う明らかにされました。
スライスまず一次抗体と、蛍光標識二次抗体の孵化によってカルシウム結合蛋白質または塗りつぶされた介在神経細胞のタンパク質含量を求めた。録音中に介在ニューロンの発火特性は、一次抗体の使用の選択によって決定されます。アビジン マルチカウンタオートマタが biocytin で満たされた介在を視覚化する使用され、抗マウスかに (FITC) とヤギ抗うさぎテキサス赤 (TR) が介在神経 (図 1 bb) を特徴付けるために使用されました。
次の蛍光可視化 biocytin (図 1 ab) を明らかにする HRP プロトコルが使用されました。Ca 2 介在神経の細かい詳細な解剖学にいた 3 d ニューロン再構築ソフトウェア (図 2および図 3 a) を使用して描画されます。Ca 2 の記録、バスケット細胞の 3次元再構成のビデオは、ビデオに表示されます。樹状突起と軸索の両方のアーバーは 450-500 μ m のスライスの深さに限られていた場合、神経再建が完了として考慮されました。貧しい軸索アーバーの染色は、軸索起始部と非常に近位枝に限られていた上部または汚損、またはスライスの下に開いているエンディングで切り捨てられた枝の存在によって評価されました。図 4は、良いと悪い HRP 染色次 biocytin 視覚化の例を表します。
分岐の複雑さ、相馬表面積と表面積および樹状突起と軸索のアーバーのボリュームを示す 3 D 再構成 (図 3) の形態計測学的解析が行えます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58592/58592fig1.jpg"> 図 1:バスケット細胞の 2 種類の神経の再建記録し海馬 ca 2 地域を埋め、細胞内の録音の後で得る電気生理学的データを相関生体外で。この図は、以前の研究23,24から変更されています。そんな地層オリエンス、SP 地層属三角骨、SR 地層結腸寄生虫、SLM 地層 Lacunosum Moleculare。(A) Aa: 図面管 (1000 倍) を使用して制限の樹状突起と軸索のアーバーと ca 2 バスケット細胞の再構築。樹状突起は黒で、軸索は赤で。Ab: ここで記述されているアビジン HRP プロトコル、次 biocytin いっぱいバスケット細胞のイメージ。Ac: 電圧応答に過分極と制限の樹状突起と軸索のアーバーと ca 2 バスケット細胞の電流注入を脱分極の代表的なトレース。Ad: アーバー バスケット細胞の接続を絞り込む ca 2 ピラミッドの例は、鋭い電極を使用して記録されます。複合興奮性シナプス後電位 (EPSP) 平均 3 つのスパイクの列車に応答中に見かけの簡単な鉄道うつ病を表示します。(B) Ba: 図面管 (1000 倍) を用いる広い樹状突起と軸索のアーバーと ca 2 バスケット細胞の 2D 復興。Ca 2 領域と水平になどと CA2 と CA3 領域の SP のすべてのレイヤーを放射状に拡張 (ブラック) でこのバスケット細胞の樹状ツリー。1 つの水平デンドライトまた CA1 領域に達した。(赤) で軸索は、地域 CA1、CA3 に拡張。Bb: biocytin いっぱい (マルチカウンタオートマタ染色) バスケット細胞だった PV 陽性 (FITC 染色) と CB, (テキサス赤染色)。紀元前: 電圧応答に過分極と広い樹状突起と軸索のアーバーと ca 2 バスケット細胞の電流注入を脱分極の代表的なトレース。Bd: 複合 EPSP 平均示す簡単な鉄道促進 3 つのスパイクの列車に応答中に。介在ニューロンの ca 2 に記録の他の種類の例としては、前研究25、30で見つけることが。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58592/58592fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58592/58592fig2.jpg"> 図 2:3 D の細胞体再構成します。(A) 細胞体の 3 D トレースします。細胞体を通して焦点を当ててしながら別の z 位置でトレース異なる輪郭の眺め。(B) 別の輪郭の 3 D ビュー。(C) 異なる角度で細胞体の 3 D ビュー。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58592/58592fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58592/58592fig3.jpg"> 図 3:3 D ニューロン再構築の形態学的解析。(A) ca 2 狭いアーバー バスケット細胞の 3次元再構成。各樹状突起分岐は色 (緑、青、赤、ピンク) で表され、軸索は、水色。(B) 樹枝状の枝の数と、相馬、相馬から 100 μ m 間隔で、同心の球内に含まれる各セグメントの長さを表すバスケット細胞のデンドロ。A. (C) (前研究23から適応) CA2 錐体細胞の形態計測学的解析事例の樹状突起のデンドロの色対応します。樹枝状の枝の数は、CA2 錐体細胞の細胞体からの距離に対してプロットしました。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58592/58592fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。 
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58592/58592fig4.jpg"> 図 4:(A) と貧しい良い (B) HRP 染色の例。(A) Biocytin 回復 ca 2 で非常によく満たされた介在を明らかにしました。細胞体 (CB) は暗く染色で、明確なアウトライン。樹状突起は、ビーズし、いくつかの棘 (赤い星で表される) を表示しました。(A) 軸索のアーバーは密と小さなボタンをプレゼントします。(B)、貧しい樹状突起と軸索の染色 2 CA2 錐体細胞の例です。CB の汚損がない明確な輪郭と薄いです。非常にいくつかの biocytin で満たされた枝の存在下で、その結果短期間の電気生理学的記録に、貧しい染色すること多くの場合関連付けられます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58592/58592fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。 
ビデオ 1:地層属三角骨、すべてのレイヤーおよび ca 2 地層属三角骨と隣接する地層オリエンスの軸索にまたがる樹状突起におけるそのソーマと制限の樹状アーバー (ca 2 狭いアーバー バスケット細胞とも呼ばれる) と ca 2 バスケット細胞の3 D 神経機能再建結腸寄生虫。非常にほとんどの枝は、近位の CA3 地層オリエンスと CA3 地層属三角骨に達しませんでした。このセルは、次の電気生理学的記録 biocytin に満ちていた、アビジン HRP ここで説明したプロトコルを次にセクションが処理されます。スライス、による樹状突起がそのままスライスの深さ内の軸索だけ回復されました。樹状突起は、濃いピンクと白の軸索です。レイヤーと領域の境界は、ビデオの先頭に追加されています。スベニア フォークでジョージア エコノミド 3 D ビデオによる三次元再構成。ビデオは、ステップ 2.17 で述べたようにニューロンの再構成ソフトウェアで記録され、ビデオ編集ソフトで編集します。ビデオへのリンク:30。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58592/Figure_3.mp4" target="_blank">このビデオをダウンロードするにはここをクリックしてください</a>。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>使用するソリューション</td>
			<td>組成/手順</td>
		</tr>
<tr>
<td>固定の解決</td>
			<td>4% パラホルムアルデヒド 0.2% 飽和ピクリン酸水溶液、0.025% グルタルアルデヒド溶液に 0.1 M のリン酸バッファー (PB)</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.1 M のリン酸バッファー pH 7.6</td>
			<td>900 mL の蒸留水に 1 M のリン酸バッファー在庫の 100 mL を追加します。</td>
		</tr>
<tr>
<td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) pH 7.4/7.5</td>
			<td>0.1 M リン酸バッファー、KCl と 990 mL の蒸留水に NaCl の 8.76 g 0.2 g の 10 mL を追加します。</td>
		</tr>
<tr>
<td>TRIS バッファー pH 7.5</td>
			<td>トリス塩酸と 50 mL の蒸留水でトリス基地 1.66 g 5.72 g を溶解します。蒸留水 1 L までを行います。</td>
		</tr>
<tr>
<td>バッファー, グルタルアルデヒドおよびパラホルムアルデヒド固定液</td>
			<td>4% パラホルムアルデヒド 0.2% 飽和ピクリン酸水溶液、0.025% グルタルアルデヒド溶液に 0.1 M リン酸緩衝。</td>
		</tr>
<tr>
<td>ABC ソリューション</td>
			<td>ABC キットから使用する前に、少なくとも 30 分を可能にするソリューションです。2.5 mL の PBS に溶液の 1 滴とソリューション B の 1 滴を追加します。</td>
		</tr>
<tr>
<td>Durcupan エポキシ樹脂</td>
			<td>20 ポットを作成する: コンポーネントは、コンポーネント B の 20 g、コンポーネント C の 0.6 g とコンポーネントの D-0.4 g 20 g</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>フィルター ペーパーの円プレートを覆うことによって流出からのバランスを保護します。慎重に上記の割合で tripour ビーカーに試薬の重量を量る。少なくとも 5 分の 2 つの木の棒を使用して積極的に攪拌によって徹底的にミックスします。混合物は均一な密度の濃い茶色になります。最大可能な限りできるだけ多くの空気の泡を削除する 10 分 ~ 50 ° C でオーブンにビーカーを置きます。注: 樹脂は、プラスチックの鉢に 5 mL 注射器を 10 分デカント以上のオーブンでビーカー樹脂を残して、それらを日付、使用の準備ができての-20 ° C のフリーザーで保存場合治すため開始されます。</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1: ソリューションの表。

ここで説明したプロトコルを記述する蛍光分析、biocytin 回復と海馬 ca 2 介在神経細胞内の電気生理学的記録in vitro での許可神経以下の質の高い復元特性と調査されるべき最終的に細かい神経解剖学。

Biocytin 回復と塗りつぶされた海馬 ca 2 介在ニューロンの 3 D 再構成

How cortical network activity processes information is of importance to a large number of basic and clinical scientific questions. The protocol described ...

この方法は、神経サブタイプを分類し、皮質回路の機能的な地図の理解を広げるのに役立ちます。このプロトコルは、ニューロンの超構造を維持し、樹状および軸索の両方の優れた回復を得るために最適化されており、高品質の再構築が可能です。電気生理学的記録の最後に、記録された細胞を含むスライスをACSFの小皿に移す。ヒュームフードで作業している間、細かい品質のフィルターペーパーの小片にスライスを転がし、スライスに湿らせたろ紙の別の部分を置きます。5~10ミリリットルの固定液を含む小さなプラスチック製の鍋に組織を入れ、一晩摂氏4度で保管します。翌日、固定溶液を含む容器から0.1モルリン酸緩衝液の2ミリリットルの容器に組織を移してすすぎ、メスの刃で余分な組織を切り取ります。ペトリ皿にスライスを入れて余分な組織を取り除き、メスの刃で余分な組織を切り取ります。トリミングしたティッシュをきれいなペトリ皿に移し、折り目や折り目のない平らであることを確認します。乾いたペイントブラシを使用して余分なバッファを取り除きます。組織を温かいゼラチン溶液で覆い、ペトリ皿を冷凍ブロックに置き、溶液を素早く冷却します。その後、ゼラチンを摂氏4度に設定した皿を30~60分間動かします。ヒュームフードでは、メスの刃を使用してゼラチン埋め込み組織を含む小さな1 X 1センチメートルブロックを切り取ります。小さなへらを使用してブロックを持ち上げ、慎重に新鮮な固定溶液に移します。摂氏4度で少なくとも30分間固定してください。この2回目の固定に続いて、ゼラチンブロックを5ミリリットルのPBで3回洗います。洗浄後、紙のティッシュを使ってブロックを乾かします。その後、スーパー接着剤を使用してビブラートトラックに、上部の組織と向きのブロックを貼り付けるために、シアノアクリル接着剤の少量を使用しています。ビブラートメを使用して50ミクロンの厚さのスライスを切り離し、各セクションを10%のスクロースを含むガラスバイアルに慎重に入れます。切開後、バイアルから慎重にセクションを取り出し、ペトリ皿の蓋に平らにします。その後、セクションの周りからゼラチンを削除するために新鮮なメスの刃を使用しています。PBで新鮮な10%のスクロースを2ミリリットル含むバイアルにセクションを入れ、10分間攪拌して凍結保護プロセスを開始します。凍結保護に続いて、ペンキブラシを使用してアルミニウム箔の小さな長方形の上に平らにセクションを置きます。セクションから余分な液体を取り除き、慎重に小包にホイルを折ります。アルミ箔を液体窒素の表面に近づけて、表面に触れることなく30秒間保持します。そして、セクションを約30秒間完全に解凍します。さらに2回、凍結解凍を繰り返します。塗料ブラシでホイルからすべてのセクションを取り除き、一定の攪拌の下で余分なショ糖を洗い流すためにPBの2ミリリットルを含むガラスバイアルに入れます。蛍光イメージング用の免疫染色後、スライドをPBSを含むガラスペトリ皿に入れ、カバースリップを慎重に取り外します。その後、パスツールピペットからPBSの穏やかなパルスを使用してスライドからセクションを洗い流します。セクションをPBSを含むきれいなガラスバイアルに入れます。アビジンHRP反応を、まずアビジンビオチン複合体またはABC中のセクションをインキュベートすることにより、HRP反応生成物を増幅するために少なくとも2時間実施する。次に、PBSで3回10分間洗浄し、トリスバッファーを2回10分間洗浄します。最後のトリスバッファー洗浄を取り除いた後、迅速にジアミノベンジジン溶液またはDAB溶液に8%の塩化ニッケル溶液の1滴を追加します。次に、溶液を混合し、セクション上にこの溶液の1ミリリットルを迅速に追加するために、溶液を入れおよび外にピペットします。この溶液中のセクションを15分間インキュベートします。次に、1%過酸化水素の10マイクロリットルをDAB溶液に加えます。細胞が標識されるまで、一定の撹拌下で暗闇の中で約1〜2分間反応を進行させます。ヒュームフードに、ペトリ皿にフィルターペーパーの小さな円を入れ、PBでそれを湿らします。ペイントブラシを使用してガラスバイアルからセクションを1つずつ持ち上げ、慎重に紙の上に平らに置きます。濾紙の別の湿った円でセクションをカバーし、表面にそっとティッシュペーパーを触ることによって余分な緩衝液を除去する。PBに1%のオスミウム四酸化を8、9滴塗布します。皿を覆い、少なくとも30分間煙のフードに保持しますが、1時間以下です。セクションのすすめ、取り付け、カバーが切れた後、アルコール溶液の50%、70%、95%、および100%の一連のアルコール溶液を脱水します。脱水工程に続き、100%エタノールを含むガラスバイアルに約5分間シェーカーに切片を移します。アルコール溶液をプロピレンオキシドに交換し、5分間3回洗浄します。最後の洗浄に続いて、バイアルに約2ミリリットルのプロピレンオキシドを入れ、樹脂を1:1の比率で添加します。樹脂が溶解していることを確認し、セクションを一定の撹拌下で30分間保ちます。30分後、木製スティックを使用してエポキシ樹脂を含むアルミニウムプランシェットに各セクションを配置し、一晩インキュベートします。翌日、約10分間、ホットプレートの上にプランシェットを置きます。その後、木製の棒で各セクションをピックアップし、きれいなスライドの上に置きます。すべてのセクションがスライドに移された後、分割顕微鏡の下でスライドを見て、スライスの向きを確認し、セクションの上にカバースリップを置きます。オーブンで56°Cで48時間硬化します。低倍率の目的を使用して、セル本体を含むホームセクションに焦点を当てます。次に、100x の目的を使用し、セル本体に焦点を当て、中央をクリックして参照点をマークします。目標を 100x で 3D でソーマをトレースするには、トレース タブからコンターを選択し、セル のボディ輪郭を選択します。ジョイスティックを使用して、セル本体の一番上にフォーカスを移動します。現在フォーカスしているパーツの周りをクリックしてポイントを配置します。右クリックして、この最初のアウトラインを終了するには、閉じる輪郭を選択します。セル本体の下部に到達するまで、異なる z 位置でこのプロセスを繰り返します。樹状樹状のアーバーを追跡するには、ニューロンメニューで樹状突起または有端樹状突起を選択します。まず、マウススクロールホイールを使用して各樹状突起の短い初期セグメントをトレースし、ペンドライトの直径に合わせてカーソルの直径を調整します。各樹状突起に沿ってトレースします。ツリー内のノードに到達したら、右クリックして、ドロップダウンメニューからノードの二股または三股ノードを選択します。完了したセクションと一致するセクション内の樹状突起間の一致する点を識別するには、[移動]タブをクリックしてマッチポイントを選択します。一致する必要があるポイントの数を選択し、[OK]を押します。完成した分岐の終了をクリックし、ブランチをクリックします。各マッチ ポイントに対してこの手順を繰り返します。各セクションのすべての樹状突起が追跡されたら、ここに示されている同じプロセスを使用して軸索をトレースすることは、描画管を使用して樹状および軸索の樹状突起を有するCA2バスケットセルの再構成である。樹状突起は黒で、軸索は赤です。これは、ここで説明するアビジンHRPプロトコルに従うビオシチン充填バスケット細胞の例画像である。ここに示されているのは、CA2バスケット細胞の3Dニューロン再構成のビデオです。デンドライトは濃いピンク色で、軸索は白です。最後に、この画像はCA2バスケットセルの樹型図を示しています。このプロトコルに習熟する時間が必要です。しかし、この最適化されたアプローチは、体外の複雑な皮質および海馬構造の高解像度画像を生成することができます。

biocytin-recovery-3d-reconstructions-filled-hippocampal-ca2

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

このビデオでは、ラットの海馬切片でビオシチンを充填した介在ニューロンを可視化するプロセスを示し、特異的抗体と蛍光顕微鏡を使用してその神経化学的同一性を強調しています。...

ラット海馬切片における介在ニューロンの免疫染色

このビデオは、ビオシチンで満たされた介在ニューロンを含む固定ラットの脳スライスを染色する手順を示しています。このプロトコールには、アビジン-ビオチン複合体(ABC)によるインキュベーション、HRPおよび発色基質による染色、四酸化オスミウムによる構造の保存、およびイメージングのための樹脂への組織包埋が含まれます。...

可視化のためのラット海馬スライスにおけるビオシチン充填介在ニューロンの標識

神経回路網の構造を理解するために、個々のニューロンの機能的および形態学的特徴付けが必要である。ここで、我々はまだ、細胞内で樹状および軸索建築の事後再構築のために、ニューロンを標識する能力を維持し、細胞外の構成で電気生理学的記録を可能にするjuxtasomalビオシチンラベルを示しています。...

Juxtasomalビオシチン標識は、個々の皮質ニューロンの構造機能相関を研究するために、

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